微生物常規(guī)鑒定技術(shù)(帶圖片)

..微生物常規(guī)鑒定技術(shù)一、形態(tài)結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀察１、微生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察主要是通過染色,在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)〔包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽孢等及染色特性進(jìn)行觀察,直觀地了解細(xì)菌在形態(tài)結(jié)構(gòu)上特性,根據(jù)不同微生物在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。２、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落〔colony。不同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁殖,所形成的菌落特征有很大差異,而同一種的細(xì)菌在一定條件下,培養(yǎng)特征卻有一定穩(wěn)定性。,以此可以對不同微生物加以區(qū)別鑒定。因此,微生物培養(yǎng)特性的觀察也是微生物檢驗鑒別中的一項重要內(nèi)容。１細(xì)菌的培養(yǎng)特征包括以下內(nèi)容：在固體培養(yǎng)基上,觀察菌落大小、形態(tài)、顏色〔色素是水溶性還是脂溶性、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養(yǎng)中的表面生長情況〔菌膜、環(huán)混濁度及沉淀等。半固體培養(yǎng)基穿刺接種觀察運動、擴(kuò)散情況。２霉菌酵母菌的培養(yǎng)特征：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體,在固體培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的很相似,只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培養(yǎng)也和細(xì)菌相似,有均勻生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲狀體,菌絲粗長,在條件適宜的培養(yǎng)基里,菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色,因而菌落邊緣和中心,正面和背面顏色常常不同,如青霉菌：孢子青綠色,氣生菌絲無色,基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。革蘭氏染色:革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌〔G+和革蘭氏陰性菌〔G—兩大類,是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法。該染色法所以能將細(xì)菌分為G+菌和G—菌,是由這兩類菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分的不同所決定的。G—菌的細(xì)胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì),而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低,故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì),增加了細(xì)胞壁的通透性,使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出,結(jié)果細(xì)菌就被脫色,再經(jīng)蕃紅復(fù)染后就成紅色。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高,類脂質(zhì)含量少,經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小,通透性降低,因此細(xì)菌仍保留初染時的顏色步驟：〔1涂片：涂片方法與簡單染色涂片相同。〔2晾干：與簡單染色法相同?！?固定,與簡單染色法相同〔4結(jié)晶紫色染色：將玻片置于廢液缸玻片擱架上,加適量〔以蓋滿細(xì)菌涂面的結(jié)晶紫染色液染色1分鐘。〔5水洗：傾去染色液,用水小心地沖洗?！?媒染：滴加盧哥氏碘液,媒染1min?！?水洗：用水洗去碘液。〔8脫色：將玻片傾斜,連續(xù)滴加95%乙醇脫色20—25s至流出液無色,立即水洗?！?