青霉素?；傅姆蛛x純化

關(guān)于青霉素?；傅姆蛛x純化第1頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六青霉素青霉素是常見抗生素之一。來源于點青霉、產(chǎn)黃青霉等真菌。對革蘭氏陽性菌的生長有抑制作用青霉素第2頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六青霉素的分類第3頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六青霉素的代謝途徑α-氨基己二酸半胱氨酸纈氨酸α-氨基己二酰半胱氨酰纈氨酸異青霉素N青霉素ACVSIPNSAT第4頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六AT是一系列不同的酶。不同的AT催化不同的酰基轉(zhuǎn)移反應生成不同的青霉素添加苯乙酸相應的AT催化它與異青霉素N反應生成青霉素G添加苯氧乙酸時，相應的AT催化它與異青霉素N反應生成青霉素V第5頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六青霉素?；?950年，日本科學家發(fā)現(xiàn)產(chǎn)黃青霉和米曲霉的菌絲可以分解青霉素得苯乙酸和另一種有機物（后被證實為6-APA）經(jīng)研究，這一反應由青霉素?；复呋私z狀真菌外，一些細菌和酵母中也檢測到青霉素?；傅幕钚缘?頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六青霉素?；傅慕Y(jié)構(gòu)青霉素?；傅慕Y(jié)構(gòu)差異較大。大腸桿菌（Escherichiacoli）青霉素G?；赣幸粋€α亞基和一個β亞基球形芽胞桿菌（Bacillussphaericus）的青霉素酰化酶是一個四聚體第7頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六第8頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六第9頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六催化的反應青霉素酰化酶RCOOH+青霉素6-APA第10頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六分類按照底物的不同，可以將青霉素?；阜譃榍嗝顾谿?；浮⑶嗝顾豓?；负桶逼S西林?；傅?1頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六應用制備β-內(nèi)酰胺類抗生素中間體（6-APA）半合成新的β-內(nèi)酰胺抗生素手性藥物基團保護第12頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六當前青霉素?；傅囊恍┭芯糠较虻鞍踪|(zhì)工程固定化分離純化第13頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六傳統(tǒng)的分離純化方法硫酸銨沉降葡聚糖凝膠色譜離子交換色譜電泳第14頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六據(jù)我們組閱讀的文獻，傳統(tǒng)方法分離青霉素?；傅幕厥章蚀蟛糠衷?0%至50%有必要開發(fā)新型提純工藝第15頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六新型分離純化方法一、色譜法1.擴張床吸附色譜2.整體柱色譜3.疏水性電荷誘導色譜4.一步離子交換色譜完成分離純化第16頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六二、固定化金屬親和膜分離法三、其它方法1.雙水相萃取2.高通量篩選輔助設(shè)計分離純化工藝第17頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六新方法提純青霉素酰化酶的回收率可達到90%第18頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六讓我們一起分享這些奇妙的分離純化方法第19頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六膜分離膜分離技術(shù)是指在分子水平上不同粒徑分子的混合物在通過半透膜時，實現(xiàn)選擇性分離的技術(shù)第20頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六傳統(tǒng)的膜分離包括：微濾膜（MF）、超濾膜（UF）、納濾膜（NF）、反滲透膜（RO）等第21頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六親和膜分離親和膜（affinitymembrane）：利用親和配基（染料、烷基、金屬離子等）修飾的濾膜。親和膜分離原理：是以親和膜為親和吸附介質(zhì)純化目標產(chǎn)物的分離方法，是親和色譜的變型，又稱膜親和色譜第22頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六親和膜的優(yōu)勢具備膜分離和親和色譜雙重功能，提高了分離純化能力可以支持高流速操作，解決了色譜太耗時間的缺點易于放大第23頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六親和膜的制備方法一般方法膜材料→成膜→活化→配基偶聯(lián)，膜材料→活化→配基偶聯(lián)→成膜，第24頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六分離過程親和吸附→洗脫→親和膜再生

第25頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六固定化金屬親和膜用固定于膜上的金屬離子（如Cu2+）為配基的親和膜即固定化金屬親和膜。如果金屬離子為Cu2+

