組織培養(yǎng)基本技術與基本知識

組織培養(yǎng)2005.10.15目錄前言 第一章基本技術 第一節(jié)原代細胞單層靜止培養(yǎng)的設備與器材準備 一、 設備與器材二、器材的清洗第二節(jié)原代細胞單層旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設備與器材準備 11一、設備與器材二、器材的清洗第三節(jié)組織培養(yǎng)用水的制備和各種溶液的配制 1一、 水（雙蒸水、三蒸水或去離子水）一、漢克氏（Hanks）原液和漢克氏液三、 0.5%水解乳蛋白---漢-克氏液（簡稱乳漢液）的配制四、 7.5%的碳酸氫鈉（NaHCO3）配制五、 胰蛋白酶的配制六、 犢牛血清的制備七、 每毫升含1萬單位雙抗（青霉素與鏈霉素）的配制八、 每毫升5萬單位制霉菌素的配制九、 營養(yǎng)液與維液的配制第四節(jié)器物與溶液的包裝、滅菌和無菌操作 一、包裝與滅菌一、無菌操作第五節(jié)無菌檢驗 第六節(jié)原代單層細胞的制備 第七節(jié)細胞計數(shù)和染色 一、細胞計數(shù)一、細胞染色第八節(jié)培養(yǎng)細胞的觀察 一、培養(yǎng)細胞的生長和繁殖一、在單層細胞培養(yǎng)中細胞的形態(tài)觀察第九節(jié)原代單層細胞培養(yǎng)中應注意的問題 一、應注意的問題二、可能會出現(xiàn)的問題第二章在組織培養(yǎng)的細胞中病毒的接種與毒價的滴定（測定） 31第一節(jié)在組織培養(yǎng)的細胞上病毒的接種方法 一、用敏感細胞分離病毒二、病毒在敏感細胞中的傳代三、接種后細胞病變（CPE）的觀察與判定標準第二節(jié)在組織培養(yǎng)細胞中病毒毒價的測定 一、 病毒毒價測定操作方法二、 半數(shù)細胞病變終點（TCID50）計算第三章基本知識 第一節(jié)影響離體細胞生長繁殖的一些因素 一、溫度二、氫離子濃度三、 水四、 滲透壓與無機鹽類A、細胞所需無機鹽離子的作用B、無機鹽類對平衡滲透壓和維持pH的作用五、 氣體六、 細胞接種濃度七、 容器轉(zhuǎn)動速度第二節(jié)細胞的營養(yǎng)物質(zhì) 一、碳水化合物二、 氨基酸和水解乳白蛋白三、 血清（一） 、血清的作用（二） 、與血清有關的幾個問題四、 維生素第三節(jié)消化液的應用 一、胰蛋白酶二、 乙烯二胺四乙酸(VerseneEDTA)三、 膠原酶四、Pronase第四節(jié)抗菌素的應用 一、青霉素二、鏈霉素第五節(jié) 傳代細胞與細胞懸浮培養(yǎng)---一、傳代細胞二、細胞懸浮培養(yǎng)第四章附錄 TOC\o"1-5"\h\z附錄I豬瘟兔化弱毒細胞凍干疫苗(旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng))制造及檢驗辦法^ 65附錄II禽苗的雞胚纟田胞苗試制 67附錄III應用驢胎肺等二倍體細胞生產(chǎn)馬傳染性貧血病瓊脂擴散反應抗原操作方法 68前言為了適應我國畜牧業(yè)的發(fā)展，防止各種畜、禽流行病的爆發(fā)和流行，需要生產(chǎn)大量的家畜家禽的各種疫苗，而目前不少疫苗的生產(chǎn)尚未探取組織培養(yǎng)的方法，存在著成本高，費人力，勞動強度大，有些疫苗的原料比較難于得到或需要耗費較多的家畜或家禽，例如狂犬疫苗的生產(chǎn)，目前還是采用綿羊的腦子來制造，一只羊只有腦子能利用。因此，國內(nèi)有不少獸醫(yī)生物制品廠和研究單位已探取組織培養(yǎng)的方法生產(chǎn)各種疫苗。例如：豬瘟疫苗的生產(chǎn)，原采用乳兔和黃牛進行生產(chǎn)，而現(xiàn)在已推廣仔豬腎細胞組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)，一對仔豬腎所生產(chǎn)的苗就相當于以前500—1000只乳兔或30—40頭黃牛所生產(chǎn)的量，這不僅使成本成倍的下降，原料易得，節(jié)省了人力，而且使勞動強度大大減輕。除此之外，口蹄疫甲型和乙型的組培滅能苗和甲型組培弱毒苗已進行試生產(chǎn)，豬水泡病的組培弱毒苗與組培反映苗也正在進行試制。雞馬力克氏病和新城疫I系和II系組培苗許多單位在進行試驗，并已取得可喜成果。另外如鴨瘟、羊痘等組培苗的生產(chǎn)也在進行試驗，并已看到初步苗頭。以上的簡略介紹僅涉及到組織培養(yǎng)技術在動物疫苗生產(chǎn)方面的應用，而這一技術在免疫學和病毒學中還有著許多方面的應用，如病毒性疾病的診斷；馬傳染性貧血病的診斷抗原—補體結(jié)合反應抗原和瓊脂擴散反應抗原，在國內(nèi)乃是行之有效而廣泛采用的方法。利用組織培養(yǎng)：細胞作中和試驗以診斷一些病毒性也是經(jīng)常采用的。另外組織培養(yǎng)技術在病毒的分離、監(jiān)定和繁殖規(guī)律：研究以及病毒毒價的測定等方面都是不可缺少的手段。尤其當用于醫(yī)學時，組織培養(yǎng)方法能夠克服在人醫(yī)中不能用人進行實驗的困難。組織培養(yǎng)技術除了在病毒學和免疫學和醫(yī)學中有多方面應用外，其應用范圍還極其廣泛。如細胞學、腫瘤學、藥理學等方面以成為不可缺少的工具，而且在遺傳學、發(fā)生學、生物化學、生理學、放射生物學等方面也有廣泛的應用價值。然而，事物總是一分為二的。組織培養(yǎng)使組織或細胞在體外生長繁殖以便于進行多方面研究和應用。但是，機體內(nèi)外環(huán)境卻是極為不同的。在體外，則使組織或細胞處于不正常的條件下，必然會引起許多變異。因此，當我們要把體外的實驗結(jié)果應用于機體內(nèi)時，尤其在人醫(yī)方面，必須加以慎重考慮和修正才有其實用價值。不過對我們獸醫(yī)方面用組織培養(yǎng)方法來制造疫苗則問題不大。組織培養(yǎng)既然有如此廣泛和重要的應用，那么究竟什么是組織培養(yǎng)呢？組織培養(yǎng)就是將各種各樣的生物（包括人、動物和植物）的器官組織或細胞從機體中取出，人工培養(yǎng)于各種各樣的玻璃或其它器皿內(nèi)，使組織或細胞在體外得以生存、生長和繁殖人們可以利用這種體外生長的組織或細胞進行各種科學研究或從事病毒疫苗的生產(chǎn)。組織培養(yǎng)技術一般來講，可以分為三個不同水平：即器官水平（器官培養(yǎng)）、組織水平（組織塊培養(yǎng)）和細胞水平（細胞培養(yǎng)）,通常所說的“組織培養(yǎng)”是包括了組織培養(yǎng)與細胞培養(yǎng)二者的通稱，因為二者有時不好絕然分開。所謂組織培養(yǎng)也是由組織中長出細胞來，培養(yǎng)的仍是細胞。我們所要講的也是應用最廣泛的細胞培養(yǎng)。而“器官培養(yǎng)”則是用某些措施使器官的原基，器官或器官的一部分在體外存活、生長、分化，并且保持其原有的結(jié)構(gòu)和功能。組織培養(yǎng)的具體方法是很多的，但歸納起來不外為懸滴培養(yǎng)，器官或組織塊培養(yǎng)、細胞的單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)幾種。在單層培養(yǎng)中又有靜止培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。組織培養(yǎng)的歷史開始于上世紀中。各參考書中都有詳細介紹，閱讀時應注意歷史唯心主義和英雄史觀的影響。組織培養(yǎng)技術與其它科學一樣，是隨著生產(chǎn)實踐的發(fā)展，龍其是醫(yī)學病毒學和免疫學實踐的需要以及其它科學的發(fā)展而經(jīng)歷著產(chǎn)生和發(fā)展的各個階段。目前，組織培養(yǎng)技術已有極大的發(fā)展，已成為現(xiàn)代科學實踐中一項不可缺少的手段。這一技術近年來在我國的獸醫(yī)界中已有了較普遍的使用。第一章基本技術本章所要介紹的基本技術僅指目前國內(nèi)一些獸醫(yī)生產(chǎn)和研究單位所普遍采用的細胞單層培養(yǎng)。包括單層靜止培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)也包括原代細胞培養(yǎng)和傳代細胞培養(yǎng)。第一節(jié)原代細胞單層靜止培養(yǎng)的設備與器材準備一、設備與器材（一）無菌間（或無菌罩或超凈工作臺）1間（或1臺）（二）較大型設備：TOC\o"1-5"\h\z電熱恒溫培養(yǎng)箱1個冰箱（包括普通冰箱和低溫冰箱）各1臺高壓蒸汽消毒器 1臺電熱鼓風干燥箱 1臺恒溫水浴（雙孔或四孔） 1臺離心機（臺式或座地式均可3000—5000轉(zhuǎn)/分）1臺真空泵 1臺普通天平（感量0.1克） 1架離子交換純水器或蒸餾器 1套顯微鏡（普通生物顯微鏡） 1臺

