酵母菌的形態(tài)觀察大小測定和直接計(jì)數(shù)

關(guān)于酵母菌的形態(tài)觀察大小測定和直接計(jì)數(shù)第1頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六

目的要求：

1、觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌

死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。

2、學(xué)習(xí)并掌握用測微尺測定微生物大小的方法。

3、掌握使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。第2頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六1、基本原理：酵母菌是不運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核微生物，大多數(shù)酵母菌以出芽方式進(jìn)行無性繁殖，有性繁殖通過接合產(chǎn)生子囊孢子。美藍(lán)是一種無毒性的染料。它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。用美藍(lán)對酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型。因此酵母活細(xì)胞是無色的，而死細(xì)胞或衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色，以此進(jìn)行鑒別。一、.酵母菌的形態(tài)觀察及死活細(xì)胞的鑒別第3頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六美藍(lán)浸片的觀察：（1）在載玻片中央加一滴0.05%呂氏堿性美藍(lán)染色液，用滴管取1滴酵母菌菌液于染液中，混合均勻。（2）加蓋玻片。注：不要產(chǎn)生氣泡。（3）將制片放置約3min后鏡檢，先用低倍鏡然后用高倍鏡觀察酵母菌的形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色區(qū)別死、活細(xì)胞。2、操作技術(shù)第4頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六（4）染色約0.5h后再次進(jìn)行觀察，注意死細(xì)胞數(shù)量是否增加。（5）繪圖說明你所觀察到的酵母菌的形態(tài)特征，并計(jì)算0.5h后酵母菌的死亡率。

第5頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六酵母菌第6頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六1、基本原理

微生物細(xì)胞的大小是微生物基本的形態(tài)特征，也是分類鑒定的依據(jù)之一。微生物大小的測定需借助測微尺---目鏡測微尺和鏡臺測微尺。二.微生物大小的測定第7頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六第8頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六第9頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六

鏡臺測微尺：

是中央部分刻有精確等分線的載玻片，一般將1mm等分為100小格，每格長0.01mm。用于校正目鏡測微尺每格的相對長度。

目鏡測微尺：

是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，測量時(shí)，需要將其放在接目鏡中的隔板上，用以測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。

第10頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六

由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測微尺每小格代表的實(shí)際長度也不一樣。因此，用目鏡測微尺測量微生物大小時(shí)，必須先用鏡臺測微尺進(jìn)行校正，以求出該顯微鏡在一定放大倍數(shù)的目鏡和物鏡下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度，然后根據(jù)微生物細(xì)胞相當(dāng)于目鏡測微尺的格數(shù)，計(jì)算出細(xì)胞的實(shí)際大小。球菌用直徑來表示其大??；桿菌則用寬和長的范圍來表示。第11頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六（1）裝目鏡測微尺(換目鏡)把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內(nèi)的格板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。（2）校正目鏡測微尺：1）放鏡臺測微尺：將鏡臺測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上。2.操作技術(shù)第12頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六2）校正：先用低倍鏡觀察，將鏡臺測微尺有刻度的部分移至視野中央，調(diào)節(jié)焦距，當(dāng)清晰地看到鏡臺測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。利用移動(dòng)器移動(dòng)鏡臺測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后數(shù)出兩重合線之間鏡臺測微尺和目鏡測微尺所占的格數(shù)。用同樣的方法換成高倍鏡進(jìn)行校正，測出在高倍鏡下，兩重合線之間兩尺所占的格數(shù)。第13頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六3）計(jì)算：目鏡測微尺每格長度（um）=兩重合線間鏡臺測微尺格數(shù)x10/兩重合線間目鏡測微尺格數(shù)（3）菌體大小測定：目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺測微尺，換上酵母菌染色制片。先在低倍鏡下找到標(biāo)本，換高倍鏡測定酵母菌的寬度和長度。測定時(shí)，通過轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡測微尺和移動(dòng)載玻片，測出酵母菌的直徑或?qū)捄烷L所占目鏡測微尺的格數(shù)。最后將所測得的格數(shù)乘以目鏡測微尺（在高倍鏡下）每格所代表的長度，即為該菌的實(shí)際大小。（4）測定完畢：取出目鏡測微尺后，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺測微尺分別用擦鏡紙擦試干凈，放回盒內(nèi)保存。第14頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六1、基本原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計(jì)菌器），于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的一種簡便、快速、直觀的方法。目前國內(nèi)外常用的計(jì)菌器有：血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、Peteroff-Hauser計(jì)菌器等，它們都可用于酵母、細(xì)菌、霉菌孢子等懸液的計(jì)數(shù)，基本原理相同。二、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法第15頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)是一種常用的微生物計(jì)數(shù)方法。該計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上有四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺；中間較寬的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。第16頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六計(jì)數(shù)室規(guī)格：

25（中格）×16（小格）

16（中格）×25（小格）每種規(guī)格計(jì)數(shù)室中的小方格都是400個(gè)。計(jì)數(shù)室大?。?/p>

每一個(gè)大方格邊長為1mm，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與載玻片之間的高度0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。第17頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六第18頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六25X1616X25第19頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六（1）菌懸液制備以無菌生理鹽水將釀酒酵母制成濃度適當(dāng)?shù)木鷳乙?。?）鏡檢計(jì)數(shù)室在加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。（3）加樣品將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將要搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液。取樣時(shí)先要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生。2、操作步驟第20頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六（4）顯微鏡計(jì)數(shù)加樣后靜止5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，否則視野中不易看清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。第21頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六由此處注入第22頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六每一中方格的周圍皆有三條邊線，計(jì)算單一中方格的細(xì)胞數(shù)時(shí)，位于邊線上的細(xì)胞計(jì)算方式為：以第二條邊線(簡稱中線)為界，接觸到左側(cè)中線與上端中線的細(xì)胞要算，接觸到右側(cè)與下端中線的細(xì)胞則不列入計(jì)算。如上圖，若每一個(gè)圓圈皆代表活細(xì)胞，空心的要算，而實(shí)心的不算。

第23頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期六菌液濃度要適當(dāng)，一般樣品稀釋度要求每小格約有5~10個(gè)菌體為宜。每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格（可選4個(gè)角和中央的一個(gè)中格）中的菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來計(jì)算樣品的含菌量。第24頁，共26頁，2022年，5月20日，11點(diǎn)4分，星期