熒光染料課件

熒光染料定義:能發(fā)出熒光的染料。在吸收可見光和紫外光后，能把紫外光轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄩL較長的可見光波而反射出來，呈閃亮的鮮艷色彩。它們大多是含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵的化合物。應(yīng)用：由于大多數(shù)熒光染料不具備選擇性，被固載在生物活性載體的熒光染料，可利用生物活性物質(zhì)之間的選擇性，達(dá)到選擇性識別變異細(xì)胞并定位的目的．如將染料與抗體或某些蛋白質(zhì)載體相結(jié)合用于腫瘤的檢測，可用于許多抗癌藥物中。

第一節(jié)熒光染料的研究進(jìn)展1.二十世紀(jì)是生命科學(xué)飛速發(fā)展的時(shí)期，從DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在人類基因組計(jì)劃的完成，以及已經(jīng)啟動的后基因組計(jì)劃――蛋白質(zhì)工程；人類正從分子水平認(rèn)識生命，闡述人的生老病死。2.生命科學(xué)的發(fā)展就是人們對組成生物體的各種物質(zhì)(如蛋白質(zhì)，DNA，糖，及微量的金屬離子，陰離子，中性分子等)進(jìn)行不斷深入研究和了解的過程，在這個(gè)過程當(dāng)中對某種物質(zhì)的檢測是研究的根本，要達(dá)到識別和檢測這些物質(zhì)的目的就需要有一種能夠被檢測到的信號來反映這些物質(zhì)的濃度和所處的狀態(tài)。熒光化合物能夠發(fā)出光信號，而且對生物體無損傷，是完成這一任務(wù)的理想選擇，所以熒光化合物的研究一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，它伴隨著生命科學(xué)的發(fā)展發(fā)揮著越來越重要的作用。3.熒光檢測法不會對生物體產(chǎn)生輻射，且信噪比高，靈敏度好，是現(xiàn)在研究和應(yīng)用最多的一種方法。隨著熒光分析檢測技術(shù)的發(fā)展，熒光染料在在DNA雜交測試、免疫檢測、基因重組檢測、腫瘤細(xì)胞早期診斷和生物體內(nèi)各種自由基以及各種生物活性離子的分析檢測等方面的廣泛應(yīng)用,極大地促進(jìn)了熒光染料的發(fā)展。僅過去幾年間就有大量文獻(xiàn)和專利對這類功能性染料的研究及應(yīng)用進(jìn)行了報(bào)道。第二節(jié)常用熒光染料大多數(shù)生物分子本身沒有熒光或熒光較弱,檢測靈敏度較低,為使之高靈敏地檢出,人們常用強(qiáng)熒光(Fluorescent)的標(biāo)記試劑或熒光生成(Fluoregenic)試劑與待測物進(jìn)行標(biāo)記或衍生,生成具有高熒光強(qiáng)度的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的物質(zhì),使檢出限大大降低。目前用于標(biāo)記或衍生的熒光試劑主要有花菁類、BODIPY類、熒光素類、羅丹明類以及鄰苯二甲醛(OPA)類和香豆素類等化合物,它們本身或衍生產(chǎn)物具有很高的熒光量子產(chǎn)率,但最大吸收波長和熒光發(fā)射波長多小于650nm。對生物樣品而言,其樣品基體和一些雜質(zhì)在此區(qū)域也會有吸收或熒光再加上光散射的影響往往會產(chǎn)生較為嚴(yán)重的背景干擾,限制了熒光分析法靈敏度的提高。相對于常規(guī)熒光(λem<650nm)檢測而言,在近紅外熒光(λem>650nm)光區(qū),生物樣品基體光吸收或熒光強(qiáng)度很小,因而背景干擾大大降低,并且由于散射光強(qiáng)度與波長的四次方成反比,隨波長的增加,拉曼散射迅速減小,使散射干擾也大為減少。方酸菁染料及應(yīng)用方酸菁染料是由方酸或其酯與富電子基團(tuán)發(fā)生縮合反應(yīng)而得1,3二取代衍生物,取代衍生物通常是吡咯、吲哚、苯胺等基團(tuán)。方酸菁上存在的方酸環(huán)殘基使其最大吸收波長和發(fā)射波長向長波方向移動,并可增加其富電子性,穩(wěn)定方酸菁結(jié)構(gòu)。對稱性方酸菁的代表性結(jié)構(gòu)如下:1.性質(zhì)此類染料的結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，在不同的試劑中,方酸菁染料的發(fā)射光譜的位移并不明顯,同時(shí)溶劑對方酸菁染料的熒光量子產(chǎn)率影響較為明顯。隨著溶劑極性的增大,染料的吸收光譜發(fā)生藍(lán)移,表現(xiàn)為負(fù)向溶劑化效應(yīng),在極性溶劑中的熒光量子產(chǎn)率比在水中的大。

