酶免檢測技術(shù)原理及影響

關(guān)于酶免檢測技術(shù)原理及影響第1頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六3月18日免疫室差錯問題分析及整改措施3月18日免疫室出現(xiàn)了標(biāo)本漏檢問題，導(dǎo)致病人情緒不滿，甚至大吵大鬧，給科室形象造成了一定的影響。暴露出了免疫室一些問題，如嚴(yán)格按檢測流程執(zhí)行力度問題，認(rèn)真細(xì)心問題等，同時也違背了免疫室規(guī)定的檢驗報告結(jié)果時效性原則和以病人為中心的服務(wù)宗旨。針對上述事件，經(jīng)免疫室人員討論、分析，制定出以下整改措施：1、端正態(tài)度、要認(rèn)真、負(fù)責(zé)2、嚴(yán)格執(zhí)行免疫室檢驗流程，仔細(xì)核對標(biāo)本，不同批次檢測標(biāo)本標(biāo)記清楚3、增加人員緩解緊張工作狀態(tài)4、歡迎大家給出寶貴建議5、堅持免疫室兩個原則第2頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六免疫室簡介檢驗項目普免術(shù)前四項（普免）術(shù)前四項（急篩復(fù)查）體檢AFPCEA體檢HAV(IgM)HEV(IgM、IgG)HBcAbTAP化學(xué)發(fā)光腫瘤性激素HCG貧血三項胰島素C-肽自身免疫自免肝四項ENA譜抗核抗體抗線粒體抗體血管炎過敏原呼吸道HIV初篩實驗室迎檢任務(wù)前景展望檢測方面：免疫球蛋白、補體、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、免疫移植等，技術(shù)方面：電泳技術(shù)、細(xì)胞技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞技等教學(xué)方面：華信臨床檢驗技術(shù)專業(yè)第3頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六免疫室簡介

工作人員姓名職稱職務(wù)職責(zé)狀態(tài)孫文鮮主管檢驗技師常規(guī)免疫免疫室組長固定人員劉麗娜主管檢驗技師發(fā)光免疫免疫室質(zhì)控管理員固定人員史可檢驗師自身免疫免疫室生物安全及感染控制管理員固定人員馮凡檢驗員常規(guī)免疫免疫室儀器維護(hù)及信息管理員固定人員夜班人員科室骨干科室骨干科室骨干暫時固定堅持兩個原則：1、堅持檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、及時性、有效性2、堅持以病人為中心，全心全心全意服務(wù)病人第4頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六免疫室簡介免疫室日常工作量（3月23日為例）項目標(biāo)本量（人份）項目包括內(nèi)容備注普篩88門診、病房普篩，乙肝五項（酶免法）急篩復(fù)查47所有急篩（酶免法）發(fā)光51腫瘤、性激素、貧血三項、胰島素、C-肽、HCG體檢37AFP、CEA、乙肝五項、丙肝、普篩自免3自身免疫、呼吸道、過敏原、雜項9TB、HP、TAP、HPV、HAV、HEV、HBcAb-IgM總計234第5頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六免疫室簡介免疫室特殊項目檢測成本項目成本（％）項目成本（％）項目成本（％）項目成本（％）備注AFP66.29FSH66.29Ferr52.51呼吸道63.98CEA66.29LH66.29Foll89.97過敏原69.63CA15374.76P66.29B1290.05抗核抗體66.60CA19985.59T66.29胰島素67.94抗ds-DNA158.20CA12585.59PRL66.29C-肽62.20抗平滑肌抗體69.69FPSA85.59E266.29自免肝55.02ENA譜57.50TPSA85.59HCG66.29血管炎61.70抗線粒體抗體待定注：此統(tǒng)計結(jié)果可信度為95％第6頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六一、抗原抗體反應(yīng)二、酶免疫技術(shù)的分類、原理及特點三、酶聯(lián)免疫吸附試驗四、ELISA法檢測注意事項五、ELISA法檢測常見問題及解決方法第7頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六一、抗原抗體反應(yīng)第8頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六抗原抗體反應(yīng)原理抗原抗體結(jié)合反應(yīng)是抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)上具有互補性，使抗原表位嵌入抗體超變區(qū)的槽溝，發(fā)生特異性結(jié)合，其關(guān)系如鑰匙和鎖。有四種分子間作用力參與并促使抗原、抗體的結(jié)合。第9頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六抗原抗體反應(yīng)原理氫鍵結(jié)合力范德華引力靜電引力疏水作用力抗原抗體結(jié)合力第10頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六抗原抗體反應(yīng)特點及影響因素抗原抗體反應(yīng)特點：1、特異性2、比例性

