實驗十三、放線菌素D誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察課件

實驗十三、細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)及觀察2002年10月7日，瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院諾貝爾獎評審委員會將2002年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎授予了悉尼·布雷內(nèi)、羅伯特·霍維茨和約翰·蘇爾斯頓三位科學(xué)家，以表彰他們在“細(xì)胞程序性死亡”這一領(lǐng)域中的開創(chuàng)性工作。他們不但發(fā)現(xiàn)在生物的器官發(fā)育過程中存在細(xì)胞程序性死亡，而且闡明了細(xì)胞程序性死亡過程中的基因規(guī)律。一、細(xì)胞死亡（celldeath）定義：細(xì)胞生命現(xiàn)象不可逆的停止，分為兩種形式，即壞死性死亡和程序性死亡。1.壞死性死亡（necrosis）定義：細(xì)胞外部的化學(xué)、物理或者生物的因素的侵襲而造成的細(xì)胞崩潰和裂解，是被動的死亡。3.細(xì)胞壞死和程序性死亡的區(qū)別細(xì)胞壞死細(xì)胞程序性死亡原因物理、化學(xué)因子的損害，缺氧、營養(yǎng)不良等基因控制過程質(zhì)膜通透性增高，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器變形、腫大，早期核無明顯變化，最后破裂細(xì)胞收縮，割裂成膜性小泡后被吞噬結(jié)果細(xì)胞裂解釋放出內(nèi)含物，常常引起炎癥反應(yīng)不釋放內(nèi)含物，不引起炎癥細(xì)胞的兩種死亡方式及比較4.程序性細(xì)胞死亡的特征形態(tài)特征：細(xì)胞變圓、胞質(zhì)皺縮，細(xì)胞體積減小，染色質(zhì)凝聚，核碎裂成為染色質(zhì)塊（核碎片）。整個細(xì)胞通過發(fā)芽、起泡等方式產(chǎn)生一些球形突起，并在基部脫落形成大小不等的、內(nèi)含胞質(zhì)、細(xì)胞器和核碎片的凋亡小體（apoptoticbody）。最后凋亡小體被周圍的細(xì)胞或者單核細(xì)胞吞噬。生化特征：內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶基因的活化和表達，導(dǎo)致凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)DNA的有控裂解，得到的DNA片段的長度為200bp的倍數(shù)。2.程序性細(xì)胞死亡在形態(tài)建成中起到重要作用（如手指和腳趾的發(fā)育），或者對于不再需要的構(gòu)造加以消除（如蝌蚪尾巴的消除）。實驗五、細(xì)胞凋亡的觀察原理：HeLa細(xì)胞經(jīng)放線菌素D誘導(dǎo)后，可以產(chǎn)生不同程度的細(xì)胞凋亡，利用熒光染色，可以觀察到典型的凋亡核（核碎片）。凋亡核呈顆粒團狀分布，顏色較正常細(xì)胞致密且濃染。材料及設(shè)備：HeLa貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、250mg/ml放線菌素D（ActinomycinD）、吖啶橙熒光染料、卡諾氏固定液、0.9%生理鹽水、10%甘油熒光顯微鏡、蓋玻片、載玻片、鑷子、一次性吸管、離心機、EP管、培養(yǎng)皿、小燒杯等。實驗步驟1.誘導(dǎo)：向處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞中加入250mg/ml的放線菌素D溶液10~15μl（終濃度0.5~0.75ug/ml），繼續(xù)培養(yǎng)18h左右；2.細(xì)胞收集和洗滌：將細(xì)胞懸液平均轉(zhuǎn)移到4個1.5毫升的EP管中，用1ml生理鹽水清洗細(xì)胞,去掉生理鹽水,將瓶壁上剩余細(xì)胞用1ml0.25%的胰酶消化3min后，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)皿,吹打生長面,平均合并至4個EP管中。以2000rpm離心6-8min，去上清；3.細(xì)胞預(yù)固定和固定：

加入0.9毫升生理鹽水，懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞分散，加入0.1毫升卡諾氏固定液，混勻；離心，去上清（保留0.1毫升生理鹽水）；

加入固定液至1毫升，小心懸浮細(xì)胞，室溫下固定處理10min，離心，去上清，加入0.1毫升固定液，小心充分混勻細(xì)胞；4.制片（空氣干燥法）