共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理

共聚焦激光掃描熒光顯微鏡共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!

什么是共聚焦激光掃描熒光顯微鏡？

共聚焦激光掃描熒光顯微鏡（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM

）

以激光作為光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術(shù)，對樣本進(jìn)行斷層掃描，以獲得高分辨率光學(xué)切片的熒光顯微鏡系統(tǒng)共聚焦系統(tǒng)細(xì)胞CT

共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!熒光和熒光顯微鏡一、熒光的基礎(chǔ)術(shù)語熒光物質(zhì)：某些物質(zhì)在特定波長范圍內(nèi)的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光長的光線—熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)稱熒光物質(zhì)或熒光素激發(fā)光(EXCITATION)：

能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線稱為該熒光素的激發(fā)光。激發(fā)/吸收光譜；吸收波峰(最大吸收波長)488nm520nm異硫氰酸熒光素(FITC)發(fā)射光(EMISSION):

發(fā)射光譜；發(fā)射波峰(最大發(fā)射波長)熒光探針：能產(chǎn)生熒光的特異性生物染料（PI,Dapi)、標(biāo)有熒光素的特異性蛋白結(jié)合物（熒光抗體）自發(fā)熒光(AUTOFLUORESCENCE):

組織或細(xì)胞中的某些成份受激發(fā)時(shí)可發(fā)出熒光—自發(fā)熒光。漂白(BLEACH)：

熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)，其發(fā)射熒光的能力逐漸下降并最終喪失—漂白。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!二、熒光顯微鏡術(shù)的基本原理熒光顯微鏡激發(fā)濾鏡：從光源中分濾出一定波長范圍的激發(fā)光。

帶通濾色鏡(BP)：有寬、窄帶之分。如：BP450-490

長、短通濾色鏡組合（LP+KP）：LP450+KP490

雙色鏡：雙色分光鏡；反射短波長，透過長波長。阻斷濾鏡：多為長通濾色鏡；LP490紫外藍(lán)綠高壓汞燈被熒光探針染色的生物樣本激發(fā)被標(biāo)記結(jié)構(gòu)的熒光光學(xué)圖像光學(xué)成像濾鏡分光488nm520nmFITC450nm490nm共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!共聚焦激光掃描熒光顯微鏡基本配置LaserandelectronicControlUnit激光光源及控制裝置Computer計(jì)算機(jī)Confocalscananddetectorunit共聚焦掃描及檢測裝置Microscope熒光顯微鏡Anti-vibrationtable防震臺LeicaTCSSP-2MPAOBSConfocalSystem共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!Nikon的EclipseC1Plus

1.性能卓越的平場復(fù)消色差TIRF物鏡（60x，100x），NA=1.49.。這是當(dāng)前數(shù)值孔徑最高的油浸物鏡2.四孔位針孔轉(zhuǎn)盤：用電腦控制針孔的大小，可在分辨率和光切厚度之間取得最佳平衡。3.時(shí)間間隔可變的TimeLapse:可以在拍攝過程中不同的時(shí)間段采用不同的時(shí)間間隔。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!3.優(yōu)點(diǎn)一.分辨率（0.18μm）二.可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)三.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片四.光譜掃描（分辨由光源波長，物鏡參數(shù)和針孔直徑等決定，如60X，NA1.4的物鏡水平分辨率約為0.2

μm，垂直分辨率約為0.5μm。）（細(xì)菌細(xì)胞1-2

μm，原核生物細(xì)胞1-10μm）共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!4.共聚焦原理利用照明針孔和探測針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和探測，并且被探測點(diǎn)位于焦平面。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來說是共軛的，因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn)。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!共聚焦原理1.點(diǎn)照明（為作圖方便已將光線發(fā)散角放大）共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!共聚焦原理消除衍射影響消除背景雜光共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!共聚焦原理焦平面上的像是最清晰的，從上面的圖可以看出，非焦平面點(diǎn)所成的像的光像被探測針孔擋住，不會進(jìn)入光探頭，所以焦平面點(diǎn)成像使像更清晰。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!5.掃描模式一.X—Y軸掃描二.Z軸掃描共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!X—Y軸掃描（1）單光束掃描模式共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!X—Y軸掃描（2）多光束掃描共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!同樣可以實(shí)現(xiàn)

X—Z軸，Y—Z軸掃描共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!光學(xué)切片

通過精細(xì)平面光切，形成生物樣品不同平面的精細(xì)圖象，將一個(gè)連續(xù)的光切圖象Z軸重疊就可形成一個(gè)完整的三維圖象共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!6.整體結(jié)構(gòu)