3、可逆性抗原抗體反應(yīng)影響因素：1、反應(yīng)物自身因素：抗原抗體2、反應(yīng)環(huán)境條件：電解質(zhì)酸堿度溫度抗原抗體反應(yīng)影響因素：1、反應(yīng)物自身因素：抗原理化性狀、表位種類、數(shù)目抗體來源、特異性、親和性、效價2、反應(yīng)環(huán)境條件：電解質(zhì)8·5g/LNaCl溶液

酸堿度pH6--9為宜溫度最適溫度為37℃第11頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六二、酶免疫技術(shù)的分類、特點及原理第12頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六1、酶免技術(shù)的分類.酶免疫技術(shù)酶免疫組化組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位

酶免疫測定液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量均相

異相固相酶免疫測定液相酶免疫測定1、酶放大免疫測定技術(shù)EMIT2、克隆酶供體免疫分析CEDIA分離結(jié)合、游離酶標(biāo)記物，底物測定檢測微量短肽激素、小分子抗原最廣泛，酶聯(lián)免疫吸附試驗小分子激素、半抗原測定第13頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六

酶免技術(shù)的分類2、酶免技術(shù)特點抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性主要試劑:

酶標(biāo)記的抗體或抗原酶標(biāo)物特點：

免疫學(xué)活性酶對底物的催化活性第14頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六3、酶免技術(shù)原理及特點原理：酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測定分析特點：靈敏度高、特異性強、準(zhǔn)確性好酶標(biāo)記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。第15頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六二、酶聯(lián)免疫吸附試驗第16頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六1、基本原理.原理包被12反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體3洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離4底物顯色定性或定量的分析三個必要試劑

固相的抗原或抗體

酶標(biāo)記物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)的底物

第17頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六.雙抗體夾心法（測抗原）方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標(biāo)抗體，加底物顯色應(yīng)用：二價或二價以上的較大分子抗原測定

HBsAg、HBeAg、甲胎蛋白、HCG等.2、方法類型及反應(yīng)原理第18頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六方法類型及反應(yīng)原理雙位點一步法（測抗原）方法：用單克隆抗體做成固相抗體和酶標(biāo)抗體，待測抗原酶標(biāo)抗原同時加入，加底物顯色應(yīng)用：與雙抗體夾心法相似，提高了特異性、靈敏度，需注意“鉤狀效應(yīng)”第19頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六競爭法（測抗原）

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)抗原，酶標(biāo)抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）方法類型及反應(yīng)原理第20頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六.雙抗原夾心法（測抗體）原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體方法類型及反應(yīng)原理第21頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六方法類型及反應(yīng)原理間接法（測抗體）方法用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標(biāo)的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定第22頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六方法類型及反應(yīng)原理競爭法（測抗體）原理：類似檢測抗原的競爭法應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測第23頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六方法類型及反應(yīng)原理捕獲法（測抗體）

應(yīng)用：病原體急性感染診斷中的IgM型抗體甲型肝炎HAV-IgM抗體乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體第24頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六四、ELISA法檢測注意事項第25頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六1、標(biāo)本避免溶血、高脂血、纖維蛋白凝塊盡量新鮮，避免細(xì)菌污染一般5天內(nèi)檢測的血清可4℃保存，否則低溫保存。

第26頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六

2、試劑.試劑盒保存于2-8℃.使用前應(yīng)先將檢測試劑盒放置室溫平衡15-30分鐘，保證酶等液體的初始反應(yīng)溫度及活性劑的溶解。.觀察外包裝和內(nèi)組份有無漏液。第27頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六

3、加樣

A.加樣不可太快；B.要避免加在孔壁上部；C.不可濺出；D.避免產(chǎn)生氣泡；E.盡可能使用同一加樣器，裝緊槍頭，加樣后充分混勻。加樣器定期校準(zhǔn)！第28頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六溫育溫度的選擇足夠的反應(yīng)時間“邊緣效應(yīng)”的排除4、溫育第29頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六5、洗板