三）解剖器械：鑷子——手術鑷尖頭1把鈍頭1把眼科鑷直頭1把彎頭1把剪刀——手術剪2把眼科剪直頭1把彎頭2把解剖刀——手術刀四）玻璃器皿：2把培養(yǎng)瓶（中性、無色透明硬質(zhì)玻璃、耐高壓）視培養(yǎng)需要而取不同容量的各種瓶，如：克氏瓶500或1000毫升或其它容量方瓶20、25、50或100毫升鹽水瓶500毫升鏈霉素瓶10毫升培養(yǎng)皿2套漏斗1個（大小視過濾物的量而定）燒杯 （50或100毫升）1個細頸三角瓶（50、100毫升或更大，視取材大小而定）1個玻璃杯若干吸管（1毫升、10毫升）各1支注射器（20毫升）1個500毫升或更大的鹽水瓶（或三角瓶盛各種培養(yǎng)液用）若干（五）橡皮制品橡皮塞（號數(shù)視各種培養(yǎng)瓶而定，但應選白色的）各若干橡皮球（大、?。└魅齻€乳膠管（內(nèi)徑約3——4毫米）1米（六）其它1個1個1塊血球記數(shù)板脫脂紗布（13x13厘米2左右，2層厚）1塊棉花、紗布、紙（舊報紙、牛皮紙或硫酸紙）小線繩或紙繩各若干鋁飯盒、菜盒或其它容器（裝較小的培養(yǎng)瓶、橡皮塞等用）若干個架或盤（木制或金屬制均可。放培養(yǎng)瓶用） 若干G6號耐酸玻璃濾器或賽氏濾器（容量為200——500毫升）2個濾板（K級和EK級或EKS級） 若干注射針頭（長約7厘米的粗針頭） 2支器材的清洗在組織培養(yǎng)工作中器材的清洗是一項十分重要和起關鍵作用的工作，它影響到細胞是否能夠培養(yǎng)成功。由于清洗的程序比較麻煩，所用器材又多，因此，本項工作在組織培養(yǎng)中是最費時間和精力的，所以需要耐心和細致。（一）玻璃器皿的清洗培養(yǎng)細胞用的玻璃瓶應采用中性硬質(zhì)玻璃。如為堿性或酸性玻璃在經(jīng)常處理過程中，如高壓時可能會出現(xiàn)局部脫堿或脫酸作用，致使瓶壁有些離子滲入培養(yǎng)液中，可能影響培養(yǎng)液的酸堿度或產(chǎn)生一些對細胞有毒性的物質(zhì)。而某些軟玻璃中含有鉛和砷，這些物質(zhì)對細胞具有很大的毒性，特別是當培養(yǎng)物呈微堿性的條件下它們也會滲入到溶液中去而引起細胞中毒培養(yǎng)細胞用的玻璃瓶除采用中性硬質(zhì)玻璃外，清洗的好壞對細胞培養(yǎng)成功與否是非常關鍵。因為細胞在體外培養(yǎng)是十分嬌嫩的，在瓶中進行培養(yǎng)的時侯，許多物質(zhì)對它都有毒害作用。如自來水中的鉛離子，1/100萬痕量的肥皂殘余，洗液中的鉻離子等等。如瓶中帶有油質(zhì)，也使細胞不能貼壁（細胞一般需要附著一個固體物上才能生長，這個過程就叫貼壁）。因此，在清洗玻璃器皿時，尤其是細胞直接接觸的培養(yǎng)瓶必須十分注意這一問題。清洗玻璃器皿的方法很多，這里僅介紹硫酸重鉻酸鉀溶液（簡稱洗液）,因為它的氧化能力和腐蝕作用極強，但對玻璃的腐蝕作用小，故為一般實驗室所常采用。洗液對衣服皮肉的腐蝕能力亦極強，故在配制與使用時必須嚴防濺到身上，最好預先帶上耐強酸堿手套和雨靴，穿上橡皮或塑料圍裙作為防護。如不小心濺到身上則應立即用自來水沖洗。洗液的配方也是多種多樣的，以下介紹四種：1、 強液：在工業(yè)用濃硫酸中加入5%（重量/體積）的重鉻酸鉀，邊加重鉻酸鉀邊攪拌。2、 中強液：重鉻酸鉀40克加少量水溶解，然后緩慢加入濃硫酸至1000毫升，顏色為黃棕褐色。3、 弱液：重鉻酸鉀100克，蒸餾水1000毫升，加溫溶化冷后緩慢加入濃硫酸100毫升。顏色為棕紅色。應注意不要把水往硫酸中加，而是將濃硫酸加入水中。以上三種配方的洗液具氧化腐蝕能力以第一種最強，依次減弱，使用時應有不同，第一種和第二種洗液使用時，只需將培養(yǎng)物溶液倒干，不一定非把培養(yǎng)物洗凈即可放入，而第三種洗液在使用時，玻璃器皿必須預先用熱肥皂水洗凈，經(jīng)自來水沖洗干凈、瀝干，然后才能浸入，否則該洗液很快失效。近來有人用優(yōu)選法測試不同配方洗液的洗凈效果，得出效果最好的配方為：濃硫酸50%+水50%+重鉻酸鉀5%先將50%的濃硫酸緩緩加入50%量的水中，然后將5%量的重鉻酸鉀加入，攪拌使之溶解，溶解時可加溫。為了延長洗液的使用時間，玻璃器皿最好在放入洗液前刷洗干凈，稍瀝干然后再放入洗液中。強洗液一旦變綠，則表示重鉻酸鉀已經(jīng)還原，喪失了氧化能力，不宜再用，此時可將喪失氧化能力的洗液加熱，然后再加入適量的重鉻酸鉀，重鉻酸鉀溶解后，洗液又恢復為原來的顏色，即可重新使用。洗液缸平時必須加蓋蓋好，以免危險！清洗玻璃器皿的方法也是很多的，有的還十分繁瑣，一般組織培養(yǎng)可采取如下流程：新玻璃器皿應先用自來水或熱肥皂水刷洗干凈，將水瀝干，放入上述洗液中，放過夜，至少浸泡四小時以上，取出用自來水沖洗8-10次，蒸餾水刷洗3次，最后用去離子水（或雙蒸餾水）刷洗2-3次,將水倒去，放在80C烤箱中烤干，然后包裝滅菌。在用自來水沖洗過程中不宜讓水干燥，否則會留下水痕，不宜洗凈。新的玻璃器皿因為是在高溫條件下吹制，表面易析出堿性物質(zhì)，因此在使用前除了按上述過程處理，新的較小的培養(yǎng)瓶在用去離子水處理后，可裝滿去離子水置高壓鍋內(nèi)進行熱壓處理，15磅30分鐘，然后再用去離子水涮洗2次，這樣可進一步除去重金屬離子。然而新的培養(yǎng)瓶第一次使用時效果總是不太好，一瓶在培養(yǎng)一、二次細胞后就會好用了。對已培養(yǎng)過細胞的培養(yǎng)瓶可傾去培養(yǎng)液，如為強洗液則可直接浸泡，如為弱洗液則應用刷子刷洗，瀝干后浸泡入洗液。非培養(yǎng)細胞用的其它玻璃器皿在用過后可用自來水沖洗2-3遍，蒸餾水沖洗3遍，去離子水刷洗2-3次,80C烤干，包裝滅菌即可。對接觸過病毒或發(fā)生過微生物污染的玻璃器皿，清洗前應拔下塞子，將瓶塞、瓶內(nèi)液體連帶瓶子用蒸餾水煮沸消毒滅菌或先高壓（15磅30分鐘）滅菌，然后按上述方法洗滌。也可將瓶塞和瓶內(nèi)液體傾倒于一鍋內(nèi)進行煮沸消毒滅菌而將瓶直接浸入強洗液或中強洗液中，也可浸泡在5%的氫氧化鈉液中。以后的清洗亦如上法。吸管由于管口太細，不宜沖洗，可用真空泵負壓吸水沖洗或用虹吸式吸管沖洗器沖洗，如圖。自來水沖洗畢，可用真空泵負壓吸蒸餾水然后去離子水沖洗，之后放80C烤干、包裝、滅菌。如所用玻璃器皿上有蠟、松香、膠等物質(zhì)，尤其是在利用廢舊疫苗瓶時，清洗前先別打開蓋子，先泡在3-5%磷酸鈉（或?qū)α兹c）中，磷酸鈉可使臘等物質(zhì)與瓶壁脫開，或采用將舊的疫苗瓶或其它包有臘等物質(zhì)的瓶子，同樣不開蓋放水中煮開，漂洗去臘等物質(zhì)，一次不行可煮沸二次，用水漂洗干凈，然后打開蓋按一般新瓶的處理方法進行處理。G6耐酸細菌濾器按所附說明書清洗，一般用溫鹽酸或溫硫酸也可用上述洗液抽濾和浸泡過夜，然后用自來水、蒸餾水和去離子水充分抽濾洗滌。置80C烤干，應注意不要一下就放到80C或更高溫度中，這樣易損壞濾器。培養(yǎng)用的玻璃片，因為體積小而脆，應分別處理。將切割好的蓋片逐片地浸泡于硝酸或上述洗液中，過夜后取出，用自來水充分沖洗，經(jīng)蒸餾水，雙蒸水涮洗后浸泡于分析純的純酒中，用前取出逐片用干凈的綢布擦干，放于培養(yǎng)皿中烤干然后裝瓶中包裝滅菌。（二）橡皮制品的清洗主要是橡皮塞，橡皮塞含有對細胞有毒性的物質(zhì)，尤其是紅色與黑色的橡皮塞毒性更大，不宜采用，一般組培最好采用白色的橡皮塞，培養(yǎng)時盡量不要使培養(yǎng)液與橡皮塞接觸。1、 新的橡皮塞，先經(jīng)自來水洗刷干凈，然后在2%的氫氧化鈉（NaOH）溶液中煮沸20分鐘，用自來水沖洗5-6次；再用1.3%的鹽酸（HCL）溶液煮沸30分鐘，仍用自來水沖洗5-6次，用蒸餾水洗3次。最后用去離子水洗2-3遍，在50-80C的烤箱中烤干、包裝、滅菌?；蛴?%的碳酸鈉（Na2CO3）溶液代替NaOH和HCL，煮沸30分鐘，其佘過程相同。2、 使用過的橡皮塞，先在蒸餾水中煮沸30分鐘，自來水沖洗干凈，然后用蒸餾水、無離子水各沖洗2-3遍，50-80C烤干、包裝、滅菌。其它橡皮用具，凡與細胞可能有接觸者，可采用相同的辦法處理。（三） 解剖器械及其它金屬用品的清洗1、新的解剖器械如有油質(zhì)則應先擦掉，然后用肥皂水加以煮沸去掉油質(zhì)，用自來水沖洗干凈，如系使用過之器械，則可用自來水沖洗干凈，之后立即擦干，以免生銹，或用酒精擦拭干凈，然后放溫箱中使之干燥。解剖器械在使用時應避免在火焰上消毒，以免損壞器械。2、注射針頭用自來水沖洗后用蒸餾水，無離子水沖洗2-3遍，放80C烤干，包裝，滅菌。（四）過濾用紗布塊，新的醫(yī)用脫脂紗布可直接剪成13x13cm2大小的塊（視消化細胞量大小而定），包裝、滅菌。第二節(jié)原代細胞單層旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設備與器材準備應用于旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設備與器材的準備基本與靜止培養(yǎng)一致，現(xiàn)將旋轉(zhuǎn)瓶不同于靜止培養(yǎng)所需設備與器材介紹如下：、設備與器材一）、較大型設備：電熱恒溫培養(yǎng)室1間電動轉(zhuǎn)瓶機1臺轉(zhuǎn)瓶顯微鏡觀察臺1臺二）、解剖器械：理發(fā)剪（代替剪刀）1把（三）、玻璃器皿：培養(yǎng)瓶容量為500、1000、3000、5000、10000、15000、20000毫升園形瓶（如500、1000毫升容量鹽水瓶，3000毫升容量的鹽酸瓶均可。）