青霉素?；傅姆蛛x純化

關(guān)于青霉素酰化酶的分離純化第1頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六青霉素青霉素是常見抗生素之一。來源于點(diǎn)青霉、產(chǎn)黃青霉等真菌。對(duì)革蘭氏陽性菌的生長(zhǎng)有抑制作用青霉素第2頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六青霉素的分類第3頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六青霉素的代謝途徑α-氨基己二酸半胱氨酸纈氨酸α-氨基己二酰半胱氨酰纈氨酸異青霉素N青霉素ACVSIPNSAT第4頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六AT是一系列不同的酶。不同的AT催化不同的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)生成不同的青霉素添加苯乙酸相應(yīng)的AT催化它與異青霉素N反應(yīng)生成青霉素G添加苯氧乙酸時(shí)，相應(yīng)的AT催化它與異青霉素N反應(yīng)生成青霉素V第5頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六青霉素?；?950年，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉和米曲霉的菌絲可以分解青霉素得苯乙酸和另一種有機(jī)物（后被證實(shí)為6-APA）經(jīng)研究，這一反應(yīng)由青霉素?；复呋私z狀真菌外，一些細(xì)菌和酵母中也檢測(cè)到青霉素?；傅幕钚缘?頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六青霉素?；傅慕Y(jié)構(gòu)青霉素?；傅慕Y(jié)構(gòu)差異較大。大腸桿菌（Escherichiacoli）青霉素G?；赣幸粋€(gè)α亞基和一個(gè)β亞基球形芽胞桿菌（Bacillussphaericus）的青霉素酰化酶是一個(gè)四聚體第7頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六第8頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六第9頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六催化的反應(yīng)青霉素?；窻COOH+青霉素6-APA第10頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六分類按照底物的不同，可以將青霉素酰化酶分為青霉素G?；浮⑶嗝顾豓?；负桶逼S西林酰化酶第11頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六應(yīng)用制備β-內(nèi)酰胺類抗生素中間體（6-APA）半合成新的β-內(nèi)酰胺抗生素手性藥物基團(tuán)保護(hù)第12頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六當(dāng)前青霉素酰化酶的一些研究方向蛋白質(zhì)工程固定化分離純化第13頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六傳統(tǒng)的分離純化方法硫酸銨沉降葡聚糖凝膠色譜離子交換色譜電泳第14頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六據(jù)我們組閱讀的文獻(xiàn)，傳統(tǒng)方法分離青霉素?；傅幕厥章蚀蟛糠衷?0%至50%有必要開發(fā)新型提純工藝第15頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六新型分離純化方法一、色譜法1.擴(kuò)張床吸附色譜2.整體柱色譜3.疏水性電荷誘導(dǎo)色譜4.一步離子交換色譜完成分離純化第16頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六二、固定化金屬親和膜分離法三、其它方法1.雙水相萃取2.高通量篩選輔助設(shè)計(jì)分離純化工藝第17頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六新方法提純青霉素?；傅幕厥章士蛇_(dá)到90%第18頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六讓我們一起分享這些奇妙的分離純化方法第19頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六膜分離膜分離技術(shù)是指在分子水平上不同粒徑分子的混合物在通過半透膜時(shí)，實(shí)現(xiàn)選擇性分離的技術(shù)第20頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六傳統(tǒng)的膜分離包括：微濾膜（MF）、超濾膜（UF）、納濾膜（NF）、反滲透膜（RO）等第21頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六親和膜分離親和膜（affinitymembrane）：利用親和配基（染料、烷基、金屬離子等）修飾的濾膜。親和膜分離原理：是以親和膜為親和吸附介質(zhì)純化目標(biāo)產(chǎn)物的分離方法，是親和色譜的變型，又稱膜親和色譜第22頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六親和膜的優(yōu)勢(shì)具備膜分離和親和色譜雙重功能，提高了分離純化能力可以支持高流速操作，解決了色譜太耗時(shí)間的缺點(diǎn)易于放大第23頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六親和膜的制備方法一般方法膜材料→成膜→活化→配基偶聯(lián)，膜材料→活化→配基偶聯(lián)→成膜，第24頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六分離過程親和吸附→洗脫→親和膜再生

第25頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六固定化金屬親和膜用固定于膜上的金屬離子（如Cu2+）為配基的親和膜即固定化金屬親和膜。如果金屬離子為Cu2+