按說明書洗板次數(shù)防止洗板機堵孔有適當(dāng)?shù)那峙輹r間每孔加入洗液>350ul

不溢孔，殘留<5ul洗板后拍干，封板紙

不能重復(fù)使用

第30頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六

6、顯色檢查底物溶液的有效性；試劑顯色時先加A液，后加B液，二者不要顛倒。前后加入的間隔時間不超過10分鐘，不漏加。A、B液應(yīng)避免接觸污染物。不同廠家、批次酶顯色液不得混用第31頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六

7、終止和讀數(shù)肉眼判斷不準(zhǔn)確，影響結(jié)果酶標(biāo)儀的波長選擇的問題。加完終止液后30分鐘內(nèi)讀取數(shù)據(jù)。保證酶標(biāo)板的底部是清潔干燥的。酶標(biāo)儀臨界值計算公式的設(shè)定第32頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六8、結(jié)果判讀

項目CUTOFF陽性判斷HIV（科華）0.1×MIN（PCx，2.5)>cutHIV（麗珠）0.15+MAX(NCx,0.08)>cut灰區(qū)又稱灰色帶反應(yīng)。就是把OD值在Cutoff值正負(fù)20%這個范圍內(nèi)的標(biāo)本稱為灰區(qū)標(biāo)本。這個范圍稱為灰區(qū)。.灰區(qū)是客觀存在的，沒有不存在灰區(qū)的試劑，我們只是盡量減少灰區(qū)的出現(xiàn)比例。.減少灰區(qū)最有效的方法就是盡量將板洗滌干凈。不同試劑盒，CUTOFF值計算方法不同例：第33頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六五、ELISA法檢測常見問題及解決方法第34頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六ELISA實驗常見問題及解決方法類風(fēng)濕因子：一般為IgM型，可與變性IgGFc段非特異結(jié)合，因此可能與包被的IgG以及隨后加入的酶標(biāo)IgG結(jié)合而產(chǎn)生假陽性。補體：包被抗體及隨后加入的酶標(biāo)抗體均能激活補體而與補體C1q位點結(jié)合而產(chǎn)生假陽性，也可降低檢測物與固相結(jié)合而引起假陰性或測值偏低異嗜性抗體：人血清中含有抗齒類動物（羊、鼠等）Ig的抗體，即天然異嗜性抗體。與酶標(biāo)二抗出現(xiàn)假陽性。溶菌酶：可與等電點5的低等電點蛋白強結(jié)合，雙抗體夾心法ELISA可假陽性。溶血：Hb中的血紅素集團有類似過氧化物的活性，溫育時吸附固相可與HRP顯色。細(xì)菌污染：細(xì)菌分泌的一些酶可對抗原抗體蛋白分解或直接影響酶標(biāo)抗體作用，并且細(xì)菌引起標(biāo)本混濁。標(biāo)本4℃存放過久：IgG聚合成二聚體，間接法中易假陽性。建議<1周標(biāo)本凝固不全：殘留纖維蛋白原形成的纖維蛋白塊，造成假陽性。內(nèi)源性標(biāo)本因素：外源性標(biāo)本因素：第35頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6分，星期六現(xiàn)象可能原因解決方法顯色淡靈敏度低1、試劑盒未平衡至室溫實驗前試劑盒置于室溫平衡30分鐘以上2、水浴箱溫度不到37℃調(diào)整水浴箱溫度至37℃孵育期間不宜多開門3、孵育時間不夠校準(zhǔn)定時鐘、準(zhǔn)確定時4、樣品加樣量偏少校準(zhǔn)吸液器吸嘴與移液器接合緊密吸嘴一次性使用5、酶結(jié)合物加樣量偏少瓶身應(yīng)垂直滴加，保證液滴最大6、底物作用時間不夠延長至標(biāo)準(zhǔn)時間7、樣品用疊氮鈉防腐，抑制了酶活性與酶一同加入的樣品中不能用NaN3防腐8、蒸餾水被污染換用合格蒸餾水或去離子水9、洗滌液配置不當(dāng)，稀釋倍數(shù)>1:20準(zhǔn)確配置洗滌液10、試劑盒運輸時間太長，受高溫影響夏天長途運輸時，縮短時間，低溫措施11、試劑盒失效不適用失效試劑第36頁，共39頁，2022年，5月20日，11點6