植物組織培養(yǎng)技術簡介及其應用課件

植物組織培養(yǎng)技術簡介及其應用主要內容植物組織培養(yǎng)技術簡介組織培養(yǎng)技術的應用植物組織培養(yǎng)基本操作植物組織培養(yǎng)技術簡介

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組織培養(yǎng)的概念

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植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下,將離體的植物器官(如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等)、組織(如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等)、細胞(如體細胞、生殖細胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生質體(如脫壁后仍具有生活力的原生質體),培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上,給予適宜的培養(yǎng)條件,誘發(fā)產生愈傷組織,或潛伏芽等,或長成完整的植株,統(tǒng)稱為植物組織培養(yǎng)。由于是在試管內培養(yǎng),而且培養(yǎng)的是脫離植株母體的培養(yǎng)物,因此也稱離體培養(yǎng)或試管培養(yǎng)。?

根據(jù)外植體來源和培養(yǎng)對象的不同,又分為植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、原生質體培養(yǎng)等。

植物組織培養(yǎng)技術簡介

?外植體（器官、組織、細胞）完整植物

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植物細胞全能性：植物的單個細胞所具有的產生完整植物個體的潛在能力。細胞的脫分化和再分化是離體培養(yǎng)過程中細胞全能性表現(xiàn)的基本過程。植物組織培養(yǎng)技術簡介在培養(yǎng)條件下，植物細胞通過再分化形成完整個體可以通過兩種途徑：

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器官發(fā)生：經過愈傷組織的器官發(fā)生（間接器官發(fā)生途徑）不經過愈傷組織的器官發(fā)生（直接器官發(fā)生途徑）

?體細胞胚胎發(fā)生：經過愈傷組織的體細胞胚發(fā)生（間接體胚發(fā)生途徑）體細胞胚從外植體上直接發(fā)生（直接體胚發(fā)生途徑）組織培養(yǎng)技術的應用?在植物脫毒和快速繁殖上的應用??在植物育種上的應用

(1)單倍體育種

單倍體植株往往不能結實,在培養(yǎng)中用秋水仙素處理,可使染色體加倍,成為純合二倍體植株,這種培養(yǎng)技術在育種上的應用稱為單倍體育種。單倍體育種具有高速、高效率、基因型一次純合等優(yōu)點,因此,通過花藥或花粉培養(yǎng)的單倍體育種,已經作為一種嶄新的育種手段,并已開始育成大面積種植的作物新品種。組織培養(yǎng)技術的應用

(2)胚胎培養(yǎng)在植物種間雜交或遠緣雜交中,雜交不孕給遠緣雜交帶來了許多困難。而采用胚的早期離體培養(yǎng)可以使胚正常發(fā)育并成功地培養(yǎng)出雜交后代。遠緣雜交中,可把未受精的胚珠分離出來,在試管內用異種花粉在胚珠上萌發(fā)受精,產生的雜種胚在試管中發(fā)育成完整植株,此法稱為“試管受精”。用胚乳培養(yǎng)可以獲得三倍體植株,為誘導形成三倍體植物開辟了一條新途徑。三倍體加倍后可得到六倍體,可育成多倍體新品種。

組織培養(yǎng)技術的應用

(4)基因工程基因轉化是有目的地將外源基因或DNA導入植物細胞內,使之整合、表達并遺傳，通過外源基因的導入，并植物體內表達，有目的地改變植物性狀，以提高作物的抗逆性，改良作物品質。植物組織培養(yǎng)是外源基因導入植物細胞的關鍵技術，通過組織培養(yǎng)技術可以建立一個良好的植物轉化系統(tǒng)，目前通常使用的再生系統(tǒng)有愈傷組織再生系統(tǒng)、直接分化再生系統(tǒng)、原生質體再生系統(tǒng)、胚狀體再生系統(tǒng)和生殖細胞受體系統(tǒng)等。組織培養(yǎng)技術的應用

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在提取植物次生產物生產上的應用

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在人工種子和種質保存方面的應用

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在植物檢疫方面的作用培養(yǎng)基的配制

?培養(yǎng)基的種類和成分?

