XXXX年 分子生物學實驗

分子生物學實驗實驗一DNA重組實驗

要求1、實驗室內(nèi)禁止飲食、勿高聲談話、隨意走動。2、課前預(yù)習、課中認真操作和課后的實驗報告。3、妥善保管好每組的實驗器具。4、實驗操作要求人人動手。5、每次實驗完畢要驗加樣槍的準確性，然后做好值日衛(wèi)生工作。第3周DNA重組實驗第4周原核表達蛋白的SDS電泳分析第5周WesternBlottingI第6周WesternBlottingII時間分配實驗內(nèi)容10:00-10:30酶切加樣10:30-12:3037℃酶切；原理講述12:30-13:30回收13:30-14:00連接加樣14:00-16:0025℃連接；休息16:0-16:30轉(zhuǎn)化16:30-17:3037℃孵育培養(yǎng)；倒平皿17:30-18:00涂布學習DNA的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將T載體上所攜帶的外源DNA酶切片段亞克隆到表達載體上。一、實驗?zāi)康亩?、實驗原理限制性?nèi)切酶可識別特定位點并切割DNA產(chǎn)生粘性末端或平端的外源片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接反應(yīng)；選擇表達載體pET28a多克隆位點上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現(xiàn)外源片段的克隆。實驗材料：

