分子生物學(xué)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用課件

分子生物學(xué)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用

湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗(yàn)科黃一偉分子診斷學(xué)分子診斷學(xué)是以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測(cè)、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。分子診斷學(xué)三個(gè)階段3個(gè)階段：（1）利用DNA分子雜交技術(shù)進(jìn)行遺傳病的基因診斷；（2）以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的DNA診斷，特別是定量PCR和實(shí)時(shí)PCR的應(yīng)用，不僅可以檢測(cè)存在于宿主的多種DNA和RNA病原體載量，還可檢測(cè)多基因遺傳病細(xì)胞中mRNA的表達(dá)量；（3）以生物芯片（biochip）技術(shù)為代表的高通量密集型檢測(cè)技術(shù)，生物芯片技術(shù)包括基因芯片，蛋白質(zhì)芯片，組織芯片等。熒光定量PCR標(biāo)記方法內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針

Taqman

MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer熒光共振能量傳遞（FRETProbe）RQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation雙標(biāo)記探針（TaqmanProbe）RQExcitationXRQQRExcitationEmission分子信標(biāo)（MolecularBeaconProbe）5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR引物特異性探針（AmplifluorProbe）基因和蛋白質(zhì)芯片原理基因芯片(genechip)也稱(chēng)為DNA微距陣(DNAmicroarray)、DNA芯片(DNAchip)等。它是指將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地高密度地排列固定于玻片、硅片等固相載體上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品的基因按堿基互補(bǔ)配對(duì)原理進(jìn)行雜交，通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，再經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲取大量的信息?；蛭㈥嚵屑夹g(shù)優(yōu)勢(shì)基因微陣列技術(shù)作為一種高通量的檢測(cè)新技術(shù),可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的生物分子，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各個(gè)方面，其中包括病原生物的監(jiān)控和診斷。發(fā)現(xiàn)未知病原體。例如確定SARS-CoV應(yīng)用了基因微陣列技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)外蛋白質(zhì)芯片或基因芯片產(chǎn)品的進(jìn)展情況

