高效液相色譜課件

高效液相色譜highperformanceliquidchromatographHPLC2022/12/3高效液相色譜highperformanceliquid1內(nèi)容摘要概述特點工作流程主要部件主要分離類型及原理制備型液相色譜2022/12/3內(nèi)容摘要概述2022/12/22概述

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。2022/12/3概述高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年3特點高壓：150-350*105Pa高效：大于30000塔板/米高靈敏度：10-9g（紫外檢測）、10-11g（熒光檢測）高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。高效液相色譜采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備如下特點：2022/12/3特點高壓：150-350*105Pa高效液相色譜4工作流程2022/12/3工作流程2022/12/25主要部件高壓輸液泵壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。2022/12/3主要部件高壓輸液泵2022/12/26梯度淋洗（洗脫）裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2022/12/3梯度淋洗（洗脫）裝置外梯度:內(nèi)梯度:2022/17進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/12/3進樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，2022/18高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2022/12/3高效分離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～69液相色譜檢測器

a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。特點：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；

對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2022/12/3液相色譜檢測器a.紫外檢測器2022/12/210b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/12/3b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要11c.示差折光檢測器

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；2022/12/3c.示差折光檢測器除紫外檢測器之外應(yīng)用12d.熒光檢測器

高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；2022/12/3d.熒光檢測器高靈敏度、高選擇性；202213液-固吸附色譜液-液分配色譜離子交換色譜離子色譜離子對色譜排阻色譜親和色譜(AC)主要分離類型及基本原理2022/12/3液-固吸附色譜主要分離類型及基本原理2022/12/214液-固吸附色譜

固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2022/12/3液-固吸附色譜固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧15

液-液分配色譜

固定相與流動相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；

流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2022/12/3液-液分配色譜固定相與流動相均為液體（互16離子交換色譜

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。2022/12/3離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離17離子色譜

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一種技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。2022/12/3離子色譜離子色譜是在20世紀(jì)70年代18離子對色譜

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；

反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+

X-后；在兩相間分配。2022/12/3離子對色譜原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電19

排阻色譜

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2022/12/3排阻色譜固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)20親和色譜(AC)

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。2022/12/3親和色譜(AC)原理：利用生物大分子和固定相21HPLC的應(yīng)用HPLC適于分析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有機化合物；生物活性物質(zhì)和多種天然產(chǎn)物；合成的和天然的高分子化合物等。它們涉及石油化工產(chǎn)品、食品、合成藥物、生物化工產(chǎn)品及環(huán)境污染物等，約占全部有機化合物的80%。其余20%的有機化合物，包括永久性氣體，易揮發(fā)低沸點及中等分子量的化合物，只能用氣相色譜法進行分析。2022/12/3HPLC的應(yīng)用HPLC適于分析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易22

環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析

固定相：薄殼型硅膠(37～50m)流動相：正己烷流速：1.5mL/min色譜柱：50cm2.5mm(內(nèi)徑)檢測器：差示折光檢測器

可對水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進行分析。2022/12/3環(huán)境中有機氯農(nóng)藥殘留量分析可對水果、23稠環(huán)芳烴的分析

稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。

固定相：十八烷基硅烷化鍵合相流動相：20%甲醇-水～100%甲醇線性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱溫：50oC柱壓：70104Pa

檢測器：紫外檢測器2022/12/3稠環(huán)芳烴的分析稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。固定相：十24制備型液相色譜

制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進樣量大、采用制備柱；柱后配有餾分收集器。

2022/12/3制備型液相色譜制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析25制備液相色譜的應(yīng)用制備液相色譜技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于制藥、化工和生物工程等領(lǐng)域中樣品的分離和純化。典型的應(yīng)用如合成原料的純化，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備，最終產(chǎn)品的提純等方面。2022/12/3制備液相色譜的應(yīng)用制備液相色譜技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于制藥、化26高效液相色譜highperformanceliquidchromatographHPLC2022/12/3高效液相色譜highperformanceliquid27內(nèi)容摘要概述特點工作流程主要部件主要分離類型及原理制備型液相色譜2022/12/3內(nèi)容摘要概述2022/12/228概述

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。2022/12/3概述高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年29特點高壓：150-350*105Pa高效：大于30000塔板/米高靈敏度：10-9g（紫外檢測）、10-11g（熒光檢測）高沸點、熱不穩(wěn)定有機及生化試樣的高效分離分析方法。高效液相色譜采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備如下特點：2022/12/3特點高壓：150-350*105Pa高效液相色譜30工作流程2022/12/3工作流程2022/12/231主要部件高壓輸液泵壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一。具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。2022/12/3主要部件高壓輸液泵2022/12/232梯度淋洗（洗脫）裝置外梯度:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2022/12/3梯度淋洗（洗脫）裝置外梯度:內(nèi)梯度:2022/133進樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：2022/12/3進樣裝置流路中為高壓力工作狀態(tài)，2022/134高效分離柱

柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2022/12/3高效分離柱柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～635液相色譜檢測器

a.紫外檢測器應(yīng)用最廣，對大部分有機化合物有響應(yīng)。特點：

靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm×10mm，容積8μL）；

對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。

2022/12/3液相色譜檢測器a.紫外檢測器2022/12/236b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要進展；光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2022/12/3b.光電二極管陣列檢測器紫外檢測器的重要37c.示差折光檢測器

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；2022/12/3c.示差折光檢測器除紫外檢測器之外應(yīng)用38d.熒光檢測器

高靈敏度、高選擇性；對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；2022/12/3d.熒光檢測器高靈敏度、高選擇性；202239液-固吸附色譜液-液分配色譜離子交換色譜離子色譜離子對色譜排阻色譜親和色譜(AC)主要分離類型及基本原理2022/12/3液-固吸附色譜主要分離類型及基本原理2022/12/240液-固吸附色譜

固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；

流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸；適用于分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；

缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾；2022/12/3液-固吸附色譜固定相：固體吸附劑，如硅膠、氧41

液-液分配色譜

固定相與流動相均為液體（互不相溶）；

基本原理：組分在固定相和流動相上的分配；

流動相：對于親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性（正相normalphase），反之，流動相的極性大于固定液的極性（反相reversephase）。正相與反相的出峰順序相反；

固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用；

化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。2022/12/3液-液分配色譜固定相與流動相均為液體（互42離子交換色譜

固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂；

流動相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。2022/12/3離子交換色譜固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離43離子色譜

離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一種技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。2022/12/3離子色譜離子色譜是在20世紀(jì)70年代44離子對色譜

原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對離子或反離子）加到流動相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對化合物，使其能夠在兩相之間進行分配；

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；

反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進入流動相后，生成疏水性離子對Y+

X-后；在兩相間分配。2022/12/3離子對色譜原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電45

排阻色譜

固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分離。小分子可以擴散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；可對相對分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離2022/12/3排阻色譜固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)46親和色譜(AC)

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進行選擇性分離。先在載體表面鍵合上一種具有一般反應(yīng)性能的所謂間隔臂(環(huán)氧、聯(lián)胺等)，再連接上配基(酶、抗原等)，這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。2022/12/3親和色譜(AC)