食品中常見病原菌微生物檢驗(yàn)技術(shù)

關(guān)于食品中常見病原菌微生物檢驗(yàn)技術(shù)第1頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

我國衛(wèi)生部頒布的食品微生物指標(biāo)有菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌三項(xiàng)。致病菌：能夠引起人類發(fā)病的細(xì)菌。對不同的食品和不同的場合，應(yīng)該選擇一定的參考菌群進(jìn)行檢驗(yàn)。第2頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

一、生物學(xué)特性

是一大群在血清學(xué)上相關(guān)的革蘭氏陰性桿菌，無芽孢、無莢膜，周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)的需氧或兼性厭氧短桿菌。

最適生長溫度為35℃～37℃，最適pH為7.2～7.4，較抗寒，能耐受較高鹽濃度。第一節(jié)沙門氏菌檢驗(yàn)技術(shù)第3頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六不分解乳糖（亞利桑那菌除外）。分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣（傷寒沙門菌產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）。多數(shù)產(chǎn)生H2S，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，不液化明膠，不分解尿素，不產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，多數(shù)能利用枸櫞酸鹽，能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在氰化鉀培養(yǎng)基上不生長。

沙門菌生物學(xué)性狀

第4頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

目前至少有67種O抗原和2500個(gè)以上血清型,根據(jù)其對宿主的致病性,可分為三類傷寒桿菌副傷寒桿菌(甲、乙、丙)人腸熱癥鼠傷寒桿菌腸炎桿菌豬霍亂桿菌兒童傷寒人、動(dòng)物急性胃腸炎豬霍亂桿菌、丙型副傷寒桿菌鼠傷寒桿菌、腸炎桿菌

敗血癥沙門氏菌屬(Salmonella)第5頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

二、檢驗(yàn)所需器材第6頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六三、檢驗(yàn)程序第7頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第8頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六沙門氏菌檢驗(yàn)程序2010第9頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第10頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六SN方法：以無菌方式進(jìn)行多點(diǎn)取樣25g+225ml緩沖蛋白胨水，經(jīng)37℃水浴4h培養(yǎng)，進(jìn)行非選擇性增菌；確保瀕于死亡的細(xì)菌進(jìn)行復(fù)活。其后移取10ml轉(zhuǎn)種于盛有100ml四硫磺酸鹽煌綠增菌液，經(jīng)42±1℃培養(yǎng)20±2h，進(jìn)行選擇性的增菌；使目的菌優(yōu)勝出來。將增菌液搖勻，以無菌操作，分別接種DHL和BS平板上于37℃培養(yǎng)24±2h，進(jìn)行分離培養(yǎng)；使目的菌分離出來。觀察每個(gè)平板上的菌落，選取3-5個(gè)菌落接種于TSI或尿素酶瓊脂上，于37℃中培養(yǎng)24±2h，進(jìn)行篩選試驗(yàn)；將符合沙門氏菌特征的TSI中的培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃中培養(yǎng)24±2h，進(jìn)行純化培養(yǎng)；選取單個(gè)菌落，接種于20E微量生化管中，進(jìn)行API生化鑒定；同時(shí)取單個(gè)菌落，在潔凈的玻板上，作血清學(xué)鑒定。

第11頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六四、操作方法

分五個(gè)步驟：

1.前增菌2.選擇性增菌3.選擇性平板分離4.生化實(shí)驗(yàn)5.血清型分型鑒定

第12頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六四、操作方法

分五個(gè)步驟：1.前增菌：用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的細(xì)菌恢復(fù)活力;BPW2.選擇性增菌：使沙門氏菌優(yōu)勢繁殖，其它細(xì)菌受到抑制;SC+TTBSC（亞硒酸鹽胱氨酸增菌液）TTB（四硫磺酸鈉煌綠增菌液） 胱氨酸促生長 四硫酸鈉和煌綠抑菌 氯化鎂和孔雀綠抑菌適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長，37℃適合其他沙門菌生長，42℃，18~24h.為防漏檢宜SC+TTB3.選擇性平板分離培養(yǎng)：BS+XLD/HE/顯色培基4.生化試驗(yàn)：（1）初步生化實(shí)驗(yàn)：三糖鐵實(shí)驗(yàn)（2）對疑似沙門氏菌繼續(xù)作系統(tǒng)生化實(shí)驗(yàn)最低限度生化實(shí)驗(yàn)：靛基質(zhì)、尿素、KCN、賴氨酸。鑒定分離出來的細(xì)菌是否符合沙門氏菌的生化譜，可采用API20E等成套生化試劑5.血清型分型鑒定

A-F多價(jià)O血清：把ABCDEF各群含有的共同O抗原的抗體混合起來作成混合血清。位相變異實(shí)驗(yàn)原理：在半固體培養(yǎng)基中加入已知相的血清，使解離出的已知相的菌體和血清發(fā)生反應(yīng)，這樣已知相的菌體就不能運(yùn)動(dòng)了，未知相的菌不能和血清發(fā)生反應(yīng)，能夠運(yùn)動(dòng)，并被解離出來。血清學(xué)鑒定：特異性診斷血清鑒定到種第13頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六（一）增菌培養(yǎng)前增菌稱取25g（mL）樣品放入盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或置于盛有225mLBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min。若樣品為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。如需測定pH值，用1mol/mL無菌NaOH或HCl調(diào)pH至6.8±0.2。無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至500mL錐形瓶中，如使用均質(zhì)袋，可直接進(jìn)行培養(yǎng)，于36℃±1℃培養(yǎng)8h～18h。如為冷凍產(chǎn)品，應(yīng)在45℃以下不超過15min，或2℃～5℃不超過18h解凍。第14頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六增菌

輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)過的樣品混合物，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLTTB內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。同時(shí)，另取1mL，轉(zhuǎn)種于10mLSC內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。第15頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六分離分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個(gè)BS瓊脂平板和一個(gè)XLD瓊脂平板（或HE瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）。于36℃±1℃分別培養(yǎng)18h～24h（XLD瓊脂平板、HE瓊脂平板、沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基平板）或40h～48h（BS瓊脂平板），觀察各個(gè)平板上生長的菌落,各個(gè)平板上的菌落特征見表1。第16頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六<國標(biāo)>檢測沙門氏菌方法分5個(gè)步驟：