取代衍生物通常是吡咯、吲哚、苯胺等基團(tuán)，可以被合成為近紅外探針。2.應(yīng)用

方酸菁染料對牛血清蛋白(BSA)有很高的親和性。Ozin

skas等報(bào)道了一種方酸菁衍生物和BSA結(jié)合后,熒光壽命為自由狀態(tài)的31倍、熒光強(qiáng)度為28倍,量子產(chǎn)率也有較大的提高。許多熒光探針與蛋白質(zhì)結(jié)合后,當(dāng)染料/蛋白質(zhì)超過一定比率時(shí),量子產(chǎn)率會降低,這是因?yàn)闈舛雀邔?dǎo)致熒光猝滅的緣故,其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

Terpetsch

ingE,Szmacinsk

iH,OzinskasAandlakow

iczR.Anal.Biochem.[J],1994,217:197

花菁類染料及其應(yīng)用這類染料目前應(yīng)用最為廣泛,此類探針中間為多次亞甲基橋,兩端為噻唑、苯并噻唑和噁唑等,可在中間或兩端修飾上多種基團(tuán),以獲得優(yōu)良性質(zhì)，這些染料代表性結(jié)構(gòu)如下：1.優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：花菁類熒光染料的最大吸收波長大都在600～800nm之間,有的甚至超過800nm,在制得探針用于生物樣品的測定時(shí)可以有效避免生物體內(nèi)自發(fā)熒光和散射光的干擾，極大的提高檢測的靈敏度。缺點(diǎn)：花菁類熒光染料Stokes位移不大,一般只有20-30nm左右，摩爾吸光系數(shù)一般都有105L·mol-1·cm-1,在水溶液中量子產(chǎn)率很低,

與被分析物結(jié)合后吸收波長和發(fā)射波長發(fā)生變化，熒光壽命也增加。

2.應(yīng)用花菁染料在DNA序列分析中有較多的應(yīng)用,Chen等人合成了含有N-羥基琥珀酰亞胺活性酯類花菁染料用于標(biāo)記寡聚核苷酸M13引物用作DNA序列分析,使用CE(毛細(xì)管電泳)分離,LIF(激光誘導(dǎo)熒光)檢測,檢出限為10-10mol/L，且可用作DNA雜交探針。Shealy等人將IR-144經(jīng)過修飾后,最大吸收波長可發(fā)生紅移,用作DNA序列分析,每次可以分析樣品中大約500個(gè)堿基對,能夠檢測到0.1-1.0fmol的DNA片段。Lee等人研究發(fā)現(xiàn)單甲川花菁染料即噻唑橙(TO)可作為非共價(jià)DNA及RNA測定的一類重要的熒光探針。Drexhage研究小組設(shè)計(jì)合成出一系列陽離子型噻唑橙類單甲川花菁染料，實(shí)驗(yàn)表明這類染料與DNA或RNA作用時(shí)都有明顯的熒光增強(qiáng)，因此都可應(yīng)用于DNA分子的檢測。