外源片段DNA——CHY基因的PCR產(chǎn)物；載體——pET28a-egfp（含有綠色熒光蛋白DNA片段）；BL21感受態(tài)細胞（鼎國公司）；培養(yǎng)皿；37℃搖床及培養(yǎng)箱。實驗試劑：限制性內(nèi)切酶(EcoRI;XhoI)（TaKaRa公司）；T4DNA連接酶；LB液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基；卡那霉素（kana）:工作濃度100μg/mL；氯仿/異戊醇（24:1）；無水乙醇；3MNaAc；70%乙醇；ddH2O。三、實驗材料與試劑凝乳酶四、實驗步驟1．載體pET28a-egfp和外源DNA片段的限制性酶切：（50μl反應(yīng)體系，用1.5mltube，冰上操作）試劑加樣量DNA5μlEcoRI1μlXhoI1μl10×buffer5μlddH2O38μl37℃反應(yīng)1hr。分別取8μl外源片段酶切產(chǎn)物和5μlpET28a-egfp酶切產(chǎn)物于1.0%凝膠檢測酶切是否完全；按2-5步純化、回收DNA。2．加入ddH2O200μl（擴大體積），加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000g離心10min；3．吸取上清200μl，加3MNaAc15μl和無水乙醇400μl，-20℃放置15分鐘以上；4．13000rpm離心10分鐘；5．倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風干后外源DNA溶于10μlddH2O（1.5mltube中），pET28a-egfp溶于10μlddH2O（1.5mltube中）；6．連接反應(yīng)（15μl體系）：試劑加樣量CHY10μlpET28a-egfp2.5μl10×buffer1.5μlT4Ligase1μl25℃30min7.取1只滅菌的EP離心管，a.每管加入感受態(tài)懸液50ul及連接產(chǎn)物或質(zhì)粒50-100ng15ul（無菌操作）；b.混勻（不可以振蕩），冰浴30min；c.取出放入42C水浴中熱休克90秒，不要搖動試管，迅速放入冰中，冰浴5min。d.向每管中加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基400ul，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)液?；靹蚝?，于37C（100～150rpm）溫和搖振培養(yǎng)60min，使細胞恢復正常生長狀態(tài)，并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（kanar）。8.制備含有適當抗生素的LB培養(yǎng)基平板。9.篩選培養(yǎng)：取轉(zhuǎn)化反應(yīng)液200l，均勻涂布于含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基平板上。將涂布好的平皿置37C平放20min，然后倒置培養(yǎng)12-16h。（期間應(yīng)注意觀察，當菌落生長良好，而相鄰菌落尚未相互重疊時，即停止培養(yǎng)。若發(fā)現(xiàn)菌落太多或太少時，應(yīng)改變轉(zhuǎn)化反應(yīng)液的用量，重新涂布培養(yǎng)。）1.使用酶時應(yīng)盡量減少其離開冰箱的時間，以免活性降低。酶通常保存在50%的甘油中，實驗中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10以下，否則，酶活性將受影響。2.吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌，每次吸頭用畢應(yīng)更換，不要互相污染試劑。3.加試劑前，應(yīng)短促離心10秒鐘，然后再打開管蓋，以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。4.防止雜菌和雜DNA的污染。整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等應(yīng)是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。5.離心操作一定要在低溫下進行，所用的水、Eppendorf管都要在冰上預(yù)冷，不能離開冰浴，否則細胞轉(zhuǎn)化率將會降低。6.37℃振蕩培養(yǎng)時間不宜過長，否則會出現(xiàn)很多的衛(wèi)星菌落和輕微的菌膜干擾。7.平板涂布重組體時，應(yīng)避免反復來回涂布，因為感受態(tài)細胞的細胞壁有了變化，過多的機械擠壓涂布會使細胞破裂、死亡，影響轉(zhuǎn)化效率。8.涂布后培養(yǎng)時間不宜超過24h，否則會出現(xiàn)衛(wèi)星菌落。五、注意事項試驗驗設(shè)設(shè)定定二二組組，，1、、宿宿主主菌菌涂涂布布；；2、、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化連連接接產(chǎn)產(chǎn)物物的的受受體體菌菌涂涂布布。。最后后比比較較培培養(yǎng)養(yǎng)好好的的平平皿皿，，可可以以看看到到：：①含含抗抗菌菌素素培培養(yǎng)養(yǎng)皿皿上上的的受受體體對對照照組組并并沒沒有有長長出出菌菌落落，，證證明明受受體體菌菌對對抗抗菌菌素素是是敏敏感感的的，，并并證證明明在在本本實實驗驗中中沒沒有有發(fā)發(fā)生生抗抗藥藥性性突突變變。。②轉(zhuǎn)化化連連接接產(chǎn)產(chǎn)物物的的受受體體菌菌在含含抗抗菌菌素素的的培培養(yǎng)養(yǎng)皿皿中中也也長長出出了了菌菌落落，，這這不不是是受受體體菌菌的的抗抗藥藥性性的的自自發(fā)發(fā)突突變變株株，，肯肯定定是是質(zhì)質(zhì)粒粒DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入入細細菌菌后后的的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化體體，，這這是是因因為為帶帶抗抗藥藥性性的的質(zhì)質(zhì)粒粒DNA轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入入細細菌菌后后，，使使轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化體體產(chǎn)產(chǎn)生生抗抗藥藥性性這這一一遺遺傳傳特特性性的的結(jié)結(jié)果果。。六、、結(jié)結(jié)果果觀觀察察及及分分析析的的原原則則由于于此此實實驗驗過過程程涉涉及及多多個個實實驗驗環(huán)環(huán)節(jié)節(jié)，，如如酶酶切切、、連連接接、、感感受受態(tài)態(tài)細細胞胞、、轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化等等各各方方面面的的效效率率，，因因此此在在實實驗驗中中經(jīng)經(jīng)常常會會出出現(xiàn)現(xiàn)一一些些問問題題。。如如：：1.酶酶切切時時所所加加的的DNA溶溶液液體體積積不不能能太太大大，，否否則則DNA溶溶液液中中其其他他成成分分會會干干擾擾酶酶反反應(yīng)應(yīng)。。2.DNA濃濃度度過過低低時時可可適適當當濃濃縮縮后后再再酶酶切切，，濃濃度度過過高高可可能能酶酶切切不不完完全全可可以以適適當當稀稀釋釋酶酶切切。。3.反反應(yīng)應(yīng)液液中中加加入入過過量量的的酶酶是是不不合合適適的的，，除除考考慮慮成成本本外外，，酶酶液液中中的的微微量量雜雜質(zhì)質(zhì)可可能能干干擾擾隨隨后后的的反反應(yīng)應(yīng)，，如如果果底底物物DNA較較多多可可以以延延長長酶酶反反應(yīng)應(yīng)時時間間。。七、、常常見見問問題題分分析析及及處處理理1.限限制制性性酶酶切切反反應(yīng)應(yīng)及及DNA連連接接反反應(yīng)應(yīng)要要注注意意哪哪些些要要點點？？2.如如果果一一個個DNA酶酶解解液液在在電電泳泳后后發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)DNA未未被被切切動動，，你你認認為為可可能能是是什什么么原原因因？？3.轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化化后后，，涂涂布布之之前前為為何何要要在在400μμLLB培培養(yǎng)養(yǎng)基基中中培培養(yǎng)養(yǎng)1h？？4.如如何何制制備備平平板板？？重重組組體體涂涂布布