1.前增菌：在含有營養(yǎng)的非選擇性培養(yǎng)基中增菌，使受損傷的沙門氏菌細(xì)胞恢復(fù)到穩(wěn)定的生理狀態(tài)。

沙門氏菌檢測中前增菌的目的是使沙門氏菌恢復(fù)其活力。檢測經(jīng)過加工的食品中的沙門氏菌需要前增菌主要因?yàn)榧庸み^程中沙門氏菌受到損傷而處于瀕死狀態(tài)。

第17頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六2.選擇性增菌在含選擇性抑制劑的培養(yǎng)基中，樣品進(jìn)一步增菌。沙門沙門氏菌檢測中增菌的目的是使沙門氏菌以外的細(xì)菌（主要是艾希氏菌屬）受到抑制，而使沙門氏菌得到一定的增殖，提高沙門氏菌的檢出率。

第18頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六3.選擇性平板分離

劃線接種于：BS和XLD瓊脂平板或HE瓊脂平板各一個(gè)，于36+1℃分別培養(yǎng)18—24小時(shí)(XLD、HE)或40—48小時(shí)(BS)。

這一步采用固體選擇性培養(yǎng)基，抑制非沙門氏菌的生長，提供肉眼可見的疑似沙門氏菌純菌落的識(shí)別。第19頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六亞硫酸鉍瓊脂(BS瓊脂)上典型特征

第20頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂上典型特征

第21頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六HE瓊脂上典型特征

第22頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六（三）生化試驗(yàn)挑取選擇性瓊脂平板上的可疑菌落，接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中。在三糖鐵瓊脂內(nèi)，各菌屬的主要反應(yīng)結(jié)果如表5—3。表5—2說明在三糖鐵瓊脂內(nèi)只有斜面產(chǎn)酸同時(shí)H2S陰性的菌株可排除，其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌的可能，同時(shí)均有不是沙門氏菌的可能，都需要作進(jìn)一步的生化試驗(yàn)，必要時(shí)作涂片染色鏡檢(沙門氏菌為革蘭氏陰性短桿菌)。第23頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六4.生物化學(xué)試驗(yàn)篩選

挑取選擇性瓊脂平板上的可疑菌落，接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中。排除大多數(shù)非沙門氏菌。也提供了沙門氏菌培養(yǎng)物菌屬的初步鑒定。

第24頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六TSI(三糖鐵)培養(yǎng)基大腸桿菌和沙門氏菌第25頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果

第26頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六沙門菌常用生化試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)陰性（黃）陽性（紅）第27頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六靛基質(zhì)

對照管陰性(－)陽性(＋)第28頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第29頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第30頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應(yīng)結(jié)果見表2。

表2說明，在三糖鐵瓊脂內(nèi)斜面產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，同時(shí)賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陰性的菌株可以排除。其他的反應(yīng)結(jié)果均有沙門氏菌屬的可能，同時(shí)也均有不是沙門氏菌屬的可能。

第31頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

2

、接種蛋白胨水（供做靛基質(zhì)試驗(yàn)）尿素瓊脂（pH7.2）氰化鉀（KCN）將已挑菌落的平板儲(chǔ)存于2℃-5

℃

或室溫至少保留24h，以備必要時(shí)復(fù)查。

第32頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六P150（1）

A1：典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如尿素、氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項(xiàng)中有1項(xiàng)異常，按表可判定為沙門氏菌屬。如有2項(xiàng)異常，為非沙門氏菌屬。

（2）A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門氏菌靛基質(zhì)陽性變體兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。

（3）A3：補(bǔ)做ONPG。ONPG陰性為沙門氏菌，同時(shí)賴氨酸脫羧酶陽性，甲型副傷寒沙門氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。

（4）必要時(shí)進(jìn)行沙門氏菌生化群的鑒別。

第33頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六醇發(fā)酵試驗(yàn)第34頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六陽性（黃）陰性

鄰硝基酚β－半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)）

第35頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六鄰硝基酚β－半乳糖苷酶試驗(yàn)（ONPG試驗(yàn)）

(1)原理：乳糖發(fā)酵過程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些細(xì)菌只有半乳糖苷酶，因而只能遲緩發(fā)酵乳糖，所有乳糖快速發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的細(xì)菌均可快速水解鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黃色的鄰硝基酚。用于枸櫞酸菌屬、亞利桑那菌屬與沙門菌屬的鑒別。

(2)方法：將待試菌接種于ONPG肉湯中，35℃水浴或孵箱孵育18~24h，觀察結(jié)果。(3)結(jié)果：呈現(xiàn)亮黃色為陽性，無色為陰性。(4)應(yīng)用：可用于遲緩發(fā)酵乳糖細(xì)菌的快速鑒定，本法對于迅速及遲緩分解乳糖的細(xì)菌均可短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)陽性。埃希菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、哈夫尼亞菌屬、沙雷菌屬和腸桿菌屬等均為試驗(yàn)陽性，而沙門菌屬、變形桿菌屬和普羅威登斯菌屬等為陰性。第36頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六腸桿菌科各屬生化反應(yīng)初步鑒別表

第37頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六接種三糖鐵瓊脂的同時(shí)，還要接種蛋白胨水，pH7.2尿素瓊脂、KCN培養(yǎng)基和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各一管，于36+1℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，必要時(shí)可延長至48小時(shí)，按表5-3判定結(jié)果。沙門氏菌的結(jié)果應(yīng)屬于A1、A2和B1，其他五種反應(yīng)結(jié)果均可以排除。反應(yīng)序號(hào)A1，典型反應(yīng)判定為沙門氏菌屬。如果尿素、KCN和賴氨酸三項(xiàng)中有一項(xiàng)異常，按表5-4仍可判定為沙門氏菌，如有兩項(xiàng)異常，則按A3判定為枸櫞酸桿菌。第38頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六5.血清學(xué)分型鑒定