目前國際上流行的培養(yǎng)基有幾十種，如：MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、

WPM培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基等。?培養(yǎng)基的成分主要可以分水、無機鹽、有機物、天然復合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。1、水大規(guī)模生產時可用自來水。但在少量研究上盡量用蒸餾水；

2、無機元素大量元素：有N，P，K，Ca，Mg，S等；微量元素：Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。Fe鹽：FeSO4·7H2O和Na2-EDTA結合成螯合物使用。

培養(yǎng)基的配制3、有機化合物

(1)碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，蔗糖使用濃度在2％-3％，常用3％；

(2)維生素(vitamin)主要有VB1(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、VC(抗壞血酸)、有時還使用生物素、葉酸、VB2等。一般用量為0.1-1.0mg/L。

(3)肌醇又叫環(huán)己六醇。使用濃度一般為100mg/L。

(4)氨基酸是有機氮源，可直接被細胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用甘氨酸。培養(yǎng)基的配制4．植物激素(hormone)

在培養(yǎng)基的各成分中植物激素是培養(yǎng)基的關鍵物質,對植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。(1)生長素類(auxin)，如NAA、IAA、IBA、2,4-D等主要被用于誘導愈傷組織形成，誘導根的分化和促進細胞分裂、伸長生長；(2)細胞分裂素類(cytokinin)，如BA、TDZ、KT、ZT等多用于誘導不定芽的分化、莖、苗的增殖，而避免在生根培養(yǎng)時使用；(3)GA(赤霉素)用于打破休眠，促進種子、塊莖、鱗莖等提前萌發(fā)；(4)ABA（脫落酸）促進細胞成熟老化等。

培養(yǎng)基的配制

5.瓊脂(agar)

在固體培養(yǎng)時瓊脂是最好的固化劑。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂溶解于90℃以上的熱水。瓊脂的用量在6-10g／L之間。培養(yǎng)基的配制?配制培養(yǎng)基的方法和步驟

1、MS培養(yǎng)基及激素母液的配制培養(yǎng)基配方中各種成分的用量從每升幾毫克到幾千毫克不等，為了配制培養(yǎng)基的方便，通常將培養(yǎng)基的不同成分先配制成高濃度的母液。無機鹽按大量元素、微量元素和Fe鹽3部分分別配制。一般將大量元素配制成20×母液，微量元素、Fe鹽和有機成分配制成200×母液。激素的使用濃度很低，一般分別配制成0.1～1mg/ml濃度的溶液。配好的母液貯存于2～4℃的冰箱中備用。

培養(yǎng)基的配制（以MS為例）：母液的配制和保存，稱量，溶解，定容，分裝，標簽，滅菌保存。

母液種類成分規(guī)定用量擴大稱取量母液定容配1LMS培養(yǎng)基吸取量(ml)(mg/L)倍數(shù)(mg)體積(ml)

KNO31900

38000

NH4NO31650

33000

大量元素MgSO4.7H2O370207400100050

KH2PO4170

3400

CaCI.2H2O440

8800

微量元素MnSO4.4H2O22.3

4460

ZnSO47H2O8.6

1720

H3BO36.2200124010005KI0.83

166

Na2MoO4.2H2O0.25

50

CuSO4.5H2O0.025

5

CoCI2.6H2O0.025

5

鐵鹽Na2-EDTA37.3200746010005FeSO4.7H2O27.85560有機物煙酸0.5

100

甘氨酸2

400

VB0.12002010005VB0.5

100

肌醇100

20000

培養(yǎng)基的配制?配制培養(yǎng)基時應注意的問題

1、在配制培養(yǎng)基母液或者培養(yǎng)基時，各種成分要嚴格按照添加方式和添加順序加入，以免培養(yǎng)基產生沉淀現(xiàn)象。如：⑴、配制大量元素母液時，各種無機鹽單獨溶解后，必須按照硝酸鉀、硝酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀和氯化鈣的次序混合定容，因為氯化鈣與磷酸二氫鉀、硫酸鎂極易形成磷酸三鈣、硫酸鈣之類不溶于水的沉淀。⑵、配制微量元素母液時，應按硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、硼酸、鉬酸鈉、碘化鉀和氯化鈷的順序混合定容。⑶、配制Fe鹽時，分別溶解FeSO4·7H2O和Na2EDTA·2H2O在適當體積的蒸餾水中，適當加熱并不停攪拌，待完全溶解后將二者混合在一起，調整pH至5.5，最后定容到所需體積。培養(yǎng)基的配制

?滅菌

培養(yǎng)基配置好后，在高壓滅菌鍋中121℃滅菌20min。瓶裝的培養(yǎng)基在滅菌前分裝，而要用培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基在滅菌后分裝。?