，那么該膜稱為固定化Cu2+親和膜固定化金屬親和膜可以用于許多物質(zhì)的分離。青霉素?；甘瞧渲兄?。目前研究較多的是以Cu2+為配基的親和膜。第26頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六固定化Cu2+親和膜的分離原理具有選擇透過性的膜可截留大分子，都過小分子固定于膜上的Cu2+可以通過和青霉素?；副砻娴慕M氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等帶負電荷殘基的相互作用使其被吸附于膜上，再通過解析獲得被提純的青霉素?；傅?7頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六固定化Cu2+親和膜的制備Yi-MiaoKe等人以亞氨基二乙酸（IDA）為螯合劑，Cu2+為被螯合的離子制成親和膜。制備工藝第28頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六結(jié)果1.對Cu2+的螯合量增加至75.5±0.25μmol/disc2.提純后酶活增加至1.8U/disc第29頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六膜表面共價結(jié)合的物質(zhì)對膜效能的影響膜表面與膜共價結(jié)合的材料對分離效能也有影響Yung-ChuanLiu等研究了間隔臂（）的數(shù)量對膜效能的影響，即n值對膜效能的影響第30頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六第31頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六結(jié)果表明，用1,8-diaminooctane做間隔臂，即n=8時，青霉素酰化酶純化的比活度提高2.73倍，回收率為70.27%第32頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六青霉素?；阜蛛x過程Yung-ChuanLiu等研究發(fā)現(xiàn)，最佳上樣條件為：4℃,pH=8.5，0.5MNaCl,每單位區(qū)域上含32.04μmolCu2+最佳的洗脫條件為：pH=6.8，1MNH4Cl,0.5MNaCl。第33頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六PGA原液100ml1.2ml/min72mlwashingbuffer63mlelutionbuffer不能被吸附的蛋白質(zhì)被吸附蛋白質(zhì)被吸附蛋白質(zhì)；不能被吸附的蛋白質(zhì)；Cu2+；配位鍵第34頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六結(jié)果第35頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六該操作工藝使青霉素酰化酶純化的比活度提高了9.11倍該操作工藝的回收率為90.25%第36頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六雙功能膜純化和固定PGAChih-IChen等通過實驗，將吸附于固定化Cu2+親和膜的青霉素酰化酶與膜表面物質(zhì)共價結(jié)合，制備成固定化酶第37頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六工藝流程PGA18℃12hpH10.0,18℃,76hEDTA

青霉素酰化酶；Cu2+；配位鍵；共價鍵第38頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六第39頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六原初膜與固定化酶后的膜表面電鏡結(jié)構(gòu)第40頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六結(jié)果結(jié)果表明，在2個月內(nèi)，在使用26次內(nèi)酶活可以保留96.3%第41頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六色譜原理：色譜過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)分子在固定相和流動相之間分配平衡的過程，不同的物質(zhì)在兩相之間的分配系數(shù)會不同，這使其隨流動相運動速度各不相同，隨著流動相的運動，混合物中的不同組分在固定相上相互分離。