提供培養(yǎng)物菌種的鑒定。

用分離出的沙門氏菌與已知A-F多價(jià)O血清及H因子進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)。1）抗原的準(zhǔn)備2）O抗原的鑒定用A—F多價(jià)O血清做玻片凝集試驗(yàn)，以生理鹽水做對照。3）H抗原的鑒定4）Vi抗原的鑒定第39頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六（五）菌型的判定和結(jié)果報(bào)告

綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果，按照常見沙門氏菌抗原表及其補(bǔ)充表判定菌型，并報(bào)告結(jié)果。若結(jié)果為陰性，則報(bào)告為“未發(fā)現(xiàn)沙門氏菌”。目前，對于沙門氏菌的檢驗(yàn)技術(shù)已有很大進(jìn)展．一些快速檢驗(yàn)方法已有應(yīng)用。如熒光抗體技術(shù)檢驗(yàn)食品中沙門氏菌已在國際二得到公認(rèn)，其些國家作為商品生產(chǎn)的熒光抗體試劑箱．即可應(yīng)用于沙門氏菌的快速檢驗(yàn)。我國在這方面也取得一定的進(jìn)展，如固相載體吸附免疫技術(shù)、免疫染色法，酶聯(lián)A蛋白染色等快速檢驗(yàn)方法均具有快速、方便、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，還有許多新方法、新技術(shù)仍處在實(shí)驗(yàn)和研究階段，有待于我們?nèi)パ芯刻接懀员愀梅?wù)于實(shí)踐。

第40頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

指示系統(tǒng) 指示效果及可疑菌落特點(diǎn)BS 葡萄+H2S 黑色有金屬光澤、棕褐或灰色，周圍培基黑或棕色，或不產(chǎn)硫化氫而呈灰綠色DHL 乳糖+H2S 乳糖（+）：粉紅色，（-）：無色半透明無色半透明，產(chǎn)硫化氫者中心黑色SS 乳糖+H2S HE 乳糖+H2S 乳糖（+）：黃色，（-）：藍(lán)色藍(lán)綠色或藍(lán)色，產(chǎn)硫化氫者中心黑色第41頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六沙門氏菌檢測

－－概述原理：沙門氏菌為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，一般無莢膜，周生鞭毛（雞白痢和雞傷寒沙門氏菌除外）。兼性厭氧，最適生長溫度37℃。在普通顯微鏡下和在普通培養(yǎng)基中不能與大腸桿菌進(jìn)行區(qū)分。但沙門氏菌不發(fā)酵乳糖，在腸道菌鑒別培養(yǎng)基上形成無色透明菌落，而易與大腸桿菌區(qū)別。沙門氏菌有著復(fù)雜的抗原構(gòu)造，一般分為菌體（O）抗原、鞭毛（H）抗原和毒力（Vi）抗原三種。沙門氏菌屬包括2000個(gè)以上血清型，但多數(shù)國家從人體、動(dòng)物和食品中經(jīng)常分離到有40～50種血清型。致病性中毒現(xiàn)象第42頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六沙門氏菌檢測

－－檢測方法GB前增菌，用無選擇性的培養(yǎng)基使處以瀕死狀態(tài)的沙門氏菌恢復(fù)活力選擇性增菌，使沙門氏菌得以繁殖，而大多數(shù)的其他細(xì)菌受到抑制選擇性平板分離沙門氏菌生化試驗(yàn)，鑒定到屬血清學(xué)分類型鑒定。第43頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六沙門氏菌檢測

－－注意事項(xiàng)結(jié)果記錄現(xiàn)象觀察：菌落特征、革蘭氏染色、BS瓊脂、HE瓊脂、SS瓊脂、三糖鐵瓊脂常見問題：第44頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六SC（亞硒酸鹽胱氨酸增菌液） TTB（四硫磺酸鈉煌綠增菌液） MM亞硒酸鹽抑菌胱氨酸促生長 四硫酸鈉和煌綠抑菌 氯化鎂和孔雀綠抑菌適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌生長，37℃ 適合其他沙門菌生長，42℃，18~24h為防漏檢宜SC+TTB/MM第45頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征

第46頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

第二節(jié)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)技術(shù)

金黃色葡萄球菌第47頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

近年來，美國疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。

金黃色葡萄球菌腸毒素是個(gè)世界性衛(wèi)生問題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%，我國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)第48頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六金黃色葡萄球

葡萄球菌表皮葡萄球菌屬分類：腐生葡萄球菌

金黃色葡萄球菌食物中毒系毒素型食物中毒。是由于進(jìn)食含有一種或多種含葡萄球菌腸毒素的食物所引起。常見的菌為金黃色葡萄球菌。第49頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六致病性

葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引起的疾病，可引發(fā)不同程度的急性胃腸炎癥狀，惡心、嘔吐最為突出而且普遍，腹痛、腹瀉次之。當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時(shí)，經(jīng)8-10小時(shí)即可相當(dāng)數(shù)量的腸毒素。第50頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六雪印牛奶中毒事件2000年6月29日起，日本雪印公司奶粉、低脂肪牛奶、酸奶等3種牛奶制品被查出金黃色葡萄球菌毒素，造成1.5萬名消費(fèi)者中毒原因是在北海道的奶粉生產(chǎn)工廠（該廠的產(chǎn)品都是先制成奶粉，再在各地工廠還原成牛奶）出現(xiàn)了停電，使生產(chǎn)線上的原料停留過久，所以出現(xiàn)了細(xì)菌超標(biāo)。2001年以后-借助其他公司支援開始分割公司事業(yè)。2002年雪印食品被解散第51頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六一、生物學(xué)特性

革蘭氏陽性需氧或兼性厭氧菌，為球菌，排列成葡萄狀，無芽孢、鞭毛，不運(yùn)動(dòng)；大多數(shù)無莢膜。最適生長溫度37℃，最適pH為7.4，對熱抵抗力較強(qiáng)，80℃30min才能被殺死。