復(fù)染：滴加蕃紅復(fù)染5min?！?0水洗：用水洗去涂片上的蕃紅染色液?！?1晾干：將染好的涂片放空氣中晾干或者用吸水紙吸干?！?2鏡檢：鏡檢時先用低倍,再用高倍,最后用油鏡觀察,并判斷菌體的革蘭氏染色反應(yīng)性?！?3實驗完畢后的處理：①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈,a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2—3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2—3次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。②看后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干Aseptictechnique:Streakplate:PourplatePourplateSpreadplateSpreadplate二、生理生化試驗微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物,生化反應(yīng)常用來鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)有：1、尿素酶〔Urease試驗有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶,將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨,使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性,酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶,因為不論底物尿素是否存在,細(xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。試驗方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中,搖均,于36±1℃培養(yǎng)10,60和120min,分別觀察結(jié)果?；蛲坎疾⒋┐探臃N于瓊脂斜面,不要到達(dá)底部,留底部作變色對照。培養(yǎng)2,4和24h分別觀察結(jié)果,如陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至4天,作最終判定,變?yōu)榉奂t色為陽性。2、氧化酶〔Oxidase試驗氧化酶亦即細(xì)胞色素氧化酶,為細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的終末呼吸酶,氧化酶先使細(xì)胞色素C氧化,然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對苯二胺氧化,產(chǎn)生顏色反應(yīng)。試驗方法：在瓊脂斜面培養(yǎng)物上或血瓊脂平板菌落上滴加試劑1~2滴,陽性者Kovacs氏試劑呈粉紅色~深紫色,Ewing氏改進(jìn)試劑呈藍(lán)色。陰性者無顏色改變。應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)判定試驗結(jié)果。注意事項：鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液容易氧化,溶液應(yīng)裝在棕色瓶中,并在冰箱內(nèi)保存,如溶液變?yōu)榧t褐色,即不宜使用。鐵、鎳鉻絲等金屬可催化二甲基對苯撐二胺呈紅色反應(yīng),若用它來挑取菌苔,會出現(xiàn)假陽性,故必須用白金絲或玻璃棒〔或牙簽來挑取菌苔。在濾紙上滴加試劑,以剛剛打濕濾紙為宜,如濾紙過濕,會防礙空氣與菌苔接觸,從而延長了反應(yīng)時間,造成假陰性。3、過氧化氫酶的測定過氧化氫酶又稱接觸酶,能催化過氧化氫分解水和氧。試劑：3－10％過氧化氫〔H2O2菌種培養(yǎng)：將測試菌種接種于合適的培養(yǎng)基斜面上,適溫培養(yǎng)18－24h。試驗方法：取一干凈的載波片,在上面滴1滴3－10％的H2O2,挑取1環(huán)培養(yǎng)18－24h的菌苔,在H2O2溶液中涂抹,若有氣泡〔氧氣出現(xiàn),則為過氧化氫酶陽性,無氣泡者為陰性。也可將過氧化氫溶液直接加入斜面上,觀察氣泡的產(chǎn)生。注意事項：過氧化氫酶是1種以正鐵血紅素作為輔基的酶,所以測試菌所生長的培養(yǎng)基不可含有血紅素或紅血球。4、甲基紅〔MethylRed試驗?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖,在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸,進(jìn)一步分解中,由于糖代謝的途徑不同,可產(chǎn)生乳酸,琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物,可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下,使甲基紅指示劑變紅。試驗方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許,接種于MR－VP生化鑒定管,于36通用培養(yǎng)基,培養(yǎng)于36±1°C或30°C〔以30°C較好3~5天,從第二天起,每日取培養(yǎng)液1ml,加甲基紅指示劑1~2滴,陽性呈鮮紅色,弱陽性呈淡紅色,陰性為黃色。