玻璃管：管壁較厚，直徑6-7毫米（用于管道化）若干。（四）、橡皮制品：橡皮塞，適于培養(yǎng)瓶瓶口大小，若干醫(yī)用優(yōu)質(zhì)橡皮管（白色），直徑約5毫米左右（管道化用）若干。雙聯(lián)球 1-2個（五）、其它：酒精或汽油噴燈 1個二、器材的清洗：與單層靜止培養(yǎng)基本相同，僅轉(zhuǎn)瓶與偏瓶或方瓶略有不同。旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)若要清洗容量較小的瓶（如500與1000毫升鹽水瓶）可與方瓶等一樣于洗液缸中浸泡，容量較大瓶可按瓶容量的1.5%量裝洗液，然后蓋上包有塑料質(zhì)膜的橡皮塞置轉(zhuǎn)瓶機上旋轉(zhuǎn)浸泡1天，然后取下可按一般培養(yǎng)瓶清洗程序清洗、烤干、包扎瓶口和滅菌。第三節(jié)組織培養(yǎng)用水的制備和各種溶液的配制配制及保存溶液應注意以下事項：1、配制溶液之原材料藥品等都必須經(jīng)過試用。藥品一般采用化學純的，標簽要清楚以防混淆。2、配制溶液時所用器具，如燒杯、容量瓶、量筒、漏斗等都應洗涮干凈，最后用蒸餾水或去離子水涮凈、烤干備用。3、稱量藥品力求精確：其誤差應在0.1%之下，稱量過程防止混淆。4、配制平衡鹽溶液（如漢克氏原液）的過程要嚴格按照配制方法順序配制，主要是防止磷酸鈣和碳酸鈣的沉淀，當時就應處理完畢，如發(fā)生疑問的則不要使用，重新進行配制。5、配制溶液用的水（雙蒸水、三蒸水或去離子水）最好使用新鮮的制備時間長的水多會有變化，不宜使用。6、配制溶液的過程，尤其是大量配制的溶液應做好記錄，如批次、材料、份量、消毒、保存、使用情況、配制人等。7、必須注意配制溶液的藥品標簽所注明的含結(jié)晶水的數(shù)量是否與配方相同，如不同則應經(jīng)過計算，得到應加入的量。8、每批溶液配成后均需經(jīng)過試用方可大量使用。9、配好的溶液應立即除菌處理，如高壓滅菌、過濾或加抑菌物質(zhì)，以防雜菌生長。10、 溶液保存過程預防雜菌和溶液變質(zhì)失去效用，故一般保存在較低的溫度中，如4C冰箱（及低溫冰箱），瓶栓應緊閉。11、 保存其間的溶液如發(fā)現(xiàn)細菌污染，或有問題時，則不應使用。一、水（雙蒸水、三蒸水或去離子水）水是組織培養(yǎng)配制各種液體的溶液，也是所用各種玻璃器皿的清洗，尤其是供細胞生長的培養(yǎng)瓶的清洗干凈與否的最后一關。因為水的質(zhì)量好壞將直接影響到組織培養(yǎng)的成敗，對組織培養(yǎng)來說，水的質(zhì)量事關重大，必須充分加以重視，否則會使“前功盡棄”。一般組培用水至少是雙蒸水或三蒸水，更方便的是使用去離子水（即無離子水）。雙蒸水或三蒸水可使用普通金屬蒸餾器之蒸餾水，再經(jīng)玻璃蒸餾器蒸鎦一次。去離子水也最好適用普通蒸餾水經(jīng)離子交換純水器來制備，取其比電阻值為50萬歐姆以上，pH5.5-7之間才符合使用要求。

漢克氏（Hanks）原液（即10倍濃縮）和漢克氏（Hanks）液。1、漢克氏原液配制：一般書中所說漢克氏原液的配制均分甲液和乙液，用時再等量混合。我們現(xiàn)采用一次配成的方法，使用時只需加以稀釋即可。氯化鈉（NaCL氯化鈉（NaCL）80.0克磷酸氫二鈉（Na磷酸氫二鈉（Na2HPO4氯化鉀（KCL）?2H20）0.6克如果12個結(jié)晶水的，則需1.2克）4克磷酸二氫鈉0.6磷酸二氫鈉0.6克硫酸鎂（MgSO4?7H2O）2克葡萄糖10克（如含1個結(jié)晶水，則需11克）無水氯化鈣（CaCL2） 1.4克（如含2個結(jié)晶水，則需1.9克）H2。（雙蒸水或去離子水）加到1000毫升。氯仿（三氯甲烷）2毫升（或加雙抗10萬單位）在配制漢克氏原液時，應將CaCL2先用一小燒杯盛放后，加入約50毫升水（雙蒸水或去離子水），置4C冰箱中溶解，然后用另一較大的容器（2000毫升燒杯或1000毫升容量瓶）按配方順序逐一用雙蒸水或去離子水溶解，必須嚴格注意的是只有前一藥品完全溶解之后，才能加入下一種藥品，否則會產(chǎn)生沉淀（如磷酸氫鈣，磷酸氫鎂），致使?jié)h克氏這一平衡鹽溶液變?yōu)椴黄胶?，則細胞失去合適的生長環(huán)境，細胞就會被破壞。由上至下到葡萄糖逐一溶解完畢之后，才可將已溶解的CaCL2倒入混勻，最后加雙蒸水或去離子水至1000毫升，用濾紙或兩層紗布包兩層脫脂棉過濾（以后者為好）之后，加入氯仿2毫升或雙抗10萬單位，充分振蕩混勻，蓋上瓶栓，包扎瓶□，寫明標簽，放4C冰箱保存。如此配得的是10倍濃縮的漢克氏液。2、漢克氏（Hanks）液的配制將漢克氏原液進行10倍稀釋即成。取漢克氏原液100毫升雙蒸水或去離子水取漢克氏原液100毫升雙蒸水或去離子水896毫升0.5%酚紅液（見后面）4毫升或采取如下配制方法:漢克氏原液100毫升去離子水900毫升酚紅0.02克(即20毫克)先用7.5%碳酸氫鈉(NaHCO3)4滴左右溶解20毫克酚紅結(jié)晶粉末，溶解后加入1000毫升漢克氏液中.此法較采用0.5%酚紅指示劑方便。高壓8磅(1123)30分鐘，或10磅(114-1132)10-20分鐘滅菌，置室溫或37C培養(yǎng)箱中保存三晝夜以檢查有無雜菌生長。3、0.5%酚紅指示劑配制：稱取酚紅結(jié)晶粉末0.5克0.4%(0.1N)氫氧化鈉(NaOH)15毫升雙蒸水或去離子水85毫升將0.5克酚紅放入乳缽中加少量0.4%的NaOH研磨，待溶解后，將所余的0.4%NaOH倒入，使之徹底溶解，然后加入85毫升雙蒸水，用過濾紙過濾。三、 0.5%水解乳蛋白—漢克氏液(簡稱乳漢液)的配制：稱取水解乳蛋白5克漢克氏液1000毫升水解乳蛋白溶解后，分裝500毫升瓶(瓶的大小看每次的常用量)，高壓8磅30分鐘或10磅10-20分鐘滅菌。大批生產(chǎn)時亦可采用0.1-0.3%的乳漢液。四、 7.5%的碳酸氫鈉(NaHCO3)配制：稱取NaHCO37.5克雙蒸水加至100毫升G6耐酸玻璃濾器過濾，也可用8磅30分鐘高壓滅菌，需蓋橡皮塞，為防高壓的塞子蹦掉，橡皮塞子最好用翻□塞并用線繩扎緊。否則NaHCO3會分解成NaoH與CO2,CO2跑掉，使弱堿變成強堿。除菌后，無菌分裝小瓶，分裝最后應做無菌檢驗保存于42冰箱。五、 胰蛋白酶溶液的配制胰蛋白酶或胰酶均可用于消化組織使分散成細胞。國內(nèi)目前有新疆、上海和北京進行生產(chǎn)，通常也使用國外進□的，如Difco(1:250)的和日本的。經(jīng)使用，新疆生物化學研究所生產(chǎn)的胰蛋白酶效果較好。配制胰蛋白酶時應注意各種牌號不同活性的胰蛋白酶需根據(jù)其活性配成最適濃度。所謂“活性”是指每克胰蛋白酶能消化若干克酪蛋白，此酪蛋白數(shù)就是該胰蛋白酶所含的單位，即稱為“活性”。如一克胰蛋白酶可消化250克酪蛋白，則該胰蛋白酶的活性為1：250。配制方法如下：1、活性為1：500的胰酶配制0.125%溶液：稱取1：500的胰酶0.25克漢克氏液200毫升“※”胰蛋白酶（Trypsin與胰酶（Pancreafi）不同，胰酶是由胰臟中提取的初制品，除含有胰蛋白酶外，尚含有胰淀粉胰（Amylopsin）和胰脂酶（Sfeapsin等，但在日常工作中為方便起見常將胰蛋白酶簡稱為“胰酶”。應避免引起誤解。先用少量Hanks液調(diào)化胰酶。然后將剩余的漢克氏液加入，置37C恒溫水浴溶解1小時（時間視溶化程度而定需透徹清亮）。溶解后用塞氏濾器過濾除菌，最后用7.5%Hanks將pH調(diào)至7.6-7.。分裝小瓶（或細□三角瓶）分裝最后需作菌檢，置4C冰箱或低溫冰箱保存。配制的胰酶如欲保存數(shù)月，則可配成10倍濃縮液，保存于低溫下，臨使用再用漢克氏液稀釋和調(diào)pH至7.6—7.8。2.活性為1：250的胰酶配制成0.25%的溶液：稱取1：250的胰酶0.25克漢克氏液100毫升配制方法完全同上。此種胰酶配成0.15—0.2%濃度亦可使用。犢牛血清的制備選擇健康犢牛或乳牛場淘汰的剛出生的犢公牛（一般為初生至六月齡），采血前12小時不予飼喂，僅予喝水。采血時采用頸動脈放血，所用的動脈插管（或采血針頭、乳膠管、玻璃管以及盛血器皿均應洗凈滅菌，采血過程盡量做到無菌操作。采血時，采血瓶中再無菌條件下放入適量（如50—100毫升）生理鹽水或小牛血清以濕潤瓶壁，這樣有利于凝血，也有利于血凝塊與瓶壁的分離。每個采血瓶內(nèi)盛血不宜超過瓶的總?cè)萘康?/3，裝多了則出血清量少。盛血后采血瓶應置室溫（天熱時），如天冷應置溫箱或溫室中，靜置4小時左右（時間長些亦可），待血液凝固后放入4C冰箱（或冷庫）過夜（達24小時亦可）。