可在10%-15%氯化鈉和40%膽汁中生長第52頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六生物學(xué)特性

好氧生長的細(xì)胞產(chǎn)生接觸酶；產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多數(shù)菌株可水解天然的動(dòng)物蛋白，例如血紅蛋白、纖維蛋白、卵白、酪朊和多肽類如明膠，水解脂類、吐溫類和磷脂蛋白質(zhì)，并釋放脂肪酸。

所有的毒株產(chǎn)生凝固酶，人和動(dòng)物來源的菌株通?？赡掏?、人、馬和豬的血漿。第53頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六生物學(xué)特性---培養(yǎng)特征大多數(shù)菌株產(chǎn)生類胡蘿卜素，使細(xì)胞團(tuán)呈現(xiàn)出深橙色到淺黃色，色素的產(chǎn)生取決于生長的條件，而且在單個(gè)菌株中可能也有變化可分解葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)弱陽性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。具有較強(qiáng)的抵抗力，對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等高度敏感。第54頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六致病性金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見的病原菌，臨床表現(xiàn)多種多樣，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、胃腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。第55頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

致病力強(qiáng)弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶：a.溶血毒素：外毒素，分甲、乙、丙、丁、戊五種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死；b.殺白細(xì)胞素：可破壞人的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；c.血漿凝固酶：侵入人體時(shí)，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細(xì)胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān)；d.脫氧核糖核酸酶：產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌；e.腸毒素：產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，現(xiàn)已鑒定出葡萄球菌腸毒素有A、B、C1～C3、D、E、G、H共9種。腸毒素A是最常見的。

金黃色葡萄球菌的致病性第56頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六葡萄球菌皮膚感染第57頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六食物中毒癥狀及發(fā)生原因：癥狀原因

惡心、反復(fù)嘔吐，中上腹部疼痛，伴有頭暈、頭痛，腹瀉、發(fā)冷。嚴(yán)重者可導(dǎo)致大量失水而虛脫。

葡萄球菌污染了食品，在適合的pH值和溫度（最適范圍內(nèi)）下大量繁殖，產(chǎn)生腸毒素。第58頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六二、檢驗(yàn)所需培養(yǎng)基10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯7.5%氯化鈉肉湯血瓊脂平板Baird-Parker瓊脂平板腦心浸出液肉湯(BHI)兔血漿磷酸鹽緩沖液營養(yǎng)瓊脂小斜面革蘭氏染色液無菌生理鹽水第59頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六三、檢驗(yàn)程序GB4789.10-2010標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于食品中金黃色葡萄球菌的定性檢驗(yàn)；第二法適用于金黃色葡萄球菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)；第三法適用于金黃色葡萄球菌含量較低而雜菌含量較高的食品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)。第60頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第一法第61頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六檢樣

25g樣品+225ml

7.5%NaCl肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯血平板36±1℃

24hr

鏡檢營養(yǎng)肉湯血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果定性檢測36±1℃

24hr

36±1℃

24hr

36±1℃6hr

BP平板第一法第62頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第二法Baird-Parker平板法檢驗(yàn)程序定量檢測（平板法）適用于檢測金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（mL）的食品第63頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六25g樣品+225ml生理鹽水

選三個(gè)連續(xù)梯度，每個(gè)梯度分別取1mL接種之至表面干燥的BP平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）平板計(jì)數(shù)（分別記錄每種類型的菌落數(shù)）36±1℃

48hr

鏡檢營養(yǎng)肉湯血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果金葡菌數(shù)/g(mL)定量檢測（平板法）每種類型至少選取一個(gè)菌落36±1℃

24hr

36±1℃

6hr

適用于檢測金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（mL）的食品梯度稀釋第64頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第三法金黃色葡萄球菌MPN檢驗(yàn)程序

定量檢測（MPN法）第65頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六25g樣品+225ml生理鹽水

選三個(gè)連續(xù)梯度，每個(gè)梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉湯36±1℃

45-48hr

BP平板血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)查MPN表定量檢測（MPN法）36±1℃

45-48h

報(bào)告結(jié)果

適用于檢測可能含有少量金黃色葡萄球菌，卻帶有大量競爭菌的樣品梯度稀釋第三法金黃色葡萄球菌MPN檢驗(yàn)程序第66頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六金黃色葡萄球菌的檢測－－測定方法國標(biāo)方法注意事項(xiàng)現(xiàn)象觀察：染色鏡檢（形態(tài)、染色）表面光滑的菌落，菌落色素不穩(wěn)定，但多數(shù)為金黃色。

Baird-Parker瓊脂平板（BP平板）、血平板、血漿凝固酶試驗(yàn)多數(shù)產(chǎn)腸毒素的菌株在血瓊脂平板上能形成溶血圈，并能產(chǎn)生血漿凝固酶，這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)。第67頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六四、操作方法1.增菌培養(yǎng)法（1）檢樣處理將25g（mL）檢樣加于225mL滅菌生理鹽水中的滅菌器內(nèi)，制成1：10檢樣混懸液。（2）增菌培養(yǎng)吸取液體檢樣5ml，接種于50mL7．5％氯化鈉肉湯50ml進(jìn)行增菌。（3）分離培養(yǎng)將上述培養(yǎng)物，分別劃線接種到Baird-Parker平板和血平板。血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

Baird-Parker平板36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h或45h～48h。第68頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六檢測步驟---增菌利用金黃色葡萄球菌耐鹽的特性（可耐受15%的氯化鈉），用含7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯第69頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六（4）觀察菌落形態(tài)

Baird-Parker平板、血平板上挑取可疑菌落。金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直徑為2mm～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明圈。用接種針接觸菌落有似奶油至樹膠樣的硬度，偶然會(huì)遇到非脂肪溶解的類似菌落；但無混濁帶及透明圈。在血平板上，形成菌落較大，圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色（有時(shí)為白色），菌落周圍可見完全透明溶血圈。第70頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六檢測步驟---分離BP平板：胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、維生素和痕量礦物元素丙酮酸鈉是一種生長促進(jìn)劑亞碲酸鹽對除金黃色葡萄球外的其他能分解卵黃的菌株有毒性，并使菌落產(chǎn)生黑色卵黃提供營養(yǎng)和有利于觀察卵磷脂環(huán)甘氨酸和氯化鋰對金黃色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。第71頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六Baird－Parker氏培養(yǎng)基-成分胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰(LiCl·6H2O)