迄至發(fā)現(xiàn)陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。甲基紅為酸性指示劑,pH范圍為4.4~6.0,其pK值為5.0。故在pH5.0以下,隨酸度而增強(qiáng)黃色,在pH5.0以上,則隨堿度而增強(qiáng)黃色,在pH5.0或上下接近時,可能變色不夠明顯,此時應(yīng)延長培養(yǎng)時間,重復(fù)試驗。5、V-P試驗?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,丙酮酸縮合,脫羧成乙酰甲基甲醇,后者在強(qiáng)堿環(huán)境下,被空氣中氧氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物,稱V－P〔+反應(yīng)。試驗方法：１O(jiān)’Meara氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基,于36±1°C培養(yǎng)48h,培養(yǎng)液1ml加O’Meara試劑〔加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液1ml,搖動試管1~2min,靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,若4h內(nèi)不呈現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張在48~50°C水浴放置2h后判定結(jié)果者。２Barritt氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基,于36±1°C培養(yǎng)4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°Cα萘酚〔2-na-phthol純酒精溶液0.6ml,再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml,搖動2~5min,陽性菌常立即呈現(xiàn)紅色,若無紅色出現(xiàn),靜置于室溫或36±1°C恒溫箱,如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、可判定為陰性。３快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán),乳化接種于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氫氧化鈉水溶液2滴,振動后放置5min,判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培養(yǎng)物不能使用。本試驗一般用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄球菌等其它細(xì)菌時,通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生,故應(yīng)省去或以氯化鈉代替。6、含碳化合物的利用細(xì)菌能否利用某些含碳化合物作為唯一碳源,反映該菌是否產(chǎn)生代謝這種化合物的有關(guān)酶系,因而作為鑒定依據(jù)。測定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多,因種而異。現(xiàn)介紹1種合成的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,有些細(xì)菌還可適當(dāng)補(bǔ)加各種維生素。培養(yǎng)基可制成液體,分裝試管,也可制成固體平板。可用于測定的底物種類很多,有單糖、雙糖、糖醇、脂肪酸、羥基酸及其他有機(jī)酸、醇、各種氨基酸類胺類以及碳?xì)浠衔锏取Ｌ堑暮恳话銥?％,醇類酚類等的含量一般為0.1－0.2％,氨基酸的含量一般為0.5％。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒?可在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),或加入到45℃的固體培養(yǎng)基中,振蕩后立即倒成平板。有些底物不宜用高壓滅菌,可用過濾法滅菌后加入已滅菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,某些醇類和酚類不必滅菌。接種和觀察結(jié)果：菌種最好做成懸液,避免帶入少量碳源干擾試驗結(jié)果。平板培養(yǎng)用接種環(huán)點種,液體培養(yǎng)則用直針接種。每一測定菌必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對照。