然后在無菌間，小心（不要搖晃）倒出（或用虹吸法吸出）上層血清，如混有血球，則可將這部分血清以2000—5000轉(zhuǎn)/分離心10—15分鐘，收集上層血清（如略有溶血的血清照樣可用）但需注意無菌操作。然后置56C水浴中滅活30分鐘，以破壞補體和某些污染的病毒（當然也可不滅活丄滅活后可進行分裝，分裝最后需作菌檢。如菌檢有菌污染，則用塞氏濾器過濾。各瓶血清除近期要用的可置4C保存外，其余放低溫冰箱保存。最好采用3-5頭犢牛血清，先分別滅活，菌檢后再混合分裝保存。采血時還需注意動脈插管口不宜太細，放血速度也不宜過快，以防溶血。一般一頭犢?？煞叛?500-2500毫升左右，可分離出約一半的血清。七、每毫升含一萬單位雙抗（青霉素與鏈霉素）的配制：硫酸鏈霉素和青霉素G鉀鹽溶解于100毫升0.9%生理鹽水（或漢克氏液）中。然后用除菌濾器過濾，分裝小瓶，保存在低溫（-20C）冰箱中。雙抗不宜在融化后再進行凍結(jié)，最好一次用完，因雙抗在溶液狀態(tài)不穩(wěn)定尤其是青霉素。八、 每毫升5萬單位制霉菌素的配制：制霉菌素 1克（約500萬單位）鹽酸 2毫升純酒精 98毫升加入制霉菌素之后，應置普通冰箱@r）24-48小時，并搖動3-6次，以3000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，取其上清，以每瓶2毫升進行分裝，保存于低溫冰箱供用。使用劑量，按每毫升營養(yǎng)液加25單位制霉菌素（即營養(yǎng)液1000毫升加上述制霉菌素液0.5毫升）。九、 營養(yǎng)液與維持液的配制：1、 營養(yǎng)液：0.5%乳漢液（或0.1—0.3%）90毫升犢牛血清（所占營養(yǎng)液的比例隨各種培養(yǎng)細胞的要求不同而變）10毫升雙抗（1萬單位/毫升）1毫升（最終為100單位/毫升營養(yǎng)液）用7.5%NaHCO3調(diào)pH至7.0左右（一般6.8—7.0合適）2、 維持液：0.5%（或0.1—0.3%）乳漢液 95毫升犢牛血清（比例亦隨不同細胞而異）5毫升雙抗（1萬單位/毫升） 1毫升用7.5%NaHCO3調(diào)pH至7.3—7.6（視培養(yǎng)的細胞類型和病毒而異）。第四節(jié)器物與溶液的包裝、滅菌和無菌操作組織培養(yǎng)所用的營養(yǎng)液體不僅對動物細胞生長繁殖是營養(yǎng)物，而且對細菌和霉菌以及其它微生物也是很好的營養(yǎng)物。微生物比細胞生長繁殖得更迅速，他們的代謝產(chǎn)物對細胞往往有毒害作用，致使細胞死亡，使培養(yǎng)遭失敗。因此組織培養(yǎng)技術的很重要一點就在于防止污染，尤其是對傳代細胞，往往使幾個月甚至更長時間的工作全部報廢。防止污染主要有二大方面，一是滅菌，二是無菌操作。以下從這二方面分別加以介紹。一、 包裝與滅菌器物在滅菌前必須進行適當?shù)陌b，以便滅菌后便于存放。（一）、器物的包裝凡瓶子（包括培養(yǎng)瓶與三角瓶等）原則上應用棉紗塞（單層紗布包裹棉花）塞住，不應過松或過緊，然后用一層牛皮紙（或廢報紙）將瓶口包扎，如小的培養(yǎng)瓶也可放在飯盒（或其它容器）內(nèi)，可不用紙包扎，棉紗塞可反復使用。玻瓶有棉紗塞保護在滅菌后當冷空氣進入時就不會發(fā)生再被空氣污染的問題。如果不用棉紗塞塞瓶口，也可采用一層硫酸紙（或廢報紙）和一層牛皮紙包扎，這樣也是安全的。各種吸管或滴管在包裝前用棉花將上口堵上，以防止不慎將液體吸入橡皮頭內(nèi)而造成污染。然后按種類分裝于大的玻管（或其它金屬筒中），玻管口用棉紗塞和牛皮紙（或廢報紙）包扎。各種試管直接放入飯盒內(nèi)，蓋紗布或牛皮紙然后將蓋蓋上。離心管蓋以棉紗塞，放入飯盒內(nèi)或不放飯盒內(nèi)管口包扎二層紙。培養(yǎng)器用二層紙包裝。橡皮塞，按型號置于菜盒、平皿或其它容器中，容器外再用紙包扎。解剖器械可分別用紙包扎，也可置消毒盒內(nèi)。過濾細胞用紗布塊分別雙層紙包扎。注射器與針頭可直接放飯盒中，上蓋牛皮紙，或分別用紙包扎。G6耐酸細菌濾器通常與抽濾瓶聯(lián)接在一起用牛皮紙包裹，濾器口與抽濾瓶口也應用單層紙包扎。漢克氏液與乳漢液以及其它液體類可用棉紗塞加紙包扎?？傊?，一切物品都需進行適當?shù)陌?，以備滅菌后能保證不再受外界的污染。滅菌后長期不用的物品分別存放，以免混淆。（二）、器物的滅菌滅菌的方法也有多種，如干熱、高壓（熱壓）、流通蒸氣煮沸和濾器抽濾等等。此處僅介紹最常用的方法。1、干熱滅菌：用電熱鼓風干燥箱加溫到160C保溫1小時，140C保溫2小時或130C保溫4小時。此法比較簡便，而且滅菌后的物品干燥易保存。缺點是干熱的傳導較慢，需時較長。滅菌維持時間到后，要待干燥箱逐漸冷卻后再開箱門取物，否則驟然冷卻易使玻璃器皿破碎或使帶菌冷空氣進入容器內(nèi)部。進行干燥滅菌時應注意以下問題：①包扎物品的紙不要直接與箱壁接觸，尤其是箱底，否則易使紙燃焦以致著火。一旦發(fā)現(xiàn)干燥箱內(nèi)冒煙，應立即關閉開關，當時不應打開箱門，否則易引起火災，待其自然冷卻后才能打開箱門。進行干熱滅菌時，應有專人看守，最好在箱上做一明顯標志，以免別人誤開箱門。將包裝好的物品放入干燥箱內(nèi)時要注意不要安放過密，最好干燥時同時打開鼓風機以使箱內(nèi)各處溫度均勻，這樣，可使滅菌效果好，也可避免烤焦包裝紙。所有的玻璃器材和解剖器械經(jīng)上述包裝后都可使用干熱法滅菌。而橡皮、布類和溶液不能用此法。、高壓（熱壓）滅菌使用高壓蒸汽鍋（或柜）滅菌。所有橡皮制品、布類、玻璃器材、解剖器材和一些溶液等都可采用此法滅菌。高壓滅菌時要注意鍋內(nèi)冷氣排盡，然后閉上排氣孔使升壓，滅菌后不要立即排氣，要待自然落磅至0磅，才能打開排氣孔，然后趁熱打開鍋蓋取出物品，取出的物品需立即烤干，然后取出備用。玻璃器材、橡皮制品、解剖器械和布類等物采用15磅（121C）20分鐘，溶液類如漢克氏液、乳漢液采用8磅（112C）30分鐘，或10磅（114C）10—20分鐘。應特別注意的是乳漢液在滅菌時不要超過10磅，否則乳汗液易失去效用。除菌濾器過濾組織培養(yǎng)中常用一些生物性物質(zhì)如：血清、酶溶液、培養(yǎng)基等，有些物質(zhì)過熱易失效如雙抗溶液，這些物質(zhì)的滅菌能采取除濾器過濾除菌的方法處理。濾器可分為四類：（1） 蔡氏濾器（SeifZ慮器，又稱賽氏或“才資”濾器）（2） 玻璃濾器（3） 硅土濾器（又稱濾燭）（4） 微孔膜濾器（Millipor濾器）下面僅介紹常用的蔡氏濾器和玻璃濾器：蔡氏濾器是由金屬制成，用后棄去濾板，沖洗干凈，包裝滅菌備用。每次換用新的石棉濾板，濾板安裝時應光面向下。濾器的種類很多，濾板的型號也有多種，K級濾板作澄清液體用，EK級濾板可阻止細菌通過，組培中一般使用EKS級或EKS2級石棉濾板。本濾器的優(yōu)點是過濾速度較快，特別適用于血清的除菌。由于石棉濾板具有吸附作用，胰酶溶液通過時會失去部分活性，所以胰酶液最好不用此濾器過濾。同時，石棉濾板在溶液通過時會釋放出大量的鹽酸和某些毒性物質(zhì)。以致抑制細胞的生長，但是經(jīng)過洗滌后的濾板是令人滿意的，為此在滅菌前可用適量的去離子水先抽濾一次，然后烤干，包裝滅菌備用。玻璃濾器分為六個型號，組培中常用的為G6號耐酸玻璃濾器，（G表示級別見表），可濾除最小的細菌。用于胰酶、雙抗、碳酸氫鈉等溶液的除菌過濾。為暫時無G6號濾器，也可采取用G3—G5串用代替G6玻璃濾器，稱為3/5濾器。除菌過濾可用減壓（負壓）或加壓（正壓）方法，應注意壓力不要超過適當?shù)姆秶?，一般采用小型真空泵加壓。減壓用水流泵的負壓就夠了。在使用真空泵加壓時要觀察抽濾情況，如壓力太大則應關閉真空泵。尤其是當液體或血清臨近抽濾完畢時壓力應減小，否則液體抽完有可能將細菌抽濾下去造成污染，當然這種情況是較少的。4、煮沸滅菌表：玻璃濾器的級別級別孔徑（微米）濾除物G120--30大沉淀物G210—15大顆粒G34.9-9細顆粒、水銀G43—4液體中極細沉淀物G51.5-2.5較大桿菌、酵母菌等G61.5以下濾除最小的細菌通常解剖器材或橡皮塞臨時需用時可用此法滅菌。至少煮沸30分鐘煮沸消毒不能殺死細菌的芽孢。所以一般在緊急情況下來用。二、無菌操作以上已將器物的清洗、包裝與滅菌作了介紹，為了避免其它微生物的污染還需加倍注意無菌操作問題。有關這一問題最重要的是在思想上應有足夠的重視，在技術上反復練習使成習慣。在組織培養(yǎng)的整個過程中思想上要防止麻痹大意操作上避免粗枝大葉，這樣就能基本克服污染產(chǎn)生。當然，在組織培養(yǎng)中污染的問題是一個十分復雜的問題，需從多方面的注意和采取措施才能克服?？傊?，最關鍵的還是思想上的極其重視。組培操作過程中的污染除了上述器物與溶液方面外，主要是來自三方面：（一）從空氣來的污染；（二）從組織來的污染；（三）由操作者引起的污染。以下分別加以介紹。（一）從空氣來的污染為避免空氣帶來的污染，組織培養(yǎng)的操作應在無菌間（或用無菌接種箱或用超凈工作臺）中進行，而無菌間要做到“無菌”必須先經(jīng)滅菌處理。