5g瓊脂20g蒸餾水950mL

PH7.5第72頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六Baird－Parker氏培養(yǎng)基-增菌劑的配法

30%卵黃鹽水50mL與除菌過濾的1%亞蹄酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。第73頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六Baird－Parker氏培養(yǎng)基-制法將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解。冷至25℃，校正pH。分裝每瓶95mL，121℃高壓滅菌15min。臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，冷至50℃，每95mL加入預(yù)熱至50℃的卵黃亞蹄酸鉀增菌劑5mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲(chǔ)存不得超過48h。第74頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六檢測步驟---分離在BP平板上其典型菌落為：圓形，光滑突起，濕潤，直徑2-3mm，顏色呈灰色到黑玉色，邊緣常為淡色（米黃色或灰白色略帶灰色或黃色的白色），周圍為一混濁帶，在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹膠的粘稠感。偶然會(huì)遇到不分解脂肪菌株，除無混濁帶及透明圈外，其他外觀基本相同。第75頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六B-P平板第76頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六Baird－Parker(BP培養(yǎng)基/貝爾德帕克平板)用于凝固酶陽性葡萄球菌的分離和菌落計(jì)數(shù)用。￥7（90mm)第77頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六Baird－Parker平板是一種選擇性培養(yǎng)基，在含有氮源的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充了促進(jìn)細(xì)菌生長的丙酮酸鈉，又含有抑制劑：亞碲酸鉀，故有較好的選擇性。但對于金葡萄球菌沒有抑制，其能將亞碲酸鉀還原為碲在菌落中心呈黑色，易于觀察；加入卵黃，由于卵磷酯酶陽性特征，其菌落周圍可出現(xiàn)一明顯的沉淀環(huán)，以資區(qū)別。第78頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六根據(jù)菌落形態(tài)，作出相應(yīng)的處理或報(bào)告。例如：金黃色葡萄球菌呈圓形、有光澤隆起，中部黑色，邊緣灰色有微透明的渾濁帶；革蘭陽性桿菌呈棕黑色，無光澤有時(shí)在培養(yǎng)48h后也出現(xiàn)渾濁帶；酵母菌為白色無透明環(huán)。第79頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

血平板：金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生溶血素，因此在血平板上產(chǎn)生明顯的溶血環(huán)。血平板上其典型菌落呈金黃色，有時(shí)也為白色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，有溶血圈。第80頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六血平板第81頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六（5）革蘭氏染色鏡檢（6）血漿凝固酶試驗(yàn)挑取Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1個(gè)或以上，分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂斜面，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。取新鮮配置兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入BHI培養(yǎng)物0.2mL～0.3mL，振蕩搖勻，置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝固（即將試管傾斜或倒置時(shí)，呈現(xiàn)凝塊）或凝固體積大于原體積的一半，被判定為陽性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑，按說明書操作，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。結(jié)果如可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI，36℃±1℃培養(yǎng)18h～48h，重復(fù)試驗(yàn)。第82頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六檢測步驟--鑒定金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生凝固酶，因此對其鑒別的主要實(shí)驗(yàn)是測定其凝固酶。對于凝固不完全的菌株，可以通過一些其他實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步確認(rèn)，例如：厭氧葡萄糖發(fā)酵、溶葡萄球菌酶敏感性實(shí)驗(yàn)、耐熱核酸酶實(shí)驗(yàn)等。所有這些實(shí)驗(yàn)不能作為鑒別其產(chǎn)毒與否的依據(jù)。第83頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六血漿凝固酶試驗(yàn)：