第42頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六色譜分類色譜可分為傳統(tǒng)色譜和新型色譜，傳統(tǒng)色譜有：1.吸附色譜2.離子交換色譜3.疏水色譜4.親和色譜5.反向色譜6.凝膠色譜第43頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六新型色譜包括以下3種色譜擴張床吸附色譜整體柱色譜疏水性電荷誘導色譜第44頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六擴張床吸附色譜流化床：將大量固體顆粒懸浮于運動的流體之中，從而使顆粒具有流體的某些表觀特征，這種流固接觸狀態(tài)稱為固體流態(tài)化，即流化床。固定床：在進行多相過程的設(shè)備中，若有固相參與，且處于靜止狀態(tài)時，則設(shè)備內(nèi)的固體顆粒物料層，稱為固定床擴張床：一種特殊的流化床。該流化床中液相、固相返回程度低第45頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六第46頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六流化床固定床擴張床流化床、擴張床、固定床之間的關(guān)系第47頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六擴張床吸附色譜的原理當料液從色譜柱下端流入時，填料上浮。至上浮速度與沉降速度一致時，填料最終處于懸浮狀態(tài)。此時能被填料吸附的物質(zhì)附著于填料上，不被吸附的隨著料液從色譜柱上端流出。當所有不被吸附的物質(zhì)都流出后，開始從上向下對填料進行洗脫，將被吸附物質(zhì)解吸。第48頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六擴張床吸附色譜的操作平衡上樣洗滌洗脫再生第49頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六擴張床吸附色譜操作示意圖第50頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六擴張床吸附色譜圖第51頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六擴張床吸附色譜純化青霉素酰化酶L.M.Pinotti等以陰離子樹脂StreamlineSPXL為填料，利用擴張床吸附色譜分離大腸桿菌（E.coli）培養(yǎng)液和勻漿中的青霉素?；?。結(jié)論培養(yǎng)液中青霉素?；富厥章蕿?1.0%勻漿中青霉素?；富厥章?5.0%第52頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六整體柱色譜傳統(tǒng)色譜柱：色譜柱中的填料為大孔球形填料整體柱：又稱為棒狀柱、連續(xù)床層，是一種用有機或無機聚合方法在色譜柱內(nèi)進行原位聚合的連續(xù)床固定相第53頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六ABA傳統(tǒng)色譜柱；B整體柱第54頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六在形態(tài)上，整體柱與電泳凝膠類似第55頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六整體柱的優(yōu)勢介質(zhì)均勻，分辨率高可在高流速下操作可直接在柱內(nèi)聚合、交聯(lián)（與SDS凝膠配制類似）使用壽命長，穩(wěn)定性好分辨率、吸附容量、使用流速可以通過改變制備過程中單體溶液組成來調(diào)節(jié)（類似于配制不同濃度的電泳凝膠）第56頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六整體柱分類無機介質(zhì)整體柱：硅膠等有機聚合物整體柱：聚丙烯酰胺類、聚苯乙烯類等第57頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六整體柱色譜分離青霉素酰化酶RustemKecili等構(gòu)建poly(EGDMA-MAAP）整體柱純化Penicillium