無菌間的滅菌處理方法較多，現(xiàn)介紹一些常用的方法，以供因地制宜選用。1、甲醛（或福爾馬林）熏后氨水中和用量為普通一間無菌間需用200毫升甲醛，具體做法：甲醛一份加熱水1/3份放一容器中，下面用等量（甲醛加水的總量）酒精的酒精燈煮，待酒精燒完時甲醛溶液也差不多燒干點著酒精燈后，閉上無菌間的門，門縫用紙條（廢舊報紙）沾濕水封上。熏24小時，然后帶濕口罩進去，用與甲醛等量的氨水均勻灑在地上進行中和，過4小時進去看看，如仍有甲醛味，再灑一點氨水，直至無甲醛味為止。2、甲醛—高錳酸鉀熏用較大量的高錳酸鉀倒入盛甲醛的容器內(nèi)，稍等，開始冒濃煙，如不冒煙再加些高錳酸鉀。同樣熏蒸24小時，其余同上法。此法的缺點為高錳酸鉀用量太大。3、甲醛熏甲醛中略加些水，放無菌間的自然揮發(fā)熏24小時以上。此法簡便，效果似較上二法略差，時間也較長些。4、石碳酸噴霧工作前用5%石碳酸噴霧。此法消毒不完全，并且使無菌間很潮濕，一般做組織培養(yǎng)不宜采用。5、丙二醇熏丙二醇+1/3-1/（2丙二醇量）的水，用酒精燈熏，熏過夜即可使用。此法不像甲醛有較大的刺激味，丙二醇熏后無味，效果也較好，只是熏后地面與桌面較滑。6、過醋酸（過乙酸）目前國內(nèi)一些單位推廣使用。優(yōu)點是無刺激味，效果好，快，熏過即可使用，不過價格較貴些。7、乳酸熏：有些生物藥廠也采取此法。無菌間經(jīng)上述任一方法消毒滅菌后即可使用，但并非每次使用無菌間都需如此處理，而是經(jīng)過一段時間使用之后按上法消毒滅菌一次，時間長短視無菌的使用狀況，如使用頻繁，則應1-2周熏一次，作為生產(chǎn)的話最好3-6天滅菌一次。以上為無菌間較徹底的滅菌，平時每次使用到無菌間都需經(jīng)如下處理：使用前開始紫外燈照射30分鐘至1小時，即可殺死大部分空氣中的細菌，而每次使用完畢后需用0.1%--0.02%新潔爾滅液（或5%石碳酸液）擦拭桌子面與地面，最好再開啟紫外光燈半小時。應注意的是紫外線只有在直接照射到的地方才能殺死細菌，因此僅照射紫外線的無菌室只是相對的無菌，僅經(jīng)紫外線照射的無菌室還是有菌的，對此應有足夠的認識，在一切操作過程中仍需嚴格遵守無菌操作技術，一般常規(guī)是取3-4個9厘米直徑的細菌培養(yǎng)皿直接暴露放在接種室?guī)讉€地方半小時，經(jīng)培養(yǎng)后有2-3個菌落亦算是合格。此外，應注意①紫外線對人眼有損害作用，工作時不要照射?！蜃贤饩€照射后空氣中有臭氧存在，對人和細胞均不利，所以最好是在照射后半小時左右再開始工作。夏天尤需注意無菌間的滅菌問題，因濕度大（特別我國南方），氣溫高，霉菌和雜菌很易繁殖，如不注意污染率就會大大提高。如果無菌室是由數(shù)組合用的，最好訂出一些規(guī)則共同遵守。如：保持無菌間的清潔整齊，每次使用后進行打掃整理，被培養(yǎng)基等弄臟的地方要擦凈，然后用新潔爾滅液（或石碳酸液）擦桌面和地面。所有污染物品不得在室內(nèi)開啟。進行無菌操作時，未經(jīng)操作者允許，任何人不能進入無菌室內(nèi)，接種室與緩沖間不能同時開兩個門。未穿接種服不得進入無菌室等等。（二） 從組織來的污染一般待培養(yǎng)的組織（如腎、雞胚等）均經(jīng)無菌操作采取，故無需消毒即可培養(yǎng)，一般動物的內(nèi)臟組織是無菌的，但是直接與外界相通的例如呼吸及消化道組織是有菌的，胚胎組織正常也是無菌的。如果采取組織時，不能嚴格按照無菌操作（如在野外采?。┗虮旧韼Ь牟牧希ㄈ鐒游锏暮粑篮拖溃┰谌〔暮?，立即浸入每毫升含有1000單位青霉素和0.5毫克鏈霉素（或基它抗菌素）的漢克氏液或生理鹽水中，浸泡1小時左右，培養(yǎng)前再用含同樣量雙抗的漢克氏液洗滌1-2次，再用漢克氏液洗涮3-5次，經(jīng)這樣處理后的材料可大大減少污染的機會。（三） 由操作者引起的污染由操作者引起的污染可有以下三方面。1、直接污染：直接污染是指帶菌的物體直接或間接污染培養(yǎng)基等所引起的，要避免直接污染應掌握三個環(huán)節(jié)，即手、吸管和瓶口。手：操作者在進入無菌室前要用肥皂洗手或用新潔爾滅浸泡手，進入無菌間后再用酒精棉擦手。吸管（或注射針頭）：掌握不使無菌的吸管□與前段吸管、與未滅菌的物品或可能發(fā)生污染的地方接觸。由裝吸管的容器中取出吸管時注意手不要碰其它吸管，吸管安裝橡皮頭時也不要被手所污染。吸管在使用前后都要經(jīng)過火臨以固定灰塵和可能沾上的細菌。吸管使用時避免與瓶□接觸。在操作過程中如對吸管是否已被污染生疑問時應及時換用新的吸管。瓶□:在打開瓶□時，最大的污染危險是瓶□邊沿的微生物掉進瓶內(nèi)，因瓶□塞子周圍會積聚小量灰塵，或是因為瓶子在室溫冷卻時內(nèi)部形成負壓，當塞子拔出時空氣進入而帶進灰塵或微生物，因此，在拔起塞子前將瓶□和塞子周圍用火焰略燒一下主要作用是將灰塵或細菌固定在瓶□上，燒時應轉(zhuǎn)動瓶子使瓶□周圍均接觸火焰。如果培養(yǎng)液接觸了瓶□或傾倒培養(yǎng)液時，要盡量倒盡不使瓶□留有殘滴，同時瓶□要燒到足夠的熱度以殺死偶然落上的細菌。為避免灰塵落入瓶□，—般在蓋上瓶塞后用紙包扎瓶口。2、呼吸時排出的細菌平靜呼吸時細菌不多，但在談話和咳嗽時便大量增加，因此進無菌室要帶□罩并盡量不要說話。因為雖然□罩在平靜呼吸時是安全的，但咳嗽和談話后就會有很多細菌積聚在□罩內(nèi)，再呼吸時就會驅(qū)出空氣中而造成污染。必要時（如重要而難得的材料）可用玻璃擋板與操作者頭部隔開。1、防止灰塵污染絕大多數(shù)細菌都是附著在灰塵上的，為防止灰塵的污染應注意以下幾點：進無菌間要換鞋，穿無菌服、帶帽和□罩。應注意的是頭發(fā)全部必須塞進帽子（這一點尤其是女同志要加注意）。在無菌室內(nèi)避免快速走動和不必要的動作，這樣易使灰塵揚起。器具物品的位置要合理放置，不要使手臂在桌面上交叉活動，更要避免在開放的器皿上方活動以免揚起灰塵。必要時也可在桌面上鋪一塊在新潔爾滅液中浸濕的桌布以防灰塵。◎瓶□應及時蓋好，開□的瓶子和管子要斜拿。◎—般生物藥廠的車間在使用前用新潔爾滅液（或5%石碳酸）噴霧或丙二醇熏來避免揚起灰塵和將空氣中的灰塵降落。以上簡單介紹了組織培養(yǎng)中器物的清洗、包裝滅菌和無菌操作三項基礎工作，這三個環(huán)節(jié)是十分重要的，馬虎不得，稍有些疏忽就可使前功盡棄。因此，做組織培養(yǎng)工作要有嚴肅認真的態(tài)度，耐心細致不怕麻煩的工作作風。第五節(jié)無菌檢驗組培工作中，為避免污染、特別是一整批細胞被污染，除了以上三個重要環(huán)節(jié)需注意掌握外，對用于組織培養(yǎng)的各種溶液和犢牛血清等在培養(yǎng)細胞前還要作無菌檢驗，尤其是對已使用過的溶液如漢克氏液、乳漢液等。這樣才能避免整批細胞被污染。無菌檢驗可按常規(guī)菌檢方法進行。一、常用培養(yǎng)基1、適于需氣性雜菌生長的培養(yǎng)基，常用的為普通肉湯和瓊脂斜面。2、厭氣性菌生長培養(yǎng)基，如厭氣肉肝湯培養(yǎng)基。3、霉菌及酵母菌生長培養(yǎng)基，如沙氏培養(yǎng)基或土豆培養(yǎng)基。二、培養(yǎng)基的制備與保存：以上所提的幾種培養(yǎng)基均為普通用的，尤其是在生藥廠或疫苗廠都是常備的，故在此不多敘述。三、無菌試驗方法：1、無菌試驗之前，應仔細檢查一下培養(yǎng)基是否有細菌污染或棉栓松脫現(xiàn)象。2、無菌試驗材料中不應含有各種抗菌素。3、每份材料應同時接種普通肉湯、血斜面、厭氣肉肝湯培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基各一支。4、每管培養(yǎng)基至少應接種0.2毫升被檢材料。5、 接種后沙氏培養(yǎng)基放在22-25C。其余放置37C培養(yǎng)，時間一般應為7天，沙氏培養(yǎng)基的觀察為8—14天。6、 接種液體培養(yǎng)基時應注意搖勻，接種斜面培養(yǎng)基時應使被檢材料盡量流滿斜面。7、 培養(yǎng)后應每天逐管觀察，記錄結(jié)果。8、 培養(yǎng)后的液體培養(yǎng)基如果由于混濁不能判定結(jié)果時，可在48小時后再移種一代，方法同前，于同樣溫度培養(yǎng)五天后判定結(jié)果。9、 分裝材料時，應于分裝的最后進行無菌試驗。10、 如發(fā)現(xiàn)細菌生長，可進行重試一次，如仍有菌則該批材料不可用。實際工作中也經(jīng)常將滅菌后的培養(yǎng)液在37C中存放數(shù)日，若液體仍然清亮則表示末被污染，如此處理可不用培養(yǎng)基菌檢。每次用剩的溶液亦可作此處理后證實無菌生長才可再用，這一點在大規(guī)模生產(chǎn)中尤其需要注意。第六節(jié)原代單層細胞的制備與培養(yǎng)原代單層細胞的培養(yǎng)我們常用的有二種方法，即靜止培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，但其細胞的制備方法卻是一致的，不論是小型試驗或是生產(chǎn)規(guī)模的培養(yǎng)，其方法與過程也是基本相同的，只是所用器材有大有小。