吸取1:4新鮮兔血漿0.5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5mL，振蕩搖勻，置36±1℃溫箱或水浴內(nèi)，每半小時(shí)觀察一次，觀察6h，如呈現(xiàn)凝塊,即將試管倒置或傾斜時(shí)，呈現(xiàn)凝塊者，被認(rèn)為陽性結(jié)果。同時(shí)以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯作為對照。第84頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六血漿凝固酶試驗(yàn)血漿凝固試驗(yàn)也可采用玻片法。把兔血漿滴加于載玻片的一端，然后用白金耳挑取菌落與血漿充分混勻、在載玻片另一端以生理鹽水代替血漿做陰性對照?；旌虾罅⒓从^察，若出現(xiàn)凝塊即為陽性。病原性葡萄球菌多數(shù)產(chǎn)生血漿凝固酶，非病原性的一般不產(chǎn)生。因此，該法是判定葡萄球菌有無致病性的重要指標(biāo)。第85頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六血漿凝固酶試驗(yàn)的原理病原性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，使血漿中纖維蛋白原變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附于細(xì)菌表面，生成凝塊，因而具有抗吞噬的作用。凝固酶試驗(yàn)對于判定該菌株是否具有致病力，很有幫助。葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)被廣泛地用于常規(guī)鑒定金黃色葡萄球菌與其他葡萄球菌。葡萄球菌所產(chǎn)生的凝固酶有兩種：結(jié)合凝固酶和游離凝固酶。結(jié)合凝固酶（即凝聚因子）：是一種結(jié)合于菌體細(xì)胞壁的酶，它直接作用于血漿中纖維蛋白原，使之變成纖維蛋白，而使葡萄球菌凝集成塊，玻片法陽性結(jié)果是由此酶（凝聚因子）所致。游離凝固酶：是凝血酶原樣物質(zhì)，不直接作用于血漿纖維蛋白原上，而被血漿中的致活劑（即凝固酶致活因子）激活后，變成耐熱的凝血酶樣物質(zhì)，此物質(zhì)可使血漿中的液態(tài)纖維蛋白原變?yōu)楣虘B(tài)纖維蛋白，從而使血漿凝固。試管法的陽性結(jié)果為此酶所致。第86頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六【方法】（1）玻片法（2）試管法【結(jié)果判斷】（1）玻片法：5～10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。（2）試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。4h后無上述現(xiàn)象出現(xiàn)，則放置過夜后再觀察?！緫?yīng)用】本試驗(yàn)僅用于致病性葡萄球菌的鑒定。第87頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六【方法】（1）玻片法：在1張潔凈玻片中央加1滴9g／L氯化鈉(生理鹽水)溶液，用接種環(huán)取待檢培養(yǎng)物與其混合（設(shè)陽性和陰性對照）制成菌懸液，若經(jīng)10～20s內(nèi)無自凝現(xiàn)象發(fā)生，則加入兔新鮮血漿1環(huán)，與菌懸液混合，觀察結(jié)果。（2）試管法：用生理鹽水將新鮮兔血漿4倍稀釋，取0．5ml于試管再加0.5ml待測菌濃菌懸液（需做陽性對照及陰性對照。），混勻后置37℃水浴中，每30min觀察1次結(jié)果。若3小時(shí)內(nèi)試驗(yàn)管和陽性對照管出現(xiàn)凝固，陰性對照管（即濃菌液管）不凝固，為陽性；若陰性，繼續(xù)觀察到24小時(shí)，不凝固者為陰性?！窘Y(jié)果判斷】（1）玻片法：5～10s內(nèi)出現(xiàn)凝集者為陽性。（2）試管法：如有凝塊或整管凝集出現(xiàn)為陽性。4h后無上述現(xiàn)象出現(xiàn)，則放置過夜后再觀察?！緫?yīng)用】本試驗(yàn)僅用于致病性葡萄球菌的鑒定。第88頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六【注意事項(xiàng)】（1）玻片法：10秒內(nèi)觀察結(jié)果，如超過10秒可出現(xiàn)假陽性，因此必須用試管法驗(yàn)證凝聚因子試驗(yàn)。（2）可選擇的玻片凝集試驗(yàn)法還包括檢測凝集因子和蛋白A的膠乳凝集試驗(yàn)。但膠乳凝集試驗(yàn)和玻片凝固酶試驗(yàn)的結(jié)果并不完全一致。鑒定金黃色葡萄球菌的特異性和靈敏性均高于傳統(tǒng)的玻片凝固酶試驗(yàn)。（3）試管法：須制備濃厚的均勻菌懸液，以便觀察結(jié)果。a.試管法葡萄球菌凝固酶試驗(yàn)陽性者，應(yīng)見到明顯的纖維蛋白凝膠塊，出現(xiàn)羊毛狀或纖維狀沉淀物并非真正凝固，應(yīng)判為陰性。b.如果培養(yǎng)時(shí)間超過4H，應(yīng)考慮以下幾點(diǎn)：Ⅰ.延長培養(yǎng)時(shí)間后，有些菌株產(chǎn)生的葡萄球菌激酶（溶纖維蛋白酶），可以裂解凝塊，產(chǎn)生假陰性結(jié)果；Ⅱ.如果使用的血漿不是無菌的（或部分不是無菌的），假陽性和假陰性結(jié)果均有可能發(fā)生；Ⅲ.所用待測菌不純，延長培養(yǎng)時(shí)間后，污染菌可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。Ⅳ.所用血漿缺乏纖維蛋白原（脫纖維血漿）。（4）最好用EDTA抗凝的兔血漿，不主張用人的抗凝血，兔血漿凝塊結(jié)實(shí)，凝固速度快，優(yōu)于人血漿。（5）試驗(yàn)不可在高鹽培養(yǎng)基上的取菌落，因?yàn)榭赡艹霈F(xiàn)自凝或假陽性。（6）若被檢菌為陳舊的肉湯培養(yǎng)物（超過18～24H），或生長不良，凝固酶活性低的菌株可能檢測不出來。

(7)當(dāng)懷疑待測菌是金黃色葡萄球菌時(shí)，對玻片凝固酶陰性的結(jié)果應(yīng)做試管法凝固酶試驗(yàn)確證。玻片法和試管法凝固酶試驗(yàn)的血漿標(biāo)準(zhǔn)是:必須含有足夠濃度的凝固酶反應(yīng)因子和纖維蛋白原，必須無溶纖維蛋白活性和無抑制劑。第89頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第90頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六一、動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)主要用幼貓和猴。二、血清學(xué)試驗(yàn)?zāi)c毒素作為抗原，可以和特異性抗體發(fā)生結(jié)合性反應(yīng)，產(chǎn)生可見沉淀用血清學(xué)反應(yīng)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌腸毒素方法主要有：免疫瓊脂擴(kuò)散法反向間接血凝試驗(yàn)免疫熒光法酶聯(lián)免疫吸附法