chrysogenum(NRRL)的青霉素?；负蚉enicilliumPurpurogenum的青霉素?；?。第58頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六整體住填料的分子結(jié)構(gòu)第59頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六填料的電鏡圖第60頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六結(jié)論第61頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六疏水性電荷誘導色譜疏水性電荷誘導色譜：疏水性電荷誘導色譜是一種通過可離子化的對偶式配基對pH依賴性，來分離生物大分子的新型液-固吸附性色譜技術(shù)。其吸附是通過溫和疏水作用，并在近生理條件下發(fā)生，不需郵寄溶劑或其他鹽類的加入。解吸是通過調(diào)節(jié)流動相的pH值，使配基與目的產(chǎn)物帶上相同電荷，當靜電斥力大于疏水性相互作用時，洗脫便開始了。第62頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六第63頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六疏水性電荷誘導色譜純化青霉素?；窪.Coulon等以4-MEP為填料，利用疏水性電荷誘導色譜分離青霉素?；傅?4頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六傳統(tǒng)色譜在分離青霉素?；钢械膽门c新型色譜一樣，從傳統(tǒng)色譜出發(fā)可以開發(fā)出好的分離青霉素?；傅墓に嚨?5頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六擬親和色譜擬親和層析法：指用固定的配體選擇性吸附一些酶或其它蛋白的層析技術(shù)。第66頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六擬親和色譜分離青霉素?；窻ustemKecili等以Poly(EGDMA-MAAP)為配基，進行擬親和色譜純化青霉素?；?。結(jié)論青霉素?；讣兓稊?shù)為23.2青霉素酰化酶回收率為93%第67頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六一步離子交換純化青霉素?；競鹘y(tǒng)的分離純化工藝一般需要兩步或兩步以上操作。而每次操作都會有產(chǎn)物損傷，因此如何減少分離步驟是提高產(chǎn)率的一條思路。ValerieOrr等提出了一個只需一步離子交換色譜即可完成對青霉素?；阜蛛x純化的工藝。如下表，他們采用一種電導率低的培養(yǎng)基培養(yǎng)能產(chǎn)生青霉素酰化酶的大腸桿菌第68頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六實驗方法開發(fā)合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌至適當時間后取出適量培養(yǎng)基，離心除去細胞。將適量上清液上樣于離子交換柱（QSepharoseTMFastFlowColumn）探索最佳工藝。用280nm紫外檢測。收集各區(qū)段進行SDS檢測。第69頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六有圖可見，青霉素?；笡]有吸附到色譜柱上而雜蛋白大部分被色譜柱吸附第70頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六結(jié)論純化的青霉素?；傅拿富顬?6.3U/mg青霉素酰化酶的純度提高了3倍第71頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六其它方法離子交換膜色譜雙水相萃取高通量篩選輔助設(shè)計分離純化工藝第72頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六膜色譜技術(shù)膜色譜是將液相色譜與膜分離融合于一起的新型生化分離技術(shù)，具有選擇性高、分離速度快、能耗低、易放大等特點。膜色譜可分為四類：親和膜色譜，離子交換膜色譜，疏水作用膜色譜，多級膜色譜。第73頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六離子交換膜色譜離子交換膜色譜：離子交換膜色譜主要是利用膜介質(zhì)表面的離子交換基團與目標蛋白之間的離子交換作用進行分離的根據(jù)離子交換基團的性質(zhì)，可分為強陽離子型、弱陽離子型、強陰離子型、弱陰離子型。第74頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六離子交換膜色譜的特點操作條件較溫和使用壽命長選擇性差第75頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六離子交換膜色譜分離青霉素酰化酶ValerieOrr等開發(fā)了集膜分離與離子交換色譜于一體的離子交換膜，用來分離青霉素酰化酶。第76頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六部分實驗結(jié)果A離子交換膜的洗脫曲線；B各洗脫區(qū)段的SDS檢測第77頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六結(jié)論青霉素?；傅漠a(chǎn)量達到19U/mg青霉素酰化酶的回收率達到72%第78頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六雙水相萃取原理：某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可以形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)（aqueoustwo-phasesystem,ATPS）?？尚纬呻p水相的雙聚合物體系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纖維素/葡聚糖。生物分子的分配系數(shù)取決與溶質(zhì)于雙水相系統(tǒng)間的各種相互作用，其中主要有靜電作用、疏水作用和生物親和作用第79頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六雙水相萃取的優(yōu)勢含水量高（70%～90%），適合分離水溶性的蛋白質(zhì)，不易引起變性易于放大無有機溶劑殘留第80頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六雙水相萃取分離青霉素?；窸scarAguilar等研究了雙水相萃取提取青霉素酰化酶研究發(fā)現(xiàn)，在PEG1450-phosphate,TLL48.5%(w/w),Vr=1.0,pHof7.0and35%(w/w)條件下，青霉素酰化酶的回收率達到97%，純化了3.5倍。第81頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六高通量篩選高通量篩選(Highthroughputscreening，HTS)技術(shù)是指以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎(chǔ)，以微板形式作為實驗工具載體，以自動化操作系統(tǒng)執(zhí)行試驗過程，以靈敏快速的檢測儀器采集實驗結(jié)果數(shù)據(jù)，以計算機分析處理實驗數(shù)據(jù)，在同一時間檢測數(shù)以千萬的樣品，并以得到的相應數(shù)據(jù)庫支持運轉(zhuǎn)的技術(shù)體系，它具有微量、快速、靈敏和準確等特點。簡言之就是可以通過一次實驗獲得大量的信息，并從中找到有價值的信息第82頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六現(xiàn)在的高通量檢測儀器兼容的微孔板密度已經(jīng)由最初的96孔增加到384孔,部分儀器甚至可以使用1536孔板進行測量,大幅度提高了篩選通量。光學檢測技術(shù)也由單一的紫外-可見光檢測擴大到化學發(fā)光檢測、熒光檢測和各種光學傳感技術(shù),為高通量檢測開辟了較廣泛的應用領(lǐng)域.第83頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六高通量篩選分析主要包括均相分析和細胞分析,均相分析技術(shù)中應用較多的有親合閃爍分析(SPA)、熒光分析(FA)等技術(shù)。第84頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14分，星期六

熒光檢測(FA)熒光材料在一定條件下每個分子能釋放數(shù)千個光子,使理論上的單一分子水平檢測成為可能。這種特性以及可采用多種熒光模式,使得熒光檢測技術(shù)(FA,FluorescenceAssay)成為高通量篩選必不可少的方法第85頁，共97頁，2022年，5月20日，13點14