為了方便初學組織培養(yǎng)，我們以小動物（如小白鼠、金色倉鼠或兔等）的腎細胞的制備和培養(yǎng)為例加以介紹，熟悉了這一過程，對以后做其它材料（如雞胚、豬臟器等）的細胞培養(yǎng)也就可以舉一反三了?，F(xiàn)簡單介紹如下：1、取腎選取斷乳前后的幼動物，剪斷頸脈放血致死。用自來水浸濕背部被毛，將動物背部朝上，放入瓷盤或釘在木板上用碘酒擦拭腰部二側(cè)的被毛，于腰椎側(cè)，肋骨后用鑷子提起皮膚，用剪子剪開皮膚，將切口向前后擴展，并使剪開之皮膚放向兩側(cè)，此時可進入無菌間。然后再用碘酒在腰椎側(cè)，肋骨后的肌肉上由中向外涂抹碘酒，同樣方法涂一遍70%酒精，用消毒過的鑷子和剪刀在腰椎側(cè)，肋骨后剪開肌肉就可見該部位下的腎臟（一般右腎所在部位較左腎略靠后些），用鑷子將腎取出置于滅菌平皿中。取腎時盡量不要劃破腎被膜，更不要劃破內(nèi)臟（如腸）。如是小豬則從腹面取腎。2、剪腎用鑷子或剪子挑破腎膜，剝向腎門，然后剪去腎膜和脂肪，用Hanks液洗滌一次，放入另一平皿中（如果是大規(guī)模培養(yǎng)，用于洗滌的Hanks液最好每毫升加200單位的雙抗），另換一把鑷子和剪子，縱剪開腎臟，去掉腎盂部分（白色結(jié)締組織）（如有需要，可將去腎盂后的腎臟放另一平皿稱重）。將腎剪成數(shù)塊，用Hanks液洗滌一遍，把腎塊移入一小燒杯（50毫升）或鏈霉素瓶中，用彎頭剪把腎剪成乳糜狀（也可剪成1立方毫米大小的塊），重要的是應剪的均勻，塊的大小較一致，再用Hanks液洗滌2-3次，直至液體澄清無血球方可。然后可加入0.25%（活性1：250）的胰酶溶液，pH7.6—7.8或0.125%（活性1:500）的胰酶溶液，將它們倒入一細□三角瓶中進行消化（其量可靈活掌握，一般按1：5-6加胰酶以蓋浸組織后略超過即可）。此時可根據(jù)需要和時間的要求進行熱法消化或冷法消化。當加入胰酶后，可見腎組織碎塊團聚起來成為絮狀一團。如做較大量的組織器官（如豬腎）時，可將它放在150毫升的錐形瓶中，用理發(fā)剪剪碎。3、消化與分散組織塊:熱法消化：將上述加好胰酶的腎組織放入37C恒溫水浴中進行熱消化20-30分鐘（要看所用胰酶的活性，不同動物，不同年齡的腎而取不同消化時間，開始做時要進行摸索，得出合適的時間），每隔5分鐘或10分鐘搖晃一次瓶，直至腎組織小塊又分散開，再消化一會看大多數(shù)組織塊變?yōu)榘咨?，較疏松樣，組織塊中心無肉色為止，帶肉色的組織占極小數(shù)，取出立即傾去胰酶，防止消化過大，馬上用Hanks液洗滌2-3次，將剩余的胰酶充分洗掉，然后加入少量乳漢液，用注射器或吸管或滴管進行吹打（即吸入和擠出），吹打10-20次，大部分組織塊已將分散成細胞，如果是做較大量的材料，可在消化瓶中予先放適量玻璃珠，消化好的組織塊就可用玻珠振搖撞散，然后將分散的細胞經(jīng)2層消毒紗布過濾至另一瓶中，如腎組織塊未分散完，可再加入一些乳漢液再吹打（或搖玻珠）過濾，收獲，經(jīng)2-3次即可吹打搖瓶收集完畢。豬腎細胞的消化采用熱法消化較好。冷法消化：將上述加入胰酶的腎組織塊在冰箱消化過夜（約16~18小時，消化時間的長短，同樣也應根據(jù)使用胰酶的活性，不同的動物，不同年齡動物的腎而異，如年齡大則時間長），取出，立即用Hanks液把胰酶洗去，也需2-3次洗滌，然后進行吹打（振搖）過濾，收集，均與熱消化相同。不管熱、冷法消化，亦可直接在消化的胰酶中分散細胞（用電磁攪拌器或注射器等吹打），沉淀后，將上層含有被消化下來的細胞懸液取出置另一三角瓶中，并將其放入裝有冰塊之容皿中，剩下的沉淀，再加入胰酶進行消化和吹打。如此幾次亦可消化完畢，然后加入等量的Hanks液，用2層紗布過濾，分裝離心管中，以1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，倒去清液，加入Hanks液，吹打均勻，再以1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，沉淀的細胞加適量的乳漢液吹打懸浮起來，收集至另一瓶中。4、分裝細胞與培養(yǎng)：將上述任一種方法制備的細胞懸液搖勻，分出1毫升進行細胞計數(shù)或染色計數(shù)（計數(shù)和染色以下再說），計數(shù)可得每毫升含細胞量多少，然后配稀釋量所需的營養(yǎng)液加以稀釋，至每毫升營養(yǎng)液含50—60萬細胞，分裝到各種培養(yǎng)瓶中。分裝量按各種瓶容量的十分之一左右量進行分裝。營養(yǎng)液按10%的犢牛血清，90%的0.5%（或0.1-0.3%）乳蛋白水解物溶液（乳漢液）和雙抗每毫升100單位配制。營養(yǎng)液的PH為6.8-7.（視不同的細胞要求pH也不同，如驢白細胞培養(yǎng)，營養(yǎng)液pH為7.0左右。一般腎細胞或雞胚細胞最好不超過7.0還需注意犢牛血清是偏堿的，當乳漢液調(diào)好pH,再加入血清就可能使pH達7.0以上，所以最好是加了血清之后，最終調(diào)pH）。最后將培養(yǎng)瓶放在木盤中或木架上如為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)則將培養(yǎng)瓶放轉(zhuǎn)瓶機上置37C恒溫培養(yǎng)箱或恒溫室中培養(yǎng)3-4天即可形成良好的單層。如在培養(yǎng)過程中，經(jīng)1-2天細胞生長情況不太好，溶液變紅了，則可換一次營養(yǎng)液（倒去各瓶中的營養(yǎng)液，換成新配營養(yǎng)液），pH仍為7.0左右。如經(jīng)培養(yǎng)2-3天因細胞生長使溶液變黃，希望細胞長得更好些，也應換液，換成維持液，即含5%的犢牛血清，95%乳漢液，雙抗仍同上。繼續(xù)培養(yǎng)。以后每過3-4天（視溶液的pH而定）更換一次維持液。第七節(jié)細胞計數(shù)和染色一、 細胞計數(shù)：細胞計數(shù)工作，在初次接觸某種動物的某種組織培養(yǎng)時，必須進行細胞的計數(shù)，由于對一種新的動物的組織究竟每克組織（或每個臟器）可以培養(yǎng)多少毫升細胞懸液，尚未取得經(jīng)驗,例如某動物的腎。故對一種動物的一種組織只有在進行多次培養(yǎng)之后，取得了經(jīng)驗方可簡化步驟，不用計數(shù)，按經(jīng)驗進行稀釋培養(yǎng)。細胞的計數(shù)可以進行染色和不染色計數(shù)。如有條件進行活細胞染色或死細胞染色方法的則更好。雖然麻煩些，但得到的活細胞數(shù)則更確切。不染色所得細胞數(shù)則包含了一部分不能生長的死細胞。細胞計數(shù)采用白血球計數(shù)法，即：將上述分出的1毫升細胞懸液加4毫升Hanks液進行5倍稀釋，用滴管加入已安裝好的血球計算室內(nèi)（滴加細胞懸液時必須將其搖勻，滴時應沿蓋片邊沿滴加，讓其自然滲入，一旦蓋片下已占滿，則不再繼續(xù)加），稍靜止，讓細胞下沉，在中倍（100倍左右）鏡下數(shù)四角四個大方格（每個大方格合16個小方格）的細胞數(shù)，然后進行計算（只計算完整而圓，有胞漿的細胞，未完全散開的細胞團塊，一團算一個數(shù)）：設n=四個大方格內(nèi)的細胞總數(shù)。則每毫升原懸浮的細胞數(shù)=口/4乂10000x5（即稀釋倍數(shù)）注意：計數(shù)時對大方格的四條邊的細胞計數(shù)對相對的二條邊只能計其一條，如計上和右邊，不計下和左邊，反之亦可，但不要把四邊的細胞均計數(shù)。二、 細胞染色細胞染色的方法較多，大致可以分為離體活體染色和固定染色二類，每類又有許多方法，選擇何種方法，則看染色目的而定，這里所談細胞染色是為了細胞計數(shù)，并能區(qū)分活細胞與死細胞，以便更準確地計數(shù)活細胞。1、中性紅染色：中性紅是一種比較常用的活體染色的染料，一般常用的濃度是萬分之一。配制法：0.1克中性紅加雙蒸水到10毫升，成1%中性紅溶液。取1%的中性紅溶液1毫升加99毫升生理鹽水（或Hanks液），即成1/10000的中性紅液。染色時，將1份細胞懸液中和4份1/10000的中性紅溶液，著染3分鐘左右，用高倍顯微鏡檢查細胞的死活，活細胞中因吞入許多中性紅細小顆粒，被染成很淺的粉紅色，死細胞不著色或中性紅顆粒成彌散狀，使死細胞成均勻一片粉紅色。此法不適于計數(shù)，適于檢查活細胞的大致比例。2、 臺盼藍染色：可用Hanks液將臺盼蘭配成0.1%的溶液，充分混勻（可高壓滅菌），調(diào)pH到7.2—7.3，染色時用1份細胞懸液加1份染液則成為0.05%的濃度，著染3分鐘左右，15分鐘內(nèi)進行觀察或計數(shù)，低倍鏡下，死細胞則均勻染成蘭色。而活細胞仍透明，好似未染上，但用400X觀察時，活細胞中亦有極細微的蘭色顆粒，不過與死細胞的整個細胞變蘭很易區(qū)分開。此法適用于計數(shù)用。