光電倍增管掃瞄裝置空氣冷卻氬激光器激發(fā)光濾器共焦針孔屏障濾光片(檢流計(jì)物鏡共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!熒光顯微鏡的不足:1.無法實(shí)現(xiàn)對熒光,透射光的同時(shí)采集,無法實(shí)現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r(shí)采集及共定位。2.熒光散射光太強(qiáng)，造成實(shí)際分辨率的大大下降。3.熒光漂白及對細(xì)胞組織的照射損傷。4.無法對樣品進(jìn)行斷層掃描,完成3D的工作。5.濾鏡對熒光信號衰減大,靈敏度—熒光強(qiáng)度不夠。6.可以觀查活細(xì)胞或組織但細(xì)胞或組織內(nèi)結(jié)構(gòu)高度重疊7.只能在二維環(huán)境下觀察。8.樣品不能太厚。9.熒光的串繞無法回避。10.放大倍率小。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!1.典型產(chǎn)品Nikon的EclipseC1Plus共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!2.基本組成一、基本組成（一）激光器:多線氬離子(458nm,488nm,514nm)、氦氖綠(543nm)、氦氖紅(633nm)（二）掃描器(內(nèi)裝有針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光單色器及檢測器)（三）光學(xué)裝置：根據(jù)樣品中熒光信號的強(qiáng)弱、大小及分布，調(diào)節(jié)激光能量、檢測孔光欄、光電倍增管（PMT）的檢測范圍、物鏡和電子放大倍數(shù)（zoom），以利于采集各種熒光信號。（四）計(jì)算機(jī)圖像存儲與處理及控制系統(tǒng)：實(shí)現(xiàn)了圖像的優(yōu)化、三維重建，實(shí)現(xiàn)了全自動程序化控制采集（檢測）樣品熒光圖像的時(shí)間和空間，并和同時(shí)采集樣品中多重?zé)晒庑盘柕姆纸饧昂铣蓤D像，對其進(jìn)行定量測定。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!優(yōu)點(diǎn)共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!共聚焦原理共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!共聚焦原理假設(shè)是場照明（非共聚焦），會導(dǎo)致：一.發(fā)生衍射，使像模糊；

二.散射光干擾（即除了成像點(diǎn)外，其余點(diǎn)處有散射光進(jìn)入探測針孔）；

而點(diǎn)照明則不會有這些問題。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!共聚焦原理2.焦平面點(diǎn)成像共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!共聚焦原理所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像質(zhì)量。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!X—Y軸掃描（1）單光束掃描模式其中最常見的掃描安排結(jié)合了兩個(gè)獨(dú)立的掃描鏡，具有中繼光學(xué)系統(tǒng)。移動的垂直軸的反射鏡即在試樣上產(chǎn)生X—Y平面的掃描。但中間需要增加高級別的像差校正光學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致發(fā)光效率降低。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!X—Y軸掃描（2）多光束掃描（尼普可夫圓盤掃描）多光束掃描技術(shù)提供了一個(gè)替代的單光束掃描配置照明效率低，而且掃描速度更快。其中旋轉(zhuǎn)盤掃描儀有數(shù)百個(gè)孔，其功能作為照明和探測的針孔。由于磁盤掃描顯微鏡形成的實(shí)像，可以直接位于CCD照相機(jī)的圖像平面中。盡管這方面的優(yōu)勢，它允許實(shí)時(shí)聚焦和成像的動態(tài)過程，有幾個(gè)缺點(diǎn)限制了磁盤掃描共聚焦系統(tǒng)的實(shí)際效用。其中最嚴(yán)重的是典型的依賴于傳統(tǒng)的廣譜光源，和在磁盤發(fā)生極端的光損失。共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!X—Y軸掃描奧林巴斯FluoView300激光共聚焦掃描系統(tǒng)光電倍增器雙色鏡激發(fā)和發(fā)射濾波滑動器強(qiáng)度調(diào)整密度塔激發(fā)發(fā)射和射柱準(zhǔn)直儀電源X-Y檢流計(jì)鏡掃描控制器出入口透鏡系統(tǒng)共聚焦激光熒光顯微鏡簡介以及原理共31頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!Z軸掃描通常的方法是通過計(jì)算機(jī)控制的馬達(dá)以預(yù)先設(shè)定的步距移動