金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測第91頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六對分型進(jìn)行簡單的了解。１、血清學(xué)分型：金黃色葡萄球菌水解，獲得兩種抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。蛋白抗原主要為葡萄球菌A蛋白（SPA)，是一種表面抗原，90%以上金黃色葡萄球菌有此抗原，無特異性。多糖抗原為半抗原，有型特異性。２、噬菌體分型。３、根據(jù)腸毒素分型。４、根據(jù)血漿凝固酶分型。金黃色葡萄球菌的抗原構(gòu)造和分型第92頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六血清學(xué)反應(yīng)可用于檢測食物、培養(yǎng)物或?yàn)V液等標(biāo)本中的細(xì)菌或腸毒素。血清學(xué)反應(yīng)不僅簡便快捷，而且能對毒素做出最后定型：①菌體熒光抗體染色法涂片：食品樣品接種于葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。用接種環(huán)取上述增菌液，涂布于載玻片上。干燥：每一個(gè)培養(yǎng)物涂布3～4個(gè)點(diǎn)，37度培養(yǎng)箱內(nèi)干燥。固定：將干燥好的玻片放在克氏固定液中固定3－5分鐘，再將固定的玻片標(biāo)本放入95％酒精中浸泡1分鐘。第93頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六加抗血清：然后充分干燥，用接種環(huán)取1環(huán)熒光抗血清輕輕加于菌膜上．反應(yīng)：然后37度培養(yǎng)箱內(nèi)作用30分鐘。沖洗浸泡：取出作好的玻片用0.01mol/LPH7.4PBS液沖洗玻片上熒光血清，最后將標(biāo)本放于95％酒精液中浸泡1分鐘左右取出，用熒光顯微鏡鏡檢。有特異性明亮熒光的為陽性或者菌量在一個(gè)視野中有數(shù)個(gè)或十幾個(gè)細(xì)菌以上者為陽性。②毒素的檢出金黃色葡萄球菌毒素的檢出有免疫瓊脂擴(kuò)散法、反向間接血凝法，放射免疫測定法、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、A蛋白血凝試驗(yàn)、核酸探針檢測，乳膠凝集試驗(yàn)等。第94頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六3．腸毒素的測定動(dòng)物試驗(yàn)可用檢樣稀釋液直接作動(dòng)物試驗(yàn)或按以下方法將分離菌株培養(yǎng)制備腸毒素。①腸毒素的制備：腸毒素的制備有固體培養(yǎng)法和液體培養(yǎng)法。②腸毒素測定：注射前應(yīng)先喂給幼貓少量的食物，以便觀察反應(yīng)。取上清液按幼貓?bào)w重每100g1mL的劑量腹腔注射或加大2—3倍量口服。然后仔細(xì)觀察，一般攻毒后0．5～2小時(shí)內(nèi)幼貓發(fā)生嘔吐、腹瀉、體溫上升、畏寒等癥狀，經(jīng)4～5小時(shí)后逐漸恢復(fù)。同時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)用未接種菌的培養(yǎng)基做同樣處理的陰性對照。

第95頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第三節(jié)志賀氏菌檢驗(yàn)技術(shù)志賀氏菌屬（shigella）是人類細(xì)菌性痢疾最為常見的病原菌，通稱痢疾桿菌。通常志賀氏桿菌(Bacillus，shigae)僅指I型痢疾志賀氏菌。志賀氏桿菌是日本志賀詰在1898年首次分離得到的，因此而得名。第96頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

本屬細(xì)菌對理化因素的抵抗力較其他腸道桿菌為弱。對酸敏感，在外界環(huán)境中的抵抗力能以宋內(nèi)氏菌最強(qiáng)，福氏菌次之，志賀氏菌最弱。一般56-60℃經(jīng)10分鐘即被殺死。在37℃水中存活20天，在冰塊中存活96天，蠅腸內(nèi)可存活9-10天，對化學(xué)消毒劑敏感，1%石碳酸15-30分鐘死亡。

第97頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六志賀氏菌屬有四個(gè)血清組，即A。B、C、D。

(1)A群:又稱痢疾志賀氏菌。不發(fā)酵甘露醇。有12個(gè)血清型，其中8型又分為三個(gè)亞型。（2）B群：又稱福氏志賀氏菌。發(fā)酵甘露醇。有15個(gè)血清型（含亞型及變種），抗原構(gòu)造復(fù)雜，有群抗原和型抗原。根據(jù)型抗原的不同，分為6型。（3）C群：又稱鮑氏志賀氏菌。發(fā)酵甘露醇，有18個(gè)血清型，各型間無叉反應(yīng)。（4）D群：又稱宋內(nèi)氏志賀氏菌。發(fā)酵甘露醇，并遲緩發(fā)酵乳糖，一般需要3～4天。只有一個(gè)血清型。引起食物中毒的主要是福氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀菌。第98頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六一、生物學(xué)特性

1．形態(tài)特性

本屬細(xì)菌為兩側(cè)平行、末端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌短桿菌。無芽胞，無莢膜，無鞭毛。多數(shù)有菌毛。

與腸桿菌科各屬細(xì)菌的主要區(qū)別為不運(yùn)動(dòng)。

第99頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。大多數(shù)不發(fā)酵乳糖。vp試驗(yàn)陰性，不分解尿素，不形成硫化氫，不能利用枸櫞酸鹽作為碳源。第100頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六2．培養(yǎng)特性1)需氧或兼性厭氧，但厭氧時(shí)生長不很旺盛。2)對營養(yǎng)要求不高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上易于生長。3)在10℃-40℃范圍內(nèi)可生長。最適溫度為37℃左右。最適pH值為7.2。4）在固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18-24小時(shí)后，形成圓形、隆起、透明，直徑2-3mm、表面光滑、濕潤、邊緣整齊的菌落。第101頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六3．生化特性注：＋：陽性；－陰性；－/＋多數(shù)陰性，少數(shù)陽性；（＋）遲緩陽性；d有不同生化型。福氏志賀氏6型生化特性與A群和C群相似。第102頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六4．血清學(xué)特性

利用O抗原的復(fù)雜性可將志賀氏菌分成A、B、C、D四群，每一群又可利用O抗原進(jìn)行分型。志賀氏菌四個(gè)亞群各具有不同的抗原構(gòu)造，都是由菌體抗原(O)及表面抗原(K)所組成。

第103頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六二、檢驗(yàn)所需器材第104頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

檢樣

25g（或25mL）樣品+志賀氏菌增菌肉湯225mL

41.5℃±１℃，

16h～20h厭氧培養(yǎng)

XLD

MAC或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基

36℃±１℃，20h～48h挑取可疑菌落

TSI，半固體，營養(yǎng)瓊脂斜面

血清學(xué)分型生化鑒定

志賀氏菌屬分群及分型結(jié)果報(bào)告

三、檢驗(yàn)程序GB4789.5-2012第105頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六

志賀氏菌檢驗(yàn)程序第106頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六四、操作方法

1.增菌2.分離3.初步生化試驗(yàn)4.生化試驗(yàn)及附加生化試驗(yàn)5.血清學(xué)鑒定第107頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六1.增菌以無菌操作取檢樣25g（mL），加入裝有滅菌225mL志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min-10000r/min均質(zhì)；均質(zhì)袋用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì)1min-2min，液體樣品振蕩混勻即可。于41.5℃±１℃，厭氧培養(yǎng)16h-20h。第108頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六2.分離

