分子生物學(xué)-蛋白質(zhì)研究方法

蛋白質(zhì)的研究方第一節(jié)蛋白質(zhì)提分離純化蛋白測(cè)定蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分蛋白質(zhì)生物學(xué)活性分探索結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)一、蛋白質(zhì)樣品的提目的蛋白的獲

進(jìn)行推獲取蛋白質(zhì)的

獲取部分肽段氨基酸序碼序

采用免疫學(xué)方法達(dá)重組蛋

捕獲相應(yīng)蛋白二、經(jīng)典的 白質(zhì)分離純化流程獲取產(chǎn)物蛋各種組織和細(xì)胞的常用破碎方細(xì)胞破碎方 組織種旋刀式勻 大多數(shù)動(dòng)、植物組手動(dòng)式勻 柔軟的動(dòng)物組高壓勻 細(xì)菌、酵母、植物細(xì)研 細(xì)菌、植物細(xì)高速珠 細(xì)胞混懸酶 細(xì)菌、酵 超聲破 細(xì)胞混懸低滲裂 紅細(xì)胞、細(xì)凍融裂 培養(yǎng)細(xì)去污劑為雙極性(aathi)脂類分子，可在水中溶解。通常由線性或帶有分枝的碳?xì)浠衔镂膊亢徒Y(jié)構(gòu)各不相同的親水性頭部組成TritonX-100聚乙二醇辛基苯基NP-40乙基苯基聚乙二目的：保證蛋白質(zhì)PMSF(35ug/ml)苯甲基磺酰Pepstatin(0.7ug/ml)(胃蛋白酶抑制劑/抑肽素Aprotinin(500unit/ml)抑肽酶也稱胰蛋白酶抑制細(xì)胞內(nèi)有許多種還原成分，一旦細(xì)胞破由于和氧的接觸以及稀釋作用而使抗氧化成分減少，導(dǎo)致許多蛋白質(zhì)被氧化而失去活性，如巰基蛋白巰基乙醇二硫蘇糖醇(dithiothreitol,蛋白質(zhì)的環(huán)境因(salting離子交換層凝膠過濾層親和層230～300光譜學(xué)特190230～300電泳檢測(cè)SDS- 分子量測(cè)凝膠過濾層析沉降平衡超速離心動(dòng)態(tài)彈性光散射孔徑梯度電泳質(zhì)譜氨基酸序列測(cè)用抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)免疫印免疫共沉第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性定量分蛋白質(zhì)定性分析 蛋白質(zhì)定量分析 一、蛋白質(zhì)的含量測(cè)蛋白質(zhì)的含量測(cè)元素組成

化學(xué)顯色

蛋白質(zhì)元素組成的特由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量g每克樣品紫外光譜(A280)吸收這一方法可用來快速檢測(cè)溶液中是否含有蛋白質(zhì)成分。通常用于柱層析過程中檢測(cè)蛋白質(zhì)的洗脫峰原大吸收峰在280nm蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸

芳香族氨基酸的紫外吸 點(diǎn)?快對(duì)蛋白質(zhì)無破壞 點(diǎn)?不是嚴(yán)格的定量，適用于測(cè)定蛋核酸可引起強(qiáng)干擾作計(jì)算方法標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280-注意事項(xiàng)石英比色調(diào)零所用溶配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白所用溶光密度范考馬斯亮藍(lán)G-250檢測(cè)該法是基于考馬斯亮藍(lán)250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)。藍(lán)色復(fù)合物在595n波長處具有最大光吸收值，并與溶液中蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可檢測(cè)595n的光吸收值大小計(jì)算蛋白的含量所需時(shí)10 點(diǎn)?快速（反應(yīng)時(shí)間僅需2敏感，幾乎沒有蛋白質(zhì)損 點(diǎn)?對(duì)各種純化蛋白質(zhì)反應(yīng)不 計(jì)算方法標(biāo)準(zhǔn)注意事反應(yīng)10～15min后開始出現(xiàn)沉淀， 另法來校正，所測(cè)蛋白濃度Lowry檢測(cè)這種深藍(lán)色的復(fù)合物在745～750nm處有最大成正比，可根據(jù)750nm的光吸收值大小計(jì)算 點(diǎn)?一種可靠的蛋白質(zhì)定量方不同蛋白質(zhì)之間差別很 點(diǎn)?干擾物質(zhì)某些試劑不穩(wěn)使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變計(jì)算方法標(biāo)準(zhǔn)注意事項(xiàng)在加入試劑30min后呈色達(dá)到飽許多干擾物質(zhì)降低顏色反高鹽濃度可引起沉BCA(二喹啉甲酸)檢測(cè)這是近年來新研制的一種改進(jìn)的Lowry在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)分子中的肽鍵能與u2＋生成絡(luò)合物，同時(shí)將u2＋還原成＋。而BC試劑可敏感特異地與＋結(jié)合，形成穩(wěn)定的有顏色的復(fù)合物，在562處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可根據(jù)吸收值的大小來計(jì)算蛋白質(zhì)的含量優(yōu)點(diǎn)終產(chǎn)物穩(wěn)檢測(cè)敏感性缺點(diǎn)?巰基試劑和去垢劑干蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆的變第三節(jié)蛋白質(zhì)相對(duì)分子量測(cè)定分子量測(cè)(molecularweight,(ESI-沉降平衡超速離 動(dòng)態(tài)彈性光散凝膠層

