海洋生物毒素的提取課件

海洋生物毒素的提取、分離和鑒定---------------------以麻痹性貝毒、河豚毒素為例一、麻痹性貝毒1、來源有害赤潮特別是有毒赤潮對(duì)人類生命健康和海洋生態(tài)系統(tǒng)的威脅日益嚴(yán)重，已引起人們的廣泛關(guān)注。有毒赤潮藻類可產(chǎn)生多種毒素，這些毒素可通過食物鏈在貝類或魚類等生物體內(nèi)累積放大，當(dāng)人們誤食這些染毒的海產(chǎn)品時(shí)，就會(huì)發(fā)生中毒死亡，因此，這些毒素又常被稱為貝毒素或魚毒素。2、作用機(jī)理

麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)是一類阻斷神經(jīng)細(xì)胞鈉離子通道，對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生麻痹作用的海洋生物毒素。該毒素對(duì)人體毒性極強(qiáng)，且無特效解救藥物，對(duì)人類健康影響很大。我國(guó)近海多種可食用貝類中均含有麻痹性貝毒，福建省東山縣廣東省大亞灣及臺(tái)灣省近年都發(fā)生因食用染毒貝類而引起多人中毒死亡事件!4、提取、分離和檢測(cè)技術(shù)①樣品采集扇貝采集，樣品采集后現(xiàn)場(chǎng)用水沖凈外殼，并用不銹鋼刀打開，將貝肉、性腺和消化腺分離，用紗布吸除多余水分，然后冰塊保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，-20度貯存。

②提取貝類PSP的提取方法主要采用AOAC法，該方法簡(jiǎn)單描述為:a、在稱重的燒杯中稱取100g均質(zhì)的樣品，加0.lmol/LHCl溶液100mL充分?jǐn)嚢?，檢查pH(pH應(yīng)為2.0-4.0，以3最佳)。需要時(shí)，可逐滴加入5mol/LHCl溶液或0.lmol/LNaOH溶液調(diào)整pH，加堿時(shí)速度要慢，同時(shí)需不斷攪拌，防止局部堿化破壞毒素。b、將混合物加熱，并徐徐煮沸5min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至2.0-4.0(勿>4.5)。③分離將混合物移至量筒中并稀釋至200mL。將混合物倒回?zé)瑪嚢柚辆|(zhì)狀，使其沉降至上清液呈半透明狀。利用超速離心機(jī)，將混合物或上清液以3000r/min離心5min?；蛘哂脼V紙過濾。④鑒定方法

a、小白鼠生物檢測(cè)法

PSP的小鼠生物法檢測(cè)程序已由美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)標(biāo)準(zhǔn)化(AOAC,1990)，并在世界范圍內(nèi)被廣泛接受。雖然小鼠生物法操作簡(jiǎn)單、能反應(yīng)樣品總的毒性，但也有很多不足的地方，如只能檢測(cè)毒性大小，而無法確定毒素的種類和含量;小鼠的不同品系、批次、大小對(duì)毒素的測(cè)定的靈敏度有很大的影響;實(shí)驗(yàn)結(jié)果可重復(fù)性、可比性差。c、細(xì)胞毒性檢測(cè)法根據(jù)離子通道類毒素可以專一性地作用于細(xì)胞膜離子通道的特點(diǎn)建立起來的細(xì)胞毒性檢測(cè)技術(shù)，可以快速敏感的檢測(cè)毒素。它是利用毒素對(duì)細(xì)胞的毒性作用來檢測(cè)毒素存在與否以及毒性大小的一種技術(shù)，可以直接體現(xiàn)所測(cè)樣品的毒性狀況。麻痹性貝毒（PSP)可以作用于Na+通道的1位點(diǎn)，阻斷Na+內(nèi)流，當(dāng)在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入Na+通道活化劑，細(xì)胞會(huì)由于Na+內(nèi)流過多而造成腫脹，甚至死亡，但如果同時(shí)加入具Na+通道阻斷作用的毒素PSP,Na+內(nèi)流會(huì)因拮抗作用而受到限制，使得細(xì)胞成活，由此可以確定毒素的存在，并根據(jù)細(xì)胞的成活率對(duì)毒素進(jìn)行定量分析。