取增菌后的志賀氏增菌液分別劃線接種于XLD瓊脂平板和MAC瓊脂平板或志賀氏菌顯色培養(yǎng)基平板上，于36℃±1℃培養(yǎng)20h-24h，觀察各個(gè)平板上生長的菌落形態(tài)。宋內(nèi)氏志賀氏菌的單個(gè)菌落直徑大于其他志賀氏菌。若出現(xiàn)的菌落不典型或菌落較小不易觀察，則繼續(xù)培養(yǎng)至48h再進(jìn)行觀察。

第109頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六志賀氏菌在不同選擇性瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊脂平板

志賀氏菌的菌落特征MAC瓊脂

無色至淺粉紅色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊XLD瓊脂

粉紅色至無色，半透明、光滑、濕潤、圓形、邊緣整齊或不齊

第110頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六3.初步生化試驗(yàn)

挑取平板上的可疑菌落；接種三糖鐵和營養(yǎng)瓊脂斜面和半固體培養(yǎng)基各1管。志賀氏菌在三糖鐵培養(yǎng)基中表現(xiàn)為底層產(chǎn)酸、不產(chǎn)氣，斜面產(chǎn)堿，不產(chǎn)H2S。無動(dòng)力，固體管內(nèi)沿穿刺線生長。

第111頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六4.生化試驗(yàn)

β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗(yàn)。必要時(shí)還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉子糖、甘油試驗(yàn)，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗(yàn)。生化反應(yīng)不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬。表2志賀氏菌屬四個(gè)群第112頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六4.生化試驗(yàn)

β-半乳糖苷酶、尿素、賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶以及水楊苷和七葉苷的分解試驗(yàn)。除宋內(nèi)氏志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌13型的鳥氨酸陽性;宋內(nèi)氏菌和痢疾志賀氏菌1型，鮑氏志賀氏菌13型的β-半乳糖苷酶為陽性以外，其余生化試驗(yàn)志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性結(jié)果。另外由于福氏志賀氏菌6型的生化特性和痢疾志賀氏菌或鮑氏志賀氏菌相似，必要時(shí)還需加做靛基質(zhì)、甘露醇、棉子糖、甘油試驗(yàn)，也可做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗(yàn)，應(yīng)為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應(yīng)不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬。表2志賀氏菌屬四個(gè)群第113頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第114頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六5.血清學(xué)試驗(yàn)

挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗(yàn)。先用四種志賀氏菌多價(jià)血清檢查。P166表6-8福氏志賀氏菌各型和亞型抗原和群抗原表6-9志賀氏菌屬四個(gè)群的生化特征第115頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六5、快速診斷法

1．熒光菌球法：適于檢查急性菌痢的糞便標(biāo)本。將標(biāo)本接種于含有熒光素標(biāo)記的志賀氏菌免疫血清液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4～8小時(shí)。如標(biāo)本中有相應(yīng)型別的痢疾桿菌，繁殖后與熒光素抗體凝集成小菌球，在低倍或高倍熒光顯微鏡下易于檢出。方法簡便、快速，有一定的特異性。

2．協(xié)同凝集試驗(yàn)：用志賀氏菌的lgG抗體與富含A蛋白的葡萄球菌結(jié)合，以此為試劑，測定患者糞便濾液中志賀氏菌的可溶性抗原。第116頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第四節(jié)肉毒梭狀芽孢桿菌檢驗(yàn)技術(shù)第117頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六一、生物學(xué)特性1.肉毒梭菌肉毒梭菌屬于厭氧性梭狀芽孢桿菌，形成芽孢，比菌體寬，呈梭狀，為革蘭氏陽性粗大桿菌，兩端鈍圓，無莢膜，周身有4～8根鞭毛，能運(yùn)動(dòng)。28～37℃生長良好，最適pH6～8，當(dāng)pH值低于4.5或大于9.0時(shí)，或當(dāng)環(huán)境溫度低于15℃或高于55℃時(shí)，肉毒梭菌芽孢不能繁殖，也不產(chǎn)生毒素。第118頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六肉毒梭菌加熱80℃，30min或100℃10min即可殺死。但其芽孢抵抗力強(qiáng)，煮沸后要6h，105℃2h，110℃36min，120℃4-5min才能將其殺死。第119頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六肉毒梭菌生命力很強(qiáng)，并廣泛存在于自然界，特別是土壤中，易污染食品，于適宜條件下可在食品中產(chǎn)生劇烈的肉神經(jīng)毒素（又稱肉毒毒素），能引起以神經(jīng)麻痹為主要癥狀且死亡率極高的食物中毒。第120頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六肉毒素是目前所知的最強(qiáng)烈的細(xì)菌外毒素。故肉毒梭菌的檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)主要是其毒素。均以毒素的檢測及定型試驗(yàn)為判定的主要依據(jù)。引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。在美國以罐頭發(fā)生中毒較多，日本以魚制品較多，中國主要以發(fā)酵食品最多，如臭豆腐、豆瓣醬、面醬等。第121頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六第122頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六中毒時(shí)癥狀及來源：癥狀：最初為頭暈、無力、隨即出現(xiàn)眼肌痙攣，繼之張口、伸舌困難，最后出現(xiàn)呼吸肌麻痹等。來源：帶菌土壤、塵埃及糞便。尤其是帶菌土壤污染多種食品原料。第123頁，共142頁，2022年，5月20日，16點(diǎn)0分，星期六預(yù)防措施：（1）在食品加工過程中，應(yīng)使用新鮮的原料，避免泥土污染。（2）生產(chǎn)罐頭食品等真空食品時(shí)，必須徹底滅菌。（3）加工后的食品應(yīng)避免再污染和在較低的溫度下或缺氧條件下存放，應(yīng)放在通風(fēng)和涼快的地方保存。（