注意：對于不能高壓滅菌的成分，如IAA、ZT、GA3、ABA、AgNO3、谷氨酰胺、抗生素等，需先過濾滅菌，待高壓滅菌的培養(yǎng)基冷至50℃左右時，再加入這些成分分裝。離體培養(yǎng)體系的建立——初代培養(yǎng)植物外植體都是帶菌的，在進行離體培養(yǎng)之前，必須先對外植體進行消毒滅菌處理，以獲得無菌植物材料。常用的方法是用消毒劑進行表面滅菌。消毒劑對植物細胞有殺傷作用，因此，要根據(jù)外植體對消毒劑的敏感性和其受污染程度來確定消毒劑種類、濃度及處理時間。常用的消毒劑有酒精、次氯酸鈉、過氧化氫、升汞、硝酸銀和溴水等。用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌。初代培養(yǎng)

1、外植體的選擇（1）、外植體的部位在組織培養(yǎng)中，如何選擇合適的，最能表達全能性的部位，是決定組織培養(yǎng)體系成功建立的前提之一。（2）、取材季節(jié)取材季節(jié)也是重要因素之一，對大多數(shù)植物，應在其生長開始的季節(jié)。（3）、器官的生理特點和發(fā)育幼年組織比老年組織具有較高的行態(tài)發(fā)生能力。（4）、外植體的大小莖段長0.5cm，葉片面積5mm2。

初代培養(yǎng)

2、外植體的消毒外植體的消毒步驟

首先，把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，洗時可加入洗衣粉清洗；第二步要在超凈臺用70％酒精消毒10-30s；第三步是用殺菌劑0.1%升汞處理5-20min；第四步用無菌水涮洗4-6次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。

初代培養(yǎng)

3、無菌操作

⑴超凈工作臺滅菌開始無菌操作前半小時，打開超凈工作臺上的紫外燈，照射20分鐘后，關閉紫外燈，使超凈工作臺正常送風，10分鐘左右后，即可開始無菌操作。⑵雙手及接種器械滅菌進行無菌操作前，先用肥皂洗滌雙手，穿好工作服。用70％～75％的酒精擦拭臺面并消毒雙手。所有接種器械用75％酒精浸泡，在酒精燈上灼燒滅菌。⑶接種切去材料兩端各0.5cm左右長度莖段，將莖段接種到初代培養(yǎng)基上。在培養(yǎng)容器上標明培養(yǎng)基代號和接種日期。

4、初代培養(yǎng)接種完成后，盡快將接種材料置于適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下進行培養(yǎng)。并定期進行觀察記錄。組織培養(yǎng)時的注意事項

1、表面消毒劑對植物組織是有害的，應正確選擇消毒劑的濃度和處理時間，以減少組織的死亡。

2、消毒劑最好在使用前臨時配制，氯化汞可在短時間內貯用。

3、滅菌后的材料應立即接種，以免造成二次污染。

組織培養(yǎng)時的注意事項

4、紫外線對人體有危害，在工作臺滅菌時，不能將皮膚暴露于紫外燈下，不可直接用眼睛看紫外光。超凈工作臺上的紫外燈關閉后不要立即走近工作臺，以免臭氧傷害呼吸道和眼睛。

5、無菌操作時注意手臂切勿從培養(yǎng)基、無菌材料或接種工具上方經過，以免引起污染。離體培養(yǎng)體系的建立——繼代與生根培養(yǎng)

1、無菌苗繼代培養(yǎng)

2、生根培養(yǎng)當無菌苗植株健壯，高度達到2-3cm時，即可進行生根培養(yǎng)。配制生根培養(yǎng)基在1/2MS或1/4MS培養(yǎng)基中，添加濃度比例較高的生長素和細胞分裂素。繼代與生根培養(yǎng)注意事項：1、進行繼代時，如發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)物的底部長出愈傷組織，應將其切去。2、無菌苗用于生根培養(yǎng)前，應適當進行壯苗，否則無菌苗太弱小，不利于以后生根成活。組培苗的移栽

1、練苗練苗的主要措施是，移栽前將試管苗置于室溫環(huán)境下，增加光照強度（一般要求為4000～6000勒可斯），閉瓶放置3天后，打開瓶蓋通風、透氣，煉苗10天左右，使之逐步適應后，再移栽。也可以將生根瓶移入溫室內培養(yǎng)，然后打開瓶蓋通風、透氣，練苗2～3天，使苗逐步適應后再移栽。

2、移栽⑴移栽基質移栽試管苗的基質應疏松、通氣且有良好的排水性能。可用蛭石︰河沙（1︰1）或者珍珠巖︰河沙（1︰1），也可用蛭石︰草炭(1︰1)。本實驗采用泥炭土︰珍珠巖︰河沙（0.5︰1︰1）為基質。移栽后每株苗子澆灌15毫升左右的1/2MS培養(yǎng)液。⑵移栽從培養(yǎng)基中取出發(fā)根的小苗，用自來水洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，要全部除去，以防殘留培養(yǎng)基滋生雜菌。但要輕輕除去，應避免造成傷根。栽植時用一個筷子粗的竹簽在基質中插一小孔，然后將小苗插入，注意幼苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質壓實，栽前基質要澆透