孔徑梯度電（SDS-一、SDS測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子不連續(xù)系統(tǒng)原SDS凝膠分離 濃縮 裝加 電 卸板并進(jìn)行凝膠染SDS基本原影響遷移率的因十二烷基硫(SodiumDodecyl十二烷基磺(SodiumDodecylSulfonate于1mmol/L時(shí)，SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合比例為1.4gg蛋白質(zhì)，由于十二烷基硫酸根帶負(fù)電荷，使得樣品中各種蛋白質(zhì)與S形成的S蛋白質(zhì)復(fù)合物都帶有相同密度的負(fù)電荷，掩蓋了蛋白質(zhì)分子間天然的電荷差異S蛋白質(zhì)復(fù)合物分子構(gòu)型也幾乎相同雪茄煙形的長橢圓棒狀的復(fù)合物，而且具有相同的荷質(zhì)比，因此在SE中，S蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳遷移率只與其分子量有關(guān)，而不再受所帶電荷及分子形狀的影響，且在一定條件下，遷移率與分子量呈對(duì)數(shù)線性關(guān)系SDS測(cè)定分子量的操標(biāo)準(zhǔn)品的選擇及處待測(cè)樣品電泳分離及染相對(duì)遷移率的計(jì)ysisforSDS注意事選擇合適的膠濃SDS與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合程二硫鍵是否完全被還溶液中SDS的濃溶液的離子強(qiáng)蛋白質(zhì)的分子量范圍15～200KD之樣品中高濃度的陽離子可能會(huì)導(dǎo)致的沉淀，應(yīng)在加入樣品緩沖液之前將其除去二、凝膠過濾層基本原分子篩效洗脫體積與相應(yīng)分子量的關(guān)凝膠過濾測(cè)定分子量的操 第四節(jié)測(cè)定蛋白質(zhì)的等電等電(isoelectricpoint兩性電解質(zhì)性支持介(supporting pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pH pHIsoelectricReadyStripTMIPG5.5-6.3-

High-purityNarrowrangesforresolutionoflow-abundanceproteins gradientsforThree7cm,11cmand170.5mmx3.3第五蛋白質(zhì)的免疫印跡分印跡技術(shù)(blotting)是指將存在于凝膠中1975年，EdwenSouthern提出了分子印印跡技術(shù)的類別及應(yīng)DNA印跡技(Southern用 組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分RNA印跡技(Northern用于RNA的定性定蛋白質(zhì)的印跡分(Western用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研免疫印跡技術(shù)(iooting)一、免疫印跡分對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行半定量分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分生物大分子相互作用分二、免疫印跡分析的基本流蛋白樣轉(zhuǎn)移至固相與第二抗體交聯(lián)物溫育反顯

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)抗體檢樣品組織或細(xì)胞中提裂去污劑(SDS、TritonX-100、NP-40、Tween-蛋白酶抑制劑(PMSF、EDTA、Pepstatin、蛋白質(zhì)的定量(Bradford、BCA、工程表達(dá)重組產(chǎn)電泳分非變性蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)注意：在疊放硝酸纖維素膜、聚丙烯酰胺凝膠時(shí)，膜與膠之間要緊密貼在一起，中間不能有任何氣泡?。糠椒ǎ喊敫煞?、濕常用的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)種 微孔大 結(jié)合能 特 0.45 80-100

應(yīng)用廣20kD易丟 0.220.45

80-100170-200

20kD不易丟容量大、強(qiáng)度尼龍 480 用于核電轉(zhuǎn)移示意電轉(zhuǎn)移裝靶蛋白的免疫學(xué)封—對(duì)轉(zhuǎn)移膜上的潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行閉，防止抗體非特異性結(jié)合在膜上，BSA、脫脂奶與第二抗體反酶標(biāo)抗體常用酶堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase，膠體金標(biāo)記、125I標(biāo)記標(biāo)顯—AKP可催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(bromochloroindolylphosphate，BCIP)與氮藍(lán)四唑(niro-bluetetrazolium，NBT)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生深藍(lán)—HRP可催化底物顯色生成棕色化合物，顯—HRP可催化底tc所在的位

四、免疫印跡注意事SDS凝膠的濃膜的選電轉(zhuǎn)移（方向、電流、轉(zhuǎn)移效率充分封閉和洗抗體的使用（稀釋比例、分裝免疫檢測(cè)（顯色免疫共沉（Co-原優(yōu)缺可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白－蛋白質(zhì)相互作如用westernblot檢驗(yàn)，必須在實(shí)驗(yàn)前實(shí)驗(yàn)的關(guān)抗體的性質(zhì)?？贵w不同和抗原結(jié)合能力也不同，免染能結(jié)合未必能用在I（免疫共沉淀）反應(yīng)。建議仔細(xì)檢查抗體的說明書，特別是多抗的特異性是問題。為防止蛋白的分解，修飾，溶解抗原的緩沖液必須加蛋白酶抑制劑，低溫下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。考慮抗體/緩沖液的比例。抗體過少就不能檢出抗原，過多則就不能沉降在bads上，殘存在上清。緩沖劑太少則不能溶解抗原，過多則抗原被稀釋。實(shí)驗(yàn)步收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑冰上裂解30min12000rpm離心30min后取上清取少量裂解液以備westernblot分析，剩余裂解液加1μg相取10μlproteina瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，次3,000rpm離心3將預(yù)處理過的10μlproteina瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過proteina瓊脂糖珠偶連；免疫沉淀反應(yīng)后，在4°c以3,000rpm速度離心3min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清吸去，瓊脂糖珠用1ml裂SDS,westernblotting或質(zhì)譜儀分析Co-IP工作示意YY 利用westernblot確定捕獲蛋通過質(zhì)譜確定捕獲的蛋實(shí)驗(yàn)注意事Tritonx-100)。每種細(xì)胞的裂解條件是不一樣的，通過經(jīng)驗(yàn)確定。使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使使用對(duì)照抗體單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單兔多克隆抗體：正常兔確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非源非特異蛋白，單克隆抗體的使用