，那么該膜稱為固定化Cu2+親和膜固定化金屬親和膜可以用于許多物質(zhì)的分離。青霉素酰化酶是其中之一。目前研究較多的是以Cu2+為配基的親和膜。第26頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六固定化Cu2+親和膜的分離原理具有選擇透過性的膜可截留大分子，都過小分子固定于膜上的Cu2+可以通過和青霉素酰化酶表面的組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等帶負(fù)電荷殘基的相互作用使其被吸附于膜上，再通過解析獲得被提純的青霉素酰化酶第27頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六固定化Cu2+親和膜的制備Yi-MiaoKe等人以亞氨基二乙酸（IDA）為螯合劑，Cu2+為被螯合的離子制成親和膜。制備工藝第28頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六結(jié)果1.對(duì)Cu2+的螯合量增加至75.5±0.25μmol/disc2.提純后酶活增加至1.8U/disc第29頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六膜表面共價(jià)結(jié)合的物質(zhì)對(duì)膜效能的影響膜表面與膜共價(jià)結(jié)合的材料對(duì)分離效能也有影響Yung-ChuanLiu等研究了間隔臂（）的數(shù)量對(duì)膜效能的影響，即n值對(duì)膜效能的影響第30頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六第31頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六結(jié)果表明，用1,8-diaminooctane做間隔臂，即n=8時(shí)，青霉素酰化酶純化的比活度提高2.73倍，回收率為70.27%第32頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六青霉素?；阜蛛x過程Yung-ChuanLiu等研究發(fā)現(xiàn)，最佳上樣條件為：4℃,pH=8.5，0.5MNaCl,每單位區(qū)域上含32.04μmolCu2+最佳的洗脫條件為：pH=6.8，1MNH4Cl,0.5MNaCl。第33頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六PGA原液100ml1.2ml/min72mlwashingbuffer63mlelutionbuffer不能被吸附的蛋白質(zhì)被吸附蛋白質(zhì)被吸附蛋白質(zhì)；不能被吸附的蛋白質(zhì)；Cu2+；配位鍵第34頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六結(jié)果第35頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六該操作工藝使青霉素?；讣兓谋然疃忍岣吡?.11倍該操作工藝的回收率為90.25%第36頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六雙功能膜純化和固定PGAChih-IChen等通過實(shí)驗(yàn)，將吸附于固定化Cu2+親和膜的青霉素?；概c膜表面物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，制備成固定化酶第37頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六工藝流程PGA18℃12hpH10.0,18℃,76hEDTA

青霉素?；福籆u2+；配位鍵；共價(jià)鍵第38頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六第39頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六原初膜與固定化酶后的膜表面電鏡結(jié)構(gòu)第40頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六結(jié)果結(jié)果表明，在2個(gè)月內(nèi)，在使用26次內(nèi)酶活可以保留96.3%第41頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六色譜原理：色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動(dòng)相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)會(huì)不同，這使其隨流動(dòng)相運(yùn)動(dòng)速度各不相同，隨著流動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。