適溫培養(yǎng)2、5、7天后觀察,凡測定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中生長情況,明顯超過空白培養(yǎng)基的生長量為陽性,否則為陰性。假若兩種培養(yǎng)基上生長情況差別不明顯,開在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種3次,如差別仍不明顯則以陰性論。7、葡萄糖的氧化發(fā)酵試驗在細(xì)菌鑒定中,糖類發(fā)酵產(chǎn)酸是1項重要依據(jù)。細(xì)菌對糖類的利用有2種類型：1種是從糖類發(fā)酵產(chǎn)酸,不需要以分子氧作為最終受氫體,稱發(fā)酵型產(chǎn)酸；另一種則以分子氧作為最終受氫體,稱氧化型產(chǎn)酸。前者包括的菌種類型為多數(shù)。氧化型產(chǎn)酸量較少,所產(chǎn)生的酸常常被培養(yǎng)基中的蛋白胨分解時所產(chǎn)生的胺所中和,而不表現(xiàn)產(chǎn)酸。為此,Hugh和Leifson提出一種含有低有機(jī)氮的培養(yǎng)基,用以鑒定細(xì)菌從糖類產(chǎn)酸是屬氧化型產(chǎn)酸或發(fā)酵型產(chǎn)酸。這一試驗廣泛用于細(xì)菌鑒定。一般用葡萄糖作為糖類代表。也可利用這一基礎(chǔ)培養(yǎng)基來測定細(xì)菌從其他糖類或醇類產(chǎn)酸的能力。〔1接種：以18－24h的幼齡菌種,穿刺接種在上述培養(yǎng)基中,每株菌接4管,其中2管用油封蓋〔凡士林：液體石蠟＝1：1混合后滅菌,約加0.5－1厘米厚,以隔絕空氣為閉管。另2管不封油為開管,同時還要有不接種的閉管作對照。適溫培養(yǎng)1、2、4、7天觀察結(jié)果。〔2結(jié)果觀察：氧化型產(chǎn)酸――僅開管產(chǎn)酸,氧化作用弱的菌株往往先在上部產(chǎn)堿〔1－2d,后來才稍變酸。發(fā)酵型產(chǎn)酸則開管及閉管均產(chǎn)酸,如產(chǎn)氣,則在瓊脂柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡。8、糖或醇類發(fā)酵試驗不同微生物分解利用糖類的能力有很大差異,或能利用或不能利用,能利用者,或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣?？捎弥甘緞┘鞍l(fā)酵管檢驗。試驗方法：以無菌操作,用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許,接種于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管,若為半固體培養(yǎng)基,則用接種針作穿刺接種。接種后,置36±1.0°C培養(yǎng),每天觀察結(jié)果,檢視培養(yǎng)基顏色有無改變〔產(chǎn)酸,小倒管中有無氣泡,微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性,若為半固體培養(yǎng)基,則檢視沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡,有時還可看出接種菌有無動力,若有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。本試驗主要是檢查細(xì)菌對各種糖、醇和糖苷等的發(fā)酵能力,從而進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別,因而每次試驗,常需同時接種多管。一般常用的指示劑為酚紅、溴甲酚紫,溴百里藍(lán)和An-drade指示劑。注：對于糖醇類發(fā)酵現(xiàn)在一般用糖、醇類細(xì)菌微量生化鑒定管在36℃18－24h即可出結(jié)果。9、硝酸鹽〔Nitrate還原試驗有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力,可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。試驗方法：臨試前將試劑的A〔磺胺酸冰醋酸溶液和B〔α－萘胺乙醇溶液試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面,立即或于10min內(nèi)呈現(xiàn)紅色即為試驗陽性,若無紅色出現(xiàn)則為陰性。用α-萘胺進(jìn)行試驗時,陽性紅色消退很快、故加入后應(yīng)立即判定結(jié)果。進(jìn)行試驗時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對照。α-萘胺具有致癌性、故使用時應(yīng)加注意。10、靛基質(zhì)〔Imdole試驗?zāi)承┘?xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚。吲哚的存在可用顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。吲哚與對二甲基氨基苯醛結(jié)合,形成玫瑰吲哚,為紅色化合物。