國(guó)外:賽弗吉生物系統(tǒng)公司（納斯達(dá)克代碼：CIPH）的蛋白質(zhì)芯片系統(tǒng)已經(jīng)通過(guò)了中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）的醫(yī)療設(shè)備審批。這也是廣譜儀器第一次在中國(guó)被批準(zhǔn)作為一種醫(yī)療設(shè)備使用。affymetrix公司開(kāi)發(fā)出測(cè)P53基因是否有突變以判斷患癌癥可能性的P53芯片，能診斷藥物代謝缺乏癥的細(xì)胞色素P450芯片.在病原體的檢測(cè)方面,成功的例子有HBV、丙型肝炎病毒HCV、甲型肝炎病毒（HAV）、庚型肝炎病毒（HGV）、巨細(xì)胞病毒（CMV）、梅毒、弓形蟲(chóng)、結(jié)核桿菌等多種病原體的診斷基因芯片.另外血液RD等25種紅細(xì)胞抗體系統(tǒng)以及高血壓病因,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）和人促黃體生成激素（hLH）等也都有了診斷基因芯片。在腫瘤方面,蛋白質(zhì)芯片已成功地應(yīng)用于診斷白血病、乳腺癌、心力衰竭等疾病的診斷,診斷用的抗體芯片有霍亂毒素、葡萄球菌內(nèi)毒素B、蓖麻蛋白和枯草桿菌球體的診斷.最近，siemens公司、fraunhofer硅工藝研究院和infineon公司正在開(kāi)發(fā)電化學(xué)生物芯片診斷系統(tǒng).國(guó)內(nèi):上海數(shù)康生物科技有限公司研制開(kāi)發(fā)的“多腫瘤標(biāo)志物蛋白質(zhì)芯片診斷系統(tǒng)”于2001年12月獲得國(guó)家衛(wèi)生行政部門(mén)頒發(fā)的新藥證書(shū)和試生產(chǎn)批文。本實(shí)驗(yàn)室采用該診斷系統(tǒng)對(duì)12種腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖原199(CA199)、糖原242(CA242)、糖原(CA125)、糖原153(CA153)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、前列腺特異抗原(PSA)、游離前列腺特異抗原(f-PSA)、鐵蛋白(FER)、β-人絨毛膜促性腺激素(β-HCG)，人生長(zhǎng)激素(HGH)含量進(jìn)行定量分析,測(cè)定9種腫瘤(如卵巢腫瘤,肝癌等).由上海裕隆生物科技有限公司及曲阜裕隆生物科技有限公司研發(fā)丙型肝炎病毒分片段抗體檢測(cè)試劑盒（蛋白芯片）能夠同時(shí)檢測(cè)血清或血漿中抗HCVCore、抗HCVNS3、抗HCVNS4、抗HCVNS5以及上述四種抗體的總抗體5項(xiàng)指標(biāo)，突破了傳統(tǒng)的丙型肝炎酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)試劑盒一次只能檢測(cè)初篩指標(biāo)抗HCV總的局限，而采血量?jī)H為ELISA法的1/5，具有丙型肝炎感染初篩和確診的雙重功能，并能反映丙型肝炎感染、治療和愈后狀況。此外，該試劑盒還具有檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、平行性好、成本低、操作簡(jiǎn)單快速、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。2004年6月24日獲國(guó)家食品藥品監(jiān)管局頒發(fā)的新藥證書(shū)。這標(biāo)志著我國(guó)生物芯片技術(shù)向臨床免疫檢測(cè)領(lǐng)域的又一次成功突破。瑞芯生物科技有限公司已成功開(kāi)發(fā)出乙型肝炎基因多態(tài)性檢測(cè)芯片、丙型肝炎基因分型檢測(cè)芯片、結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測(cè)芯片、地中海貧血癥檢測(cè)芯片等產(chǎn)品.等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)RCA(RollingCircleAmplification)LAMP(loop-mediatedisothermalamplification)NASBA((Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)未知病原體檢測(cè)新技術(shù)高通量測(cè)序DNA再（重）測(cè)序芯片多重PCR和質(zhì)譜聯(lián)用ILLUMINA買(mǎi)了SOLEXA;Solexa技術(shù):IlluminaGenomeAnalyzer測(cè)序儀基本原理：可逆性末端終結(jié)反應(yīng)四種堿基分別標(biāo)記四種不同熒光，每個(gè)堿基末端被保護(hù)基團(tuán)封閉，單次反應(yīng)只能加入一個(gè)堿基，經(jīng)過(guò)掃描，讀取該次反應(yīng)顏色后，該保護(hù)基團(tuán)被除去，下一個(gè)反應(yīng)可繼續(xù)進(jìn)行，如此反復(fù)，得出堿基的精確序列17～35bp的序列1GBABI買(mǎi)了AGENCOURTSolid系統(tǒng)寡核苷酸連接和檢測(cè)原理60bp4GB再測(cè)序芯片技術(shù)用于分子診斷舉例：1）勞倫斯伯克利國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和防御科學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室利用AFFY基因芯片技術(shù)在9個(gè)小時(shí)內(nèi)一次鑒定3200種(微)生物.可以快速分類(lèi)和定量分析環(huán)境樣品中的原核和真核(微)生物.2）美國(guó)CDC在利用AFFYMETRIX公司開(kāi)發(fā)的天花病毒再測(cè)序芯片來(lái)鑒定和分類(lèi)數(shù)以百計(jì)的天花病毒株系。通過(guò)對(duì)更多的分離物測(cè)序，科學(xué)家可以更容易地把病原體亞型和患者結(jié)果關(guān)連起來(lái)，并了解哪個(gè)亞型是毒力最強(qiáng)的等問(wèn)題。3）Affymetrix和英國(guó)HealthProtectionAgency(HPA)共同開(kāi)發(fā)了區(qū)分腦膜炎球菌不同株系的再測(cè)序芯片，芯片上代表了不同亞型腦膜炎球菌的基因組序列，可以成功分類(lèi)以往方法可以分類(lèi)的45個(gè)樣品，及把以往方法不能分類(lèi)的12個(gè)樣品劃分到現(xiàn)有的腦膜炎球菌種類(lèi)里，分析時(shí)間僅需要一天。4