花菁類探針也可共價(jià)或非共價(jià)地標(biāo)記蛋白質(zhì)。許金鉤等人采用花菁染料分光光度法測定血清蛋白質(zhì)，其檢測限為50ng／mL。IR-l25在血漿分析中有應(yīng)用，用光吸收法測定時(shí)檢出限為125ng／mL，用LIF貝JJ為O.8ng／mL。Li等人利用新型水溶性近紅外花菁染料DTCY與蛋白結(jié)合后吸收光譜的變化研究其與蛋白質(zhì)間的相互作用。Panova等人研究了新型的陰離子花菁染料與蛋白之間強(qiáng)烈的非共價(jià)結(jié)合作用，并對細(xì)胞外蛋白及膠原質(zhì)進(jìn)行非共價(jià)標(biāo)記后，利用其標(biāo)記前后吸收光譜的變化研究了人體器官內(nèi)蛋白的功能。該方法有望用于某些疾病的診斷。研究發(fā)現(xiàn)，花菁既可以以單體，也可以以二聚體與核酸作用；花菁與核酸結(jié)合所形成的聚集體在結(jié)構(gòu)上不同于染料在沒有核酸存在下形成的聚集。Rye等研究發(fā)現(xiàn)噻唑橙二聚體TOTO(兩個(gè)TO發(fā)射團(tuán)通過雙陽離子連接臂連接)能同核酸形成穩(wěn)定性更高的熒光絡(luò)合物，而TO與核酸的作用是可逆的。聯(lián)二花菁類染料(jtlITOTO和YOYO)較之花菁單體具有更強(qiáng)的聚集傾向，因此正逐步成為核酸分析領(lǐng)域中一類非常重要的熒光染料。激發(fā)和發(fā)射分別在794和810nm

本課題組選擇乙基花菁作為熒光團(tuán)，羥肟酸作為銅離子的選擇性配體，設(shè)計(jì)合成了一種新型近紅外熒光探針。最大激發(fā)波長位于712nm，最大發(fā)射波長位于745nm

BODIPY類熒光染料及其應(yīng)用

BODIPY類熒光染料的基本結(jié)構(gòu)單元有a和b兩種，即我們通常所說的BODIPY和唑系BODIPY。1.優(yōu)缺點(diǎn)(1)由于BODIPY染料母體結(jié)構(gòu)周圍一般不直接連接對酸堿較敏感的氨基，羥基等，所以BODIPY染料一般對pH值不敏感。(2)BODIPY染料的熒光量子產(chǎn)率一般都比較高，有的在水中的熒光量子產(chǎn)率可以達(dá)到接近1.0的水平。(3)具有相對較好的光穩(wěn)定性，比熒光素、花菁等穩(wěn)定。(4)BODIPY類熒光染料的熒光光譜半峰寬較窄，作為熒光標(biāo)識的時(shí)候有很好的靈敏度。(5)BODIPY類熒光染料的摩爾吸光系數(shù)很大，吸光效率比較高?？偨Y(jié)：具有較窄的吸收和發(fā)射峰、較高的摩爾吸光系數(shù)、較高的光穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性以及較高的量子產(chǎn)率等。2.應(yīng)用該類染料被廣泛的應(yīng)用于各種金屬離子的檢測，檢測自由基，測定pH值，進(jìn)行DNA標(biāo)記及測序等。BODIPY熒光染料進(jìn)行特定修飾后，實(shí)現(xiàn)在紫外可見區(qū)以及紅外近紅外光區(qū)任意改變其吸收和發(fā)射波長，合成出各種不同的染料可以廣泛的應(yīng)用到分析化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、臨床診斷、環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域中，應(yīng)用前景非常廣闊。在母體染料上引入了吡啶基團(tuán)，并在兩側(cè)引入了噻吩基團(tuán)，以使其發(fā)射波長紅移至近紅外區(qū)。染料在不同溶劑中染料的吸收峰位置、發(fā)射蜂位置、摩爾吸光系數(shù)、Stocks位移、熒光量子產(chǎn)率如下表所示：在不同溶劑中染料的吸收峰位置、發(fā)射峰位置、摩爾吸光系數(shù)、Stocks位移、如下表所示：溶劑甲醇乙醇乙酸乙酯乙腈二氯甲烷三氯甲烷四氫呋喃二甲基亞砜吸收峰（nm）652653652652656657658665摩爾吸光系數(shù)（M－1cm－1）1700016800174001640016600168001720018600發(fā)射峰(nm)675676677676680681682689Stocks位移(nm)2323252424242423染料化合物在不同溶劑中的熒光量子產(chǎn)率和熒光壽命如下圖所示：溶劑甲醇乙醇乙酸乙酯乙腈二氯甲烷三氯甲烷四氫呋喃二甲基亞砜熒光量子產(chǎn)率0.480.500.320.280.340.430.310.30熒光壽命（ns）1.651.901.891.782.022.281.802.07具有活性基團(tuán)短波長和長波長BODIPY