試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管,于36±1C培養(yǎng)24h時后,取約2ml培養(yǎng)液,加入Kovacs氏試劑2~3滴,輕搖試管,呈紅色為陽性,或先加少量乙醚或二甲苯,搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì),待其浮于培養(yǎng)液表面后,再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴,在接觸面呈紅色,即為陽性。實驗證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性反應(yīng),若先用二甲苯或乙醚等進(jìn)行提取,再加試劑,則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色,因而結(jié)果更為可靠。11、三糖鐵〔TSI瓊脂試驗試驗方法：以接種針挑取待試菌可疑菌落或純培養(yǎng)物,穿刺接種并涂布于斜面,置36±1℃培養(yǎng)18~24h,觀察結(jié)果。本試驗可同時觀察乳糖和蔗糖發(fā)酵產(chǎn)酸或產(chǎn)酸產(chǎn)氣〔變黃；產(chǎn)生硫化氫〔變黑。葡萄糖被分解產(chǎn)酸可使斜面先變黃,但因量少,生成的少量酸,因接觸空氣而氧化,加之細(xì)菌利用培養(yǎng)基中含氮物質(zhì),生成堿性產(chǎn)物,故使斜面后來又變紅,底部由于是在厭氧狀態(tài)下,酸類不被氧化,所以仍保持黃色。12、氨基酸脫羧酶的測定有些細(xì)菌含有氨基酸脫羧酶,使羧基釋出,生成胺類和二氧化碳。此反應(yīng)在偏酸的條件下進(jìn)行。當(dāng)培養(yǎng)基含胺類時呈堿性反應(yīng),使指示劑變色。接種與觀察結(jié)果：用幼齡培養(yǎng)液作為菌種,直接接種。接種后封油,對照管與測定管同時接種封油。腸肝菌科的細(xì)菌于37℃培養(yǎng)4天觀察。當(dāng)指示劑呈紫色或帶紅色調(diào)的紫色者為陽性,呈黃色者為陰性。對照管應(yīng)呈黃色反應(yīng)。13、硫化氫〔H2S試驗有些細(xì)菌可分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸或含硫化合物,而產(chǎn)生硫化氫氣體,硫化氫遇鉛鹽或低鐵鹽可生成黑色沉淀物。試驗方法：在含有硫代硫酸鈉等指示劑的培養(yǎng)基中,沿管壁穿刺接種,于36±1℃培養(yǎng)24~28h,培養(yǎng)基呈黑色為陽性。陰性應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至6天。也可用醋酸鉛紙條法：將待試菌接種于一般營養(yǎng)肉湯,再將醋酸鉛紙條懸掛于培養(yǎng)基上空,以不會被濺濕為適度；用管塞壓住置36±1℃培養(yǎng)1~6天。紙條變黑為陽性。14、檸檬酸鹽或丙酸鹽的利用某些細(xì)菌能利用檸檬酸鹽或丙酸鹽作為碳源,及磷酸胺作為氮源,將檸檬酸分解為二氧化碳,則培養(yǎng)基中由于有游離鈉離子存在而呈堿性。接種與觀察結(jié)果：取幼齡菌種接種于斜面上,適溫培養(yǎng)3－7天,培養(yǎng)基呈堿性〔藍(lán)色者為陽性反應(yīng),不變者則為陰性。15、利用丙二酸鹽試驗丙二酸鹽是三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶的抑制劑。能否利用丙二酸鹽,也是細(xì)菌鑒定中的一個鑒別性特征。許多微生物代謝有三羧酸循環(huán),而琥珀酸脫氫是三羧酸循環(huán)的一個環(huán)節(jié),丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶,與丙二酸不被分解,所以琥珀酸脫氫酶被占據(jù),不能釋放出來催化琥珀酸脫氫反應(yīng),抑制了三羧酸循環(huán)。接種和觀察結(jié)果：用幼齡菌種接種測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基,于適溫培養(yǎng)1－2d,觀察培養(yǎng)基變色情況。如測定培養(yǎng)基生長并變藍(lán)色,表示可利用丙二酸鹽,為陽性結(jié)果。反之,如測定培養(yǎng)基未變色,而空白對照培養(yǎng)基生長,則為陰性,即不利用丙二酸鹽。16、葡萄糖酸鹽的氧化假單胞菌屬和腸道桿菌科的細(xì)菌,可氧化葡萄糖酸為2－酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸無還原性基團(tuán),氧化后形成酮基,則可將斐林氏試劑的呈藍(lán)色的銅鹽還原為磚紅色的Cu2O沉淀。試驗方法：用pH7.2的磷酸緩沖液配制成含1％葡萄糖酸鹽〔可用葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸鈣的溶液。分裝試管,每管2mL。刮取適溫培養(yǎng)18－24小時的菌苔至2mL的葡萄糖酸鹽溶液中制成濃的菌懸液,置30℃過夜,然后每管加入0.5mL的斐林試劑,放在沸水浴中加熱10分鐘,試管中液體由藍(lán)色變?yōu)辄S綠,綠橙色或出現(xiàn)紅色沉淀者為陽性反應(yīng),如溶液不變色者為陰性。