第42頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六色譜分類色譜可分為傳統(tǒng)色譜和新型色譜，傳統(tǒng)色譜有：1.吸附色譜2.離子交換色譜3.疏水色譜4.親和色譜5.反向色譜6.凝膠色譜第43頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六新型色譜包括以下3種色譜擴(kuò)張床吸附色譜整體柱色譜疏水性電荷誘導(dǎo)色譜第44頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六擴(kuò)張床吸附色譜流化床：將大量固體顆粒懸浮于運(yùn)動(dòng)的流體之中，從而使顆粒具有流體的某些表觀特征，這種流固接觸狀態(tài)稱為固體流態(tài)化，即流化床。固定床：在進(jìn)行多相過程的設(shè)備中，若有固相參與，且處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)，則設(shè)備內(nèi)的固體顆粒物料層，稱為固定床擴(kuò)張床：一種特殊的流化床。該流化床中液相、固相返回程度低第45頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六第46頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六流化床固定床擴(kuò)張床流化床、擴(kuò)張床、固定床之間的關(guān)系第47頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六擴(kuò)張床吸附色譜的原理當(dāng)料液從色譜柱下端流入時(shí)，填料上浮。至上浮速度與沉降速度一致時(shí)，填料最終處于懸浮狀態(tài)。此時(shí)能被填料吸附的物質(zhì)附著于填料上，不被吸附的隨著料液從色譜柱上端流出。當(dāng)所有不被吸附的物質(zhì)都流出后，開始從上向下對(duì)填料進(jìn)行洗脫，將被吸附物質(zhì)解吸。第48頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六擴(kuò)張床吸附色譜的操作平衡上樣洗滌洗脫再生第49頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六擴(kuò)張床吸附色譜操作示意圖第50頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六擴(kuò)張床吸附色譜圖第51頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六擴(kuò)張床吸附色譜純化青霉素酰化酶L.M.Pinotti等以陰離子樹脂StreamlineSPXL為填料，利用擴(kuò)張床吸附色譜分離大腸桿菌（E.coli）培養(yǎng)液和勻漿中的青霉素?；?。結(jié)論培養(yǎng)液中青霉素?；富厥章蕿?1.0%勻漿中青霉素酰化酶回收率55.0%第52頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六整體柱色譜傳統(tǒng)色譜柱：色譜柱中的填料為大孔球形填料整體柱：又稱為棒狀柱、連續(xù)床層，是一種用有機(jī)或無機(jī)聚合方法在色譜柱內(nèi)進(jìn)行原位聚合的連續(xù)床固定相第53頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六ABA傳統(tǒng)色譜柱；B整體柱第54頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六在形態(tài)上，整體柱與電泳凝膠類似第55頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六整體柱的優(yōu)勢(shì)介質(zhì)均勻，分辨率高可在高流速下操作可直接在柱內(nèi)聚合、交聯(lián)（與SDS凝膠配制類似）使用壽命長(zhǎng)，穩(wěn)定性好分辨率、吸附容量、使用流速可以通過改變制備過程中單體溶液組成來調(diào)節(jié)（類似于配制不同濃度的電泳凝膠）第56頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六整體柱分類無機(jī)介質(zhì)整體柱：硅膠等有機(jī)聚合物整體柱：聚丙烯酰胺類、聚苯乙烯類等第57頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六整體柱色譜分離青霉素酰化酶RustemKecili等構(gòu)建poly(EGDMA-MAAP）整體柱純化Penicillium