由上圖可知染料a的最大激發(fā)和發(fā)射波長分別為560nm和608nm，Stocks位移為48nm，并且染料a的發(fā)射峰都比較尖銳、寬帶比較窄，這些都是特征的BODIPY類化合物的光譜，這是典型的該類化合物的特征。

在染料b中由于具有較強(qiáng)的吸電子能力的Br的引入，使染料b的熒光譜圖略微有些變化，主要表現(xiàn)為染料的最大激發(fā)和發(fā)射峰的位置稍微發(fā)生紅移，分別達(dá)到為571nm和617nm，Stocks位移為46nm，同時(shí)激發(fā)峰變寬。最大激發(fā)和發(fā)射峰位置紅移，同時(shí)染料仍然保持了發(fā)射峰半峰寬較窄的優(yōu)點(diǎn)，這些都更加有利于染料進(jìn)一步制成熒光探針用于分析檢測。在染料10中由氮原子代替了碳原子，由于氮原子中有一孤對電子，使π–π*躍遷變?yōu)閚-π*躍遷，躍遷過程中的能級降低，使染料的激發(fā)和發(fā)射波長有了較大紅移。染料10的激發(fā)和發(fā)射波長分別達(dá)到了698nm和728nm，Stocks位移為30nm，發(fā)射峰半峰寬較窄。染料10的激發(fā)和發(fā)射峰都在近紅外區(qū)域，染料10制成生物探針之后，更有利于避開生物體內(nèi)自發(fā)熒光的背景干擾用于生物體內(nèi)物質(zhì)的檢測。熒光素類熒光染料及其應(yīng)用

生物發(fā)光現(xiàn)象普遍存于自然界中，熒光素在生物發(fā)光現(xiàn)象中起著非常重要的作用。熒光素，又稱熒光黃，熒光紅。熒光素分子存在著兩種共振體，即內(nèi)酯型和醌型，如下圖所示。由于氧橋鍵把兩個(gè)苯環(huán)固定在一個(gè)平面上，使分子具有剛性共平面結(jié)構(gòu)，有利于熒光的產(chǎn)生。

1.特點(diǎn)