3、 結(jié)晶紫染色：染料配方：檸檬酸2.1克，蒸餾水100毫升，溶解后再加結(jié)晶紫0.1克即成1/1000結(jié)晶紫染液。用時與細胞或2：1或4：1量（即細胞三至五倍稀釋）混合，三分鐘后觀察。凡細胞核（不論死活）均能著色，如此計得的是細胞總數(shù)。第八節(jié)培養(yǎng)細胞的觀察一、培養(yǎng)細胞的生長和繁殖：在單層培養(yǎng)過程中，可以把細胞的生長繁殖情況大致分為五個時期，但五個時期無絕然的分界線，而是互相延續(xù)的過程。1、 游離期：細胞經(jīng)由組織上消化分散下來，呈懸液狀態(tài)。由于原生質(zhì)收縮和表面張力，此時的細胞成為圓形，折光率高。用活體染色的方法可以鑒別細胞的死活。此期從消化分散后可延續(xù)1至數(shù)小時。2、 吸附期（貼壁）：單層細胞靜止培養(yǎng)7-8小時后已可貼壁（不同動物細胞時間不同，如是雞胚細胞已開始繁殖。如為轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，則旋轉(zhuǎn)一圈后即已開始貼壁），直至24小時細胞開始生長和分裂，有的已可長成島嶼狀（雞胚16小時左右可形成單層），此時可在普通顯微鏡下見到細胞是透明的，立體感強烈，顆粒較少。3、 繁殖期：培養(yǎng)24小時之后直至72小時或更長些時間，此時細胞進入繁殖期，細胞加速生長和分裂，由形成細胞島直至鋪滿整個液體浸泡的瓶壁（即形成細胞單層，）此時期細胞透明，顆粒較少，細胞界限明顯，可隱約地看到細胞核。根據(jù)細胞生長繁殖面積的大?。凑颊麄€細胞生長的瓶壁的百分率），可以將生長情況分為四級：+，細胞占瓶壁有效面積的25%以內(nèi)，僅有新生細胞島；++,細胞占瓶壁有效面積的25-75%;+++，細胞占瓶壁有效面積的75-95%，細胞排列致密，仍有空缺；＃，細胞占瓶壁95%以上。一般指細胞已鋪滿或接近于鋪滿單層，致密、透明度好。從++f#為細胞的對數(shù)增長期。4、 維持期：當細胞長滿整個瓶壁以后，細胞仍舊繼續(xù)分裂生長，但較上期為緩，逐漸停止生長，可維持一些日子，此時細胞界限不那么清晰，細胞胞漿內(nèi)顆粒逐漸增加，細胞不那么透明，立體感也較差了。在這時期內(nèi)，由于不斷產(chǎn)生細胞代謝產(chǎn)物，維持液逐漸變酸，由于含酚紅指示劑，液色逐漸變?yōu)槌赛S色仍至黃色，這時就須更換維持液。各種不同動物和不同年齡的組織培養(yǎng)的細胞維持期的長短不同，也與營養(yǎng)液或維持液的新舊程度和培養(yǎng)的溫度有關。如豬腎細胞培養(yǎng)維持時間較倉鼠或小白鼠腎培養(yǎng)的細胞維持時間長，年幼動物的組織培養(yǎng)的細胞較年老為長，經(jīng)常換液比不換液維持時間長，置于較低溫度培養(yǎng)（如25C,4C）維持時間比37C培養(yǎng)的長。5、 衰退期：由于營養(yǎng)的缺乏或細胞日齡的增長，使代謝物積累或是其它原因，細胞進入衰老期，此時細胞中間出現(xiàn)空隙。細胞極度的伸展拉開，也不很透明了，胞漿中顆粒更多，立體感更差，如固定染色可見脂肪滴加多、加大，并可見細胞漿內(nèi)出現(xiàn)大的液泡，最后細胞皺縮并從瓶壁上脫落。二、在單層細胞培養(yǎng)中細胞的形態(tài)觀察培養(yǎng)中的細胞形態(tài)在培養(yǎng)后有趨向一致的傾向，即使是有經(jīng)驗的工作者，一般也難于區(qū)分培養(yǎng)下的細胞是來自何種組織的。但無論是正?；蚰[瘤組織原代培養(yǎng)時，大多數(shù)可出現(xiàn)三種類型的細胞生長，即成纖維樣細胞，上皮樣細胞和游走細胞。其它特殊類型的細胞只有在培養(yǎng)特殊的組織才出現(xiàn)，如神經(jīng)細胞與性細胞等。在用腎組織培養(yǎng)時，一般可見二類細胞：1、 成纖維樣細胞：這種細胞是比較容易培養(yǎng)的一種細胞，在一般培養(yǎng)中均占優(yōu)勢。因為它對環(huán)境的適應性比較其它細胞強。成纖維樣細胞呈梭形、長條形或象流水樣平行排列，在組織團塊周圍呈放射狀生長，具有許多針樣的胞漿突起，細胞邊緣不整齊，胞漿透明，胞核橢圓形。在形成單層之前，細胞彼此之間呈網(wǎng)狀排列，細胞島的周圍不整齊，此種細胞生長也較快，因此鋪滿整個瓶壁也較快，如雞胚和驢胎肺細胞就是以本類型為主。2、 上皮樣細胞：最主要的特征是細胞排列緊密，互相之間呈鑲嵌狀，細胞呈多邊形，角為鈍角，大小相仿，細胞外觀透明，邊緣整齊，有一圓形核。上皮樣細胞可以受外界環(huán)境的影響而改變它的形態(tài)，當上皮樣細胞單個存在時，外形可類似成纖維樣細胞，有時可發(fā)生梭形變形，細胞島的周緣較整齊，上皮樣細胞的生長較慢，因此常常被生長旺盛的成纖維細胞所掩蓋，或被其分割成小片狀。在實際培養(yǎng)中往往是兩種細胞的混合型，只是某一型占明顯優(yōu)勢。第九節(jié)原代單層細胞培養(yǎng)中應注意的問題和可能會出現(xiàn)的問題一、應注意的問題：1、前面已經(jīng)提過，細胞在體外生活，尤其是細胞單層，細胞是貼在玻璃瓶壁上的，因此培養(yǎng)瓶的質(zhì)量和清洗一定要十分注意，清洗不好的瓶子，細胞不能貼壁，或稀稀拉拉地能貼上，有時細胞長成零散片狀長不成良好的單層。所以選擇培養(yǎng)瓶的玻璃質(zhì)量和清洗干凈是十分重要的，尤其后者較前者更主要。2、除選用白色較純的橡膠塞子外，在培養(yǎng)過程中盡量不要使營養(yǎng)液觸橡皮塞。因為即使是較純的橡皮塞，對細胞也有一定的危害。所以在分裝時，細胞懸液的量應適當，不宜過多，以致與橡皮塞直接接觸引起細胞中毒，使培養(yǎng)失敗。3、培養(yǎng)細胞所用之水，質(zhì)量必須合乎要求的標準，否則其中會含有細胞中毒或不利于細胞生長的離子，如自來水中的鉛離子。4、當我們對乳漢液進行高壓滅菌時，必須注意高壓磅數(shù)，不能超過10磅，否則營養(yǎng)成分遭破壞，細胞就不能生長繁殖。5、犢牛血清對細胞培養(yǎng)起著相當重要的作用，有時單頭牛血清培養(yǎng)不好細胞（如使用單頭牛血清，必須先試驗，然后才用于大量培養(yǎng)）。一般應用3-5頭混合牛的血清，效果較好。至于犢牛血清要不要經(jīng)過56C30分鐘滅活，意見不一，有待進一步試驗。曾有單位進行過試驗，滅活與否和過濾與否對培養(yǎng)雞胚和一般腎細胞無甚差異。6、 pH亦應很好注意，初培養(yǎng)液pH應在6.8-7.0不要超過7.2否則細胞生長很慢或者不生長。對雞胚和腎細胞培養(yǎng)是如此，不同的細胞有不同的要求，如白細胞初培pH為7.67、 在分裝細胞時必須經(jīng)常搖勻，以使各瓶分裝的細胞數(shù)量均勻一致，特別是分裝瓶數(shù)多時更應注意。8、 整個操作過程必須嚴格注意無菌問題，否則易引起污染。9、 除了以上一些技術問題之外，還有二種思想問題必須加以注意。開始進行組織培養(yǎng)工作時，有的同志會覺得此項工作很神秘、復雜，有些畏難情緒，當看了，學了會做之后，反過來又可能產(chǎn)生一種“很簡單，沒啥了不起”的想法，因而產(chǎn)生麻痹大意、粗枝大葉、潦草從事，以致不知哪個環(huán)節(jié)出些毛病，使得整個培養(yǎng)勞而無效，不得不從頭再做?？傊情_始做時做得好，過一段時間就培養(yǎng)不好了，可能是因為麻痹大意了。組織培養(yǎng)工作是一項繁雜需時較長的而易污染的工作，因而特別需要仔細和耐性。二、可能會出現(xiàn)的問題：有關培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的問題，只能就我們工作中遇到過的問題加以論述，這里所提到的問題只是一部分，大家在工作中，一定會遇到一些其它問題，對具體的問題還需具體分析才好。1、細胞消化完畢，略一搖晃，不見細胞團塊散開或成為粘鼻涕樣。甚至連細胞塊亦不見了，傾倒時很易隨胰酶液滑出瓶口，出現(xiàn)此種現(xiàn)象是因為消化過大。原因是胰酶液濃度太高，pH過高為達8-8.5，使胰酶活性太高；消化時間過長。2、細胞經(jīng)分裝后24小時也不見貼壁或只部分瓶壁貼上，大部分瓶壁貼得很少其主要原因可能是因為培養(yǎng)瓶洗得不夠干凈，或者消化過火，吹打太厲害（如分散細胞所用器材象注射針頭細而長吸管管口太細，吹打次數(shù)又多）使活細胞幾乎沒有，致使無活細胞貼壁，這可用活細胞染色觀察消化分散后細胞形態(tài)來事先檢查。也可能因某些原因細胞中毒而不貼壁。3、細胞貼壁，但不見生長，可能的原因是乳漢液（水解乳蛋白漢克氏液）在高壓滅菌時，高壓磅數(shù)超過10磅，使水解乳蛋白作用遭到一定的破壞；抗生素加得過多（如直接加抗生素干粉），使細胞中毒，如果使用的單頭犢牛血清不合適，其中缺乏某種營養(yǎng)物質(zhì)，也會出現(xiàn)此現(xiàn)象。4、細胞貼壁，生長一點，過一天又脫落了，鏡檢時有時見許多小圓片，折光率不好，所見小圓片是為細胞破碎后形成的碎片。