chrysogenum(NRRL)的青霉素?；负蚉enicilliumPurpurogenum的青霉素酰化酶。第58頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六整體住填料的分子結(jié)構(gòu)第59頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六填料的電鏡圖第60頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六結(jié)論第61頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六疏水性電荷誘導(dǎo)色譜疏水性電荷誘導(dǎo)色譜：疏水性電荷誘導(dǎo)色譜是一種通過可離子化的對(duì)偶式配基對(duì)pH依賴性，來分離生物大分子的新型液-固吸附性色譜技術(shù)。其吸附是通過溫和疏水作用，并在近生理?xiàng)l件下發(fā)生，不需郵寄溶劑或其他鹽類的加入。解吸是通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，使配基與目的產(chǎn)物帶上相同電荷，當(dāng)靜電斥力大于疏水性相互作用時(shí)，洗脫便開始了。第62頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六第63頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六疏水性電荷誘導(dǎo)色譜純化青霉素?；窪.Coulon等以4-MEP為填料，利用疏水性電荷誘導(dǎo)色譜分離青霉素?；傅?4頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六傳統(tǒng)色譜在分離青霉素?；钢械膽?yīng)用與新型色譜一樣，從傳統(tǒng)色譜出發(fā)可以開發(fā)出好的分離青霉素?；傅墓に嚨?5頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六擬親和色譜擬親和層析法：指用固定的配體選擇性吸附一些酶或其它蛋白的層析技術(shù)。第66頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六擬親和色譜分離青霉素?；窻ustemKecili等以Poly(EGDMA-MAAP)為配基，進(jìn)行擬親和色譜純化青霉素?；浮＝Y(jié)論青霉素?；讣兓稊?shù)為23.2青霉素酰化酶回收率為93%第67頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六一步離子交換純化青霉素?；?jìng)鹘y(tǒng)的分離純化工藝一般需要兩步或兩步以上操作。而每次操作都會(huì)有產(chǎn)物損傷，因此如何減少分離步驟是提高產(chǎn)率的一條思路。ValerieOrr等提出了一個(gè)只需一步離子交換色譜即可完成對(duì)青霉素酰化酶分離純化的工藝。如下表，他們采用一種電導(dǎo)率低的培養(yǎng)基培養(yǎng)能產(chǎn)生青霉素?；傅拇竽c桿菌第68頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六實(shí)驗(yàn)方法開發(fā)合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌至適當(dāng)時(shí)間后取出適量培養(yǎng)基，離心除去細(xì)胞。將適量上清液上樣于離子交換柱（QSepharoseTMFastFlowColumn）探索最佳工藝。用280nm紫外檢測(cè)。收集各區(qū)段進(jìn)行SDS檢測(cè)。第69頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六有圖可見，青霉素?；笡]有吸附到色譜柱上而雜蛋白大部分被色譜柱吸附第70頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六結(jié)論純化的青霉素?；傅拿富顬?6.3U/mg青霉素?；傅募兌忍岣吡?倍第71頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六其它方法離子交換膜色譜雙水相萃取高通量篩選輔助設(shè)計(jì)分離純化工藝第72頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六膜色譜技術(shù)膜色譜是將液相色譜與膜分離融合于一起的新型生化分離技術(shù)，具有選擇性高、分離速度快、能耗低、易放大等特點(diǎn)。膜色譜可分為四類：親和膜色譜，離子交換膜色譜，疏水作用膜色譜，多級(jí)膜色譜。第73頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六離子交換膜色譜離子交換膜色譜：離子交換膜色譜主要是利用膜介質(zhì)表面的離子交換基團(tuán)與目標(biāo)蛋白之間的離子交換作用進(jìn)行分離的根據(jù)離子交換基團(tuán)的性質(zhì)，可分為強(qiáng)陽離子型、弱陽離子型、強(qiáng)陰離子型、弱陰離子型。第74頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六離子交換膜色譜的特點(diǎn)操作條件較溫和使用壽命長(zhǎng)選擇性差第75頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六離子交換膜色譜分離青霉素?；竀alerieOrr等開發(fā)了集膜分離與離子交換色譜于一體的離子交換膜，用來分離青霉素酰化酶。第76頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果A離子交換膜的洗脫曲線；B各洗脫區(qū)段的SDS檢測(cè)第77頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六結(jié)論青霉素?；傅漠a(chǎn)量達(dá)到19U/mg青霉素?；傅幕厥章蔬_(dá)到72%第78頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六雙水相萃取原理：某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可以形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)（aqueoustwo-phasesystem,ATPS）?？尚纬呻p水相的雙聚合物體系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纖維素/葡聚糖。生物分子的分配系數(shù)取決與溶質(zhì)于雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用，其中主要有靜電作用、疏水作用和生物親和作用第79頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六雙水相萃取的優(yōu)勢(shì)含水量高（70%～90%），適合分離水溶性的蛋白質(zhì)，不易引起變性易于放大無有機(jī)溶劑殘留第80頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六雙水相萃取分離青霉素酰化酶OscarAguilar等研究了雙水相萃取提取青霉素?；秆芯堪l(fā)現(xiàn)，在PEG1450-phosphate,TLL48.5%(w/w),Vr=1.0,pHof7.0and35%(w/w)條件下，青霉素酰化酶的回收率達(dá)到97%，純化了3.5倍。第81頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六高通量篩選高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實(shí)驗(yàn)工具載體，以自動(dòng)化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗(yàn)過程，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)，以計(jì)算機(jī)分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在同一時(shí)間檢測(cè)數(shù)以千萬的樣品，并以得到的相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)支持運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系，它具有微量、快速、靈敏和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。簡(jiǎn)言之就是可以通過一次實(shí)驗(yàn)獲得大量的信息，并從中找到有價(jià)值的信息第82頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六現(xiàn)在的高通量檢測(cè)儀器兼容的微孔板密度已經(jīng)由最初的96孔增加到384孔,部分儀器甚至可以使用1536孔板進(jìn)行測(cè)量,大幅度提高了篩選通量。光學(xué)檢測(cè)技術(shù)也由單一的紫外-可見光檢測(cè)擴(kuò)大到化學(xué)發(fā)光檢測(cè)、熒光檢測(cè)和各種光學(xué)傳感技術(shù),為高通量檢測(cè)開辟了較廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域.第83頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六高通量篩選分析主要包括均相分析和細(xì)胞分析,均相分析技術(shù)中應(yīng)用較多的有親合閃爍分析(SPA)、熒光分析(FA)等技術(shù)。第84頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14分，星期六

熒光檢測(cè)(FA)熒光材料在一定條件下每個(gè)分子能釋放數(shù)千個(gè)光子,使理論上的單一分子水平檢測(cè)成為可能。這種特性以及可采用多種熒光模式,使得熒光檢測(cè)技術(shù)(FA,FluorescenceAssay)成為高通量篩選必不可少的方法第85頁，共97頁，2022年，5月20日，13點(diǎn)14