熒光素及其衍生物是重要的熒光探針材料，屬于咕噸染料。1871年Baye首次合成出熒光素。熒光素的熒光發(fā)射光譜和pH值有關(guān)。當(dāng)熒光素以陽離子形式存在時(shí)，其熒光量子產(chǎn)率為0.9-1.0；當(dāng)熒光素以中性分子形式存在時(shí)，其熒光量子產(chǎn)率為0.20-0.25；當(dāng)熒光素以陰離子形式存在時(shí)，其熒光熒光量子產(chǎn)率為0.25－0.30。中性分子和陰離子形式存在的熒光在515nm處都有最大發(fā)射，發(fā)射光譜一直延伸到大約700nm。當(dāng)pH值為3時(shí)，相對熒光強(qiáng)度為0,pH值在4和5之間增加緩慢，pH在6和7之間增加迅速，當(dāng)pH值為8時(shí)，相對熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，當(dāng)pH值大于8時(shí)，相對熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定。當(dāng)酸度過大時(shí)，以硫酸為例，當(dāng)硫酸濃度從1mol/L逐步增加到18mol/L時(shí)，熒光素的熒光壽命反而增加，并發(fā)生藍(lán)移。同樣異硫氰酸熒光素的熒光強(qiáng)度也會隨著pH值的變化而變化，據(jù)此發(fā)展了一種pH傳感器。質(zhì)添加到熒光素溶液中時(shí)，只會輕微地減小熒光壽命。熒光素的壽命與熒光素的濃度、pH值和添加物的濃度有關(guān)。由于自吸和能量轉(zhuǎn)移，熒光素的壽命隨著熒光素的濃度增加而增大。而濃度越大，熒光光譜的最大發(fā)射波長也越大，當(dāng)熒光濃度增大至10-4mol/L時(shí)，熒光素的最大波長為522nm。當(dāng)濃度低于2×10-5mol/L，熒光素的自吸收可以忽略不計(jì)。當(dāng)pH值增加時(shí)，熒光的壽命也增加。在pH>7時(shí)，熒光素的壽命基本保持不變，約為4.65ns。有其它物質(zhì)添加到熒光素溶液中時(shí)，只會輕微地減小熒光壽命。2.應(yīng)用

熒光素可以用在生物疾病檢測中。熒光素可以用來標(biāo)記DNA。熒光素的N,N-二羧甲基氨甲基的衍生物可用來檢測生物樣品中的堿土金屬、鋁離子、鈷離子、銅離子、鎳離子和鋅離子。熒光素也可對陰離子進(jìn)行檢測。龔波林（龔波林，龔國權(quán)，王懷公.分析化學(xué)

1997,25,906.）等報(bào)道了熒光素?zé)晒獯銣绶y定微量的碘酸根。在0.05mol/LH2S04介質(zhì)中，碘離子和碘酸根離子反應(yīng)生成了碘，碘與熒光素反應(yīng)，使熒光素?zé)晒獯銣?。該體系的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為493nm和514nm。碘酸根含量在2-80μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢出限為2.0μg/L。熒光素對苯氧羧酸殺蟲劑進(jìn)行衍生化，衍生化的產(chǎn)物用電動色譜進(jìn)行分離，然后激光誘導(dǎo)熒光進(jìn)行檢測。這種方法經(jīng)過改進(jìn)，不僅可檢測苯氧羧酸，還可檢測熒光素衍生化的其他物質(zhì)。

異硫氰酸熒光素一種熒光試劑，發(fā)射綠色熒光，該分子中含有活潑的異硫氰酸基團(tuán)。易溶于水和酒精溶劑，最大吸收光波長為490～495nm，最大發(fā)射光波長為520～530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色?？梢杂糜趯股锼氐鞍缀蜕锼氐臋z測。在318nm和494nm處對探針進(jìn)行激發(fā)，它們的最大發(fā)射波長分別位于436nm和519nm處。羅丹明類熒光染料及其應(yīng)用

羅丹明衍生物和熒光素屬于同一類的化合物，常見的羅丹明衍生物由羅丹明6G、羅丹明B、異硫氰酸羅丹明、羅丹明G、高氯酸羅丹明6G、羅丹明101等。羅丹明類化合物是以氧雜蒽為母體的堿性染。其基本的結(jié)構(gòu)如下：1.優(yōu)缺點(diǎn)與其它常用的熒光染料相比，羅丹明類熒光染料具有光穩(wěn)定性好、對pH不敏感、較寬的波長范圍和較高的熒光量子產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用在藥理學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、環(huán)境化學(xué)、單個(gè)分子檢測、信息科學(xué)、熒光標(biāo)記、激光染料等方面，是分析化學(xué)和生物醫(yī)藥科學(xué)等生物技術(shù)領(lǐng)域中最常用的熒光染料之一。