17、硫化氫-靛基質(zhì)-動力〔SIM瓊脂試驗試驗方法：以接種針挑取菌落或純養(yǎng)物穿刺接種約1/2深度,置36±1℃培養(yǎng)18~24h,觀察結(jié)果。培養(yǎng)物呈現(xiàn)黑色為硫化氫陽性,混濁或沿穿刺線向外生長為有動力,然后加Kovacs氏試劑數(shù)滴于培養(yǎng)表面,靜置10min,若試劑呈紅色為靛基質(zhì)陽性。培養(yǎng)基未接種的下部,可作為對照。本試驗用于腸桿菌科細(xì)菌初步生化篩選,與三糖鐵瓊脂等聯(lián)合使用可顯著提高篩選功效。18、β-半乳糖苷酶〔ONPG的測定本試驗應(yīng)用于腸肝菌科的鑒定。測定步驟：將測定菌接種于TSI斜面上,培養(yǎng)于37℃18h〔或其他最適溫度挑取1大環(huán)菌苔入約0.25mL的生理鹽水中制成菌懸液,每管加1滴甲苯,搖勻〔有助于酶的釋放,于37℃放置5分鐘。在菌懸液中加入0.25mL的0.75mol/LONPG,測定管置于37℃水浴培養(yǎng)。經(jīng)30分、1、2、3、……24h進(jìn)行觀察,如有黃色者則為陽性。19、耐鹽性試驗本試驗是觀察滲透壓對細(xì)菌生長的影響。由于不同菌類耐鹽性不同,故常以此作為鑒別特征。一般可根據(jù)不同種類的菌株,選擇其適合生長的培養(yǎng)基,在其中加入不同量的NaCl,接種后觀察其生長與否,以判斷其耐鹽性。以肉湯培養(yǎng)液根據(jù)鑒定需要,配成不同濃度的NaCl,如2％、3.5％、5％、7％、10％等。培養(yǎng)基要求十分澄清,接種時應(yīng)采用幼齡菌液,直針接種,適溫培養(yǎng)3－7d,與未接種的對照管對比,目測生長情況。20、卵磷脂酶的測定菌體如存在有卵磷脂酶,就能使卵磷脂分解生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿。接種與觀察結(jié)果：將測試菌的菌液,環(huán)接在有卵黃的試管和不加卵黃的對照管中,適溫培養(yǎng)1、3或5天觀察。假若與對照管相比較,在卵黃胰胨液中或表面,形成白色沉淀者,則為陽性反應(yīng),表示卵磷脂被分解,生成脂肪和水溶性的磷酸膽堿,說明有卵磷酶的存在。另一種方法：以無菌操作取出卵黃,放入滅菌的三角瓶中,加相當(dāng)于等量的生理鹽水搖勻后,取10mL卵黃液加入到溶化的約50－55℃的200mL肉汁胨瓊脂培養(yǎng)基中,混合均勻后倒入培養(yǎng)皿,制成卵黃平板,過夜后即可使用。接種與觀察結(jié)果：將測試菌點接在卵黃平板上,每皿可分散點接4－5株菌、〔芽孢桿菌以點接1－2株菌為宜以不影響結(jié)果觀察為度,如測試厭氧菌,則須在上面加蓋無菌的蓋玻片。每株菌至少重復(fù)點接兩皿。適溫培養(yǎng)1－2d觀察,在菌落周圍形成乳白色混濁環(huán),表示卵磷脂被分解,生成脂肪,說明該菌株有卵磷脂酶存在。21、石蕊牛奶的反應(yīng)牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白,在牛奶中加入石蕊是作為酸堿指示劑和氧化還原指示劑。石蕊在中性時呈淡紫色,酸性時呈粉紅色,堿性呈藍(lán)色,還原時則自上而下地褪色變白。細(xì)菌對牛奶的作用有一下幾種：產(chǎn)酸――細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,使石蕊變紅。產(chǎn)堿――細(xì)菌分解酪蛋白產(chǎn)生堿性物質(zhì),使石蕊變藍(lán)。胨化――細(xì)菌產(chǎn)生蛋白酶,使酪蛋白分解,故牛奶變得比較澄清。酸凝固――細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,使石蕊變化,當(dāng)酸度很高時,可使牛奶凝固。凝乳酶凝固――有些細(xì)菌能產(chǎn)生凝乳酶,使牛奶中的酪蛋白凝固,此時石蕊常呈藍(lán)色或不變色。還原――細(xì)菌生長旺盛,使培養(yǎng)基氧化還原電位降低,因此石蕊還原褪色。接種與觀察結(jié)果：接種待測菌株,適溫培養(yǎng)3、5、7d或14d,按上述特征觀察和記錄牛奶產(chǎn)酸、產(chǎn)堿、凝固或胨化等反應(yīng)。22、酪素水解試驗〔酪蛋白水解牛奶平板的制備：取5g脫脂奶粉加入50mL蒸餾水中〔或用50mL脫脂牛奶,另稱1.5g瓊脂溶于50mL蒸餾水中,將兩液分開滅菌。待冷至45－50℃時,將兩液混勻倒平板,即成牛奶平板。將平板倒置過夜,使表面水分干燥,然后將菌種點接在平板上,每皿可點接3－5株菌。適溫培養(yǎng)1、3、5天,記錄菌落周圍和下面酪素是否已被分解而呈透明。配制該培養(yǎng)基時,切勿將牛奶和瓊脂混合滅菌,以防牛奶凝固。23、酪氨酸水解將L－酪氨酸0.5g懸浮于10mL蒸餾水中,8磅20分鐘滅菌,然后于100mL無菌的營養(yǎng)肉湯瓊脂混合,傾倒平板,待凝固后,將測試菌接種于平皿上,培養(yǎng)7到14d,記錄酪氨酸結(jié)晶是否被水解而變透明。24、苯丙氨酸脫氨試驗?zāi)承┘?xì)菌〔如變形桿菌具有苯丙氨酸脫氨酶,能將苯丙氨酸氧化脫氨,形成苯丙酮酸,苯丙酮酸遇到三氯化鐵呈藍(lán)綠色。本試驗用于腸肝菌科和某些芽孢桿菌屬的鑒定