二、河豚毒素1、河豚簡(jiǎn)介

河豚魚(Balloonfish)，屬硬骨魚綱、魷形目。世界上有200多種，可引起中毒的有9種。河豚主要分布在渤海、東海、黃海及江河下游，為近海與河川底層肉食性海產(chǎn)有毒魚類。河豚魚肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美，曾有“拼死吃河豚”之說，吃河豚中毒死亡者，在國(guó)內(nèi)外屢見不鮮，就是食用河豚經(jīng)驗(yàn)比較豐富的日本人，據(jù)說每年中毒死亡者也有幾百人之多。3、提取、分離和檢測(cè)技術(shù)①材料：棕斑腹刺豚。②TTX的提取取河豚魚的內(nèi)臟搗碎后，分為四份，分別加入5倍量的甲醇、乙醇、乙酸、水，然后將裝有四種不同溶劑的提取瓶置于60℃恒溫水浴鍋中8h，使TTX充分溶解于溶劑中。③分離取出三角瓶，3500rpm離心10min，分別收集上清液和固體物，將固體物再重復(fù)以上步驟2次，合并上清液。若脂肪過多可用乙醚進(jìn)行脫脂處理。將上述粗提液減壓蒸餾。得到的少量液體按照溶劑的不同編號(hào)為1號(hào)(乙酸提取),2號(hào)(甲醇提取),3號(hào)(乙醇提取),4號(hào)(水提取)處于冰箱中備用。④TTX的鑒定與檢測(cè)a、小白鼠生物檢測(cè)法選擇體重為25士2g左右的小白鼠，隨機(jī)分為兩組，分別腹腔注射0.8m1,1.0ml上述提取液，觀察小鼠癥狀。小白鼠生物檢測(cè)法結(jié)果與討論結(jié)果小白鼠經(jīng)腹腔注射四種溶劑提取的河豚內(nèi)臟提取液后，均呈現(xiàn)中毒癥狀，觀察癥狀如下:注射0.8ml樣品液的小鼠最初表現(xiàn)平靜，過30min左右開始渾身打顫，最后身體上的毛都濕了。但經(jīng)過5-6h后，又恢復(fù)平靜。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠也恢復(fù)正常，大約一天的時(shí)間，小鼠完全恢復(fù)正常。而注射1ml樣品液的小鼠最初也是表現(xiàn)為平靜，繼而出現(xiàn)不安，突然旋轉(zhuǎn)，大呼吸，最后突然跳起，翻身，四肢痙攣，腹部朝上死亡。該死亡癥狀與文獻(xiàn)報(bào)道的河豚毒素中毒死亡癥狀一致。小白鼠的死亡時(shí)間卻不一致，2,3,4號(hào)提取液致死時(shí)間幾乎相同，且時(shí)間較長(zhǎng)為6-8h，而1號(hào)提取液對(duì)小白鼠的致死時(shí)間相對(duì)較短為4一5h。討論本實(shí)驗(yàn)中采用的兩組小鼠實(shí)驗(yàn)因?yàn)樽⑸涞臉悠妨坎煌苯訉?dǎo)致了小鼠的不同行為癥狀，注射0.8ml樣品液的小鼠大量出汗、打顫、但沒有死亡，2天后恢復(fù)正常。通過對(duì)注射lmL樣品液的小白鼠中毒實(shí)驗(yàn)死亡癥狀的觀察，驗(yàn)證了甲醇、乙醇、乙酸、水這四種溶劑均能提取出河豚毒素，但死亡時(shí)間不一致可證明其提取的毒量的差異，因均取材于同一河豚魚故可抵消毒素的不同和毒力強(qiáng)弱這些因素帶來的影響，所以小白鼠從注射到死亡的時(shí)間越長(zhǎng)，說明其含毒量越低。即2,3,4號(hào)的含毒量較1號(hào)乙酸提取的河豚毒素含量低。從此實(shí)驗(yàn)可初步得出河豚毒素經(jīng)乙酸提取的效果要好于甲醇、乙醇、水三種溶劑。

瑞士卡瑪TLCscamner-3全自動(dòng)薄層層析儀薄層層析結(jié)果與討論結(jié)果:肉眼觀察1,2,3,4號(hào)提取液經(jīng)薄層層析后在層析板上分別呈現(xiàn)四個(gè)黃褐色斑點(diǎn)，這些斑點(diǎn)直徑不等，但展距(Rr值)相近，差別可能是溶劑的極性不同引起的。經(jīng)復(fù)日成像系統(tǒng)掃描后這四個(gè)斑點(diǎn)清晰可見:1號(hào)所得的主斑點(diǎn)的直徑相對(duì)較大。參考文獻(xiàn)：楊春,蘇秀榕,李太武等.低毒河豚魚毒素的提取和檢測(cè)[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2003-10-30岳亞軍;張律;游杰等免疫親和柱凈化-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚肉和肝臟中河鲀毒素[J]，中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2016-03-30

扇貝中麻痹性毒素的提取與分離純化林華娟“，秦小明‘，章超樺‘李政菊;胡蓉;吳霓;海南島近岸海域貝類中的麻痹性貝類毒素[J]，海洋環(huán)境科學(xué),2016-04-20江濤,雙殼貝類中麻痹性貝類毒素的提取