2.熒光量子產(chǎn)率熒光量子產(chǎn)率是衡量熒光物質(zhì)熒光量的尺度，有分析應(yīng)用價(jià)值的熒光化合物其值常處于0.1-1.0之間。熒光量子產(chǎn)率指熒光物質(zhì)吸光后所發(fā)射的熒光的光子數(shù)與所吸收的激發(fā)光的光子數(shù)之比值，可通過測量待測熒光物質(zhì)和已知量子產(chǎn)率的參比熒光物質(zhì)兩者的稀溶液在同樣激發(fā)條件下積分熒光強(qiáng)度(即校正熒光光譜所包括的面積)和在該激發(fā)波長的吸光度加以計(jì)算得到。羅丹明B和羅丹明101可作熒光量子產(chǎn)率的參考物質(zhì)。在所有溫度下羅丹明101的熒光量子產(chǎn)率幾乎為1.0，因?yàn)榱_丹明101具有較穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)。經(jīng)過校正，在溫度低于200K時(shí)，羅丹明B的熒光量子產(chǎn)率幾乎為1.0，但在室溫下，羅丹明B的熒光量子產(chǎn)率小于或等于0.5。Kubin等研究了在0.5mol/L的硫酸介質(zhì)中羅丹明類化合物的熒光量子產(chǎn)率。具體的結(jié)果為羅丹明6G(0.95),羅丹明B(0.65),羅丹明3B(0.45),羅丹明19(0.95)，羅丹明101(0.96),羅丹明110(0.92),羅丹明123(0.90)。

3.發(fā)展近年報(bào)道的新型羅丹明類熒光染料，主要是通過增加分子共平面性、結(jié)構(gòu)剛性以及分子二電子共扼體系來提高熒光效率并使熒光紅移。在芳環(huán)上引入取代基以改變熒光的光量子產(chǎn)率和發(fā)射波長，這些結(jié)構(gòu)上的修飾彌補(bǔ)了羅丹明的某些功能缺陷，使其具有了更高靈敏度、更高選擇性和可靠性，更加有利于分析檢測。隨著合成及應(yīng)用技術(shù)的不斷進(jìn)步，研制高熒光量子產(chǎn)率、結(jié)構(gòu)高度剛化、高穩(wěn)定性和超高靈敏度的復(fù)雜雜環(huán)羅丹明類熒光染料仍然是該領(lǐng)域的重要研究方向。theemissionpeakfrom573to585nm

噻嗪類和噁嗪類熒光染料及其應(yīng)用

噻嗪類和噁嗪類近紅外熒光探針具有合成比較容易、分子較小等優(yōu)點(diǎn),但其不足之處在于它們的熒光量子產(chǎn)率偏低,限制了其應(yīng)用。常用的噻嗪類和噁嗪類近紅外熒光探針的結(jié)構(gòu)如下:亞甲基藍(lán)、噁嗪750可用作間接熒光測定芳香類化合物,噁嗪750可與人血清蛋白相結(jié)合,測定人血清蛋白其檢出限可達(dá)0.13pmol。耐爾紅可非共價(jià)地標(biāo)記蛋白質(zhì),檢出限可達(dá)到0.1ng/mL(S/R=3)；也可作為熒光探針檢測水溶液中DDT型殺蟲劑,適用于μg/mL的范圍,選擇性較好。酞菁類熒光染料及其應(yīng)用

酞菁環(huán)組成二維的共軛π－電子體系,在此體系中,18個(gè)π－電子分別于