其原因可能是在配制漢克氏Hanks）液時，藥品順序弄錯，例如先加了CaCL2，以后形成了磷酸鈣沉淀，而鈣離子為細胞生長繁殖所必須，缺它細胞就不能正常生長，另外也可能使平衡鹽溶液成為不平衡，變成了低滲溶液使細胞破裂，再有，在配制時未嚴格按全溶解一種再加一種的要求進行，也會產(chǎn)生沉淀。這種情況的形成的另一原因可能是因為培養(yǎng)箱（恒溫室）的恒溫控制器失調(diào)，致使溫度上升達42-43C以上，將細胞燒死了。再有，如果用肥皂水洗培養(yǎng)瓶而未按要求沖洗，殘留較多的肥皂分子，也會引起細胞的慢性中毒生長一點后又脫落下來，除以上一些原因外，還可能存在其它原因，需繼續(xù)摸索。5、 細胞生長不好，長得很慢而稀稀拉拉，營養(yǎng)液變紅，原因可能有：瓶蓋蓋得不嚴，漏氣，使CO2逸出，細胞消化得不好，活細胞數(shù)量少，死細胞多，37C培養(yǎng)之后，死細胞分解產(chǎn)生一些有毒物質(zhì)，如組織胺等堿性物質(zhì)，使pH升高，溶液變紅，毒害細胞，使之不長。6、 初次培養(yǎng)的營養(yǎng)液pH在7.3以上，溶液顯得紅，這樣腎細胞也不容易生長，或不長。7、 發(fā)生污染：污染的原因很多，如消毒不完全，用具和溶液未很好滅菌，操作時引起污染或取材時已污染；各種溶液在用過后已污染，未經(jīng)檢查第二次再用時則全部污染；血清已污染等等原因。因而在發(fā)生污染現(xiàn)象時，必須進行具體情況具體分析，一般說來，如污染僅發(fā)生在所有培養(yǎng)瓶中的一部分，則可從所使用的器物和操作中去查原因。另外，在接毒換液或一般換液時由于倒出液體必有空氣進入，如果火焰控制不嚴，微生物可能伴隨空氣進入培養(yǎng)瓶中導致污染，因無菌間并非絕對無菌。尤其做豬瘟細胞苗的生產(chǎn)，瓶大換液次數(shù)多，很易被污染，如果用管道化（見附圖）則可大大減少污染機會。8、培養(yǎng)的雞胚細胞單層未到衰老時就出現(xiàn)單層的邊卷起來繼之整個單層剝落的現(xiàn)象，其原因不很清楚，有可能是細胞分裝時細胞的數(shù)量過大，或者細胞數(shù)不算過大，但生長過于旺盛，又未及時更換維持液造成細胞營養(yǎng)不良，如培養(yǎng)雞胚成纖維細胞時常遇此現(xiàn)象。第二章在組織培養(yǎng)的細胞中病毒的接種與毒價的滴定（測定）組織培養(yǎng)的細胞一旦接觸到病毒，可有兩種情況，一種情況是細胞對此種病毒根本不敏感，即這種病毒不能在此種細胞中繁殖，既使將這種病毒在該細胞上盲目傳代也不能適應上去（或繁殖）；另一種情況是，該細胞對該病毒是易感的，病毒能夠適應上去，即能在該細胞上繁殖。在這種情況下，又可根據(jù)病毒對細胞的作用分成二種類型：（1）急性感受染：特征是被感染的細胞發(fā)生破壞性病變（一般稱為細胞病變作用--CPE）而最后細胞死亡脫落，如鴨瘟病毒對雞胚細胞的作用。（2）潛伏性感染：這時，病毒在感染細胞中繁殖，但不使細胞出現(xiàn)光學顯微鏡下可見的病變或死亡，細胞仍保持生活能力，其外觀幾乎與不接毒的對照細胞無什么區(qū)別。當然在電子顯微鏡下其微結(jié)構(gòu)上可能有些變化。潛伏性感染的病毒如在該種組培細胞上傳若干代，也可能使細胞對此種病毒的敏感性增高（或為病毒對該種細胞適應性加強了）而變?yōu)榧毙愿腥绢愋?，出現(xiàn)CPE。如豬傳染性水泡病病毒和人類腸道病毒科賽奇BB對幼倉鼠腎原代培養(yǎng)細胞的適應過程（豬傳染性水泡病上海北新經(jīng)毒株在腎細胞上傳至第11代才出現(xiàn)病變，科賽奇Bb病毒是第六代出現(xiàn)病變的）。但是也有的傳多代后病毒仍為隱性感染的。如豬瘟兔化弱毒在豬腎組培細胞上那樣，但病毒仍可繼續(xù)繁殖。對能使細胞產(chǎn)生CPE的急性感染的病毒，我們可以利用這一特點在敏感細胞上直接測定其毒價（滴度），而對敏感細胞只能隱性感染的病毒的毒價測定，只能采取別的方法。如組培豬瘟疫苗可用兔和豬來測定。采用熒光抗體法測其熒光蝕斑數(shù)等等。第一節(jié)在組織培養(yǎng)的細胞上病毒的接種方法病毒在細胞上的接種方法一般有二種。一種是用細胞分離病毒，另一種為病毒在細胞上的傳代或大量繁殖病毒以備制苗或其它用處。以下分別介紹這二種方法：一、用敏感細胞分離病毒；只作簡略介紹。一般由動物體采集的病毒材料必須先經(jīng)過一番處理之后才能接種到細胞上去。1、 由動物體盡量無菌操作取得病毒材料；2、 將含病毒的組織材料剪碎，放到消過毒泠卻的乳缽中研磨，按1:4加入pH7.6的磷酸緩沖液（或漢克氏液）。研磨之后，放4C冰箱中浸出一小時或過夜，也可經(jīng)冰凍■-融化處理使細胞破碎，病毒充分釋放。3、 以3000轉(zhuǎn)/分離心沉淀15分鐘，吸取上清液，如有污染細菌的可疑，則應按每毫升加1000單位的雙抗處理。4、 取已形成良好細胞單層的細胞管或瓶，倒去營養(yǎng)液，將上述經(jīng)過處理的病毒懸液按一定量（視瓶之大小而定）接種到這些細胞管（瓶）中。同時設不接毒的正常細胞管為對照放37C溫箱中吸附30-60分鐘，然后加入維持液。pH調(diào)至7.6-7.,8仍放在37C溫箱中培養(yǎng)。定時用低倍鏡進行觀察細胞病變情況，如出現(xiàn)CPE則等到有50-75%的細胞產(chǎn)生病變（CPE）時，就溫箱取出放在-20C冰箱中（叫收毒），凍結(jié)備用。如果不出現(xiàn)細胞病變（CPE）則進行“盲目傳代”即于接毒后72-96小時，同樣放入-20C冰箱中。待凍結(jié)之后取出融解,如此再凍融一次,然后再接種到已長成良好單層的細胞管（瓶）中,定時觀察,如仍不出現(xiàn)病變,于72-96小時按上述同樣方法凍、融、傳代。一般如此樣進行盲目傳代至第五、十、十五代都用已知動物測試是否仍有病毒存在,如已無毒力,則不必再往下傳,如仍有毒力存在還可繼續(xù)下傳,傳若干代之后有可能出現(xiàn)細胞病變。二、 病毒在敏感細胞中的傳代：在疫苗生產(chǎn)中為了提高產(chǎn)品的滴度（毒價）或在研究工作中應用組培細胞培育弱毒,均需將病毒在組培細胞中連續(xù)傳代?，F(xiàn)在我們以六號病毒在幼倉鼠腎原代細胞中傳代為例。1、 按第一章第六節(jié)制備幼倉鼠細胞單層,待培養(yǎng)3-4天細胞長成良好的單層。2、 倒去細胞管（瓶）中的培養(yǎng)液,將已適應于此種細胞的六號病病毒組織培養(yǎng)細胞毒按各種培養(yǎng)瓶容量加入適當?shù)牟《疽海ㄟB霉素瓶加0.1-0.2毫升,100毫升方瓶加1毫升病毒液）然后放37C溫箱，讓病毒與細胞進行感作（吸咐）30-60分鐘。3、 將感作過的細胞取出加入不含犢牛血清的乳漢液，pH調(diào)至7.8左右（加不加犢牛血清，pH調(diào)多少要依不同病毒而異），各種培養(yǎng)瓶所加的量為：鏈霉素瓶加0.8-0?毫升，100毫升方瓶加9毫升（由于我們所用六號病病毒對倉鼠腎細胞是已適應的病毒，故也可以不用吸咐的時間，直接加入維持液）。放37C溫箱培養(yǎng)。4、 各種病毒使細胞出現(xiàn)病變的時間是不一致的,我們所用的上述病毒使細胞產(chǎn)生CPE可從3-4小時開始,到8-10小時則可達50-75%的細胞出現(xiàn)病變。到16-18小時則可達100%的病變。一般應在細胞有75%左右產(chǎn)生病變時收毒。三、 接毒后細胞病變（CPE）的觀察與判定標準：1、細胞病變的觀察：這里所談細胞的病變情況只是置于普通顯微鏡下的觀察。因此,只涉及到細胞的外觀，而細胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)的病變情況則在細胞學部分介紹。在急性感染的情況下，當病毒進入細胞后，破壞了細胞正常的生理代謝過程，使細胞發(fā)生病變。各種病毒引起的細胞病變有所差異，但多數(shù)為細胞變圓、皺縮、出現(xiàn)很多顆粒，顯微鏡下可見有似露珠似的一個個病變細胞，開始單個存在，逐漸一堆堆出現(xiàn)，此時，有些象葡萄串似的分布或干枝梅狀，進而病變成網(wǎng)狀連成片，最后病變細胞逐步或成片地脫落，以致整個單層全部脫落。以上從開始病變到全部脫落叫作細胞病變作用（即CPE）。如□蹄疫和豬水泡病病毒在豬腎和倉鼠腎細胞中，馬傳染性貧血病毒在驢白細胞中所引起的病變即為這種類型，有的病毒在接種細胞后，除產(chǎn)生上述病變外，還會使若干相鄰的細胞融合成一個多核的“巨細胞”，如鴨瘟病毒或新城疫弱毒在雞胚細胞上即如此。在觀察細胞病變時，應該觀察正常對照（未接毒）的細胞作為有無病變CPE）的標準。另外，還應很好注意與正常細胞老化加以區(qū)別。可用以下二點區(qū)別之：病變細胞，顯微鏡下觀察，比較園而光滑、折光率較強、好似露珠，轉(zhuǎn)動焦距可見有時病變細胞發(fā)暗。而正常衰老皺縮的細胞，立體感不很強，比病變細胞略小。病變細胞比較集中出現(xiàn)，呈現(xiàn)一堆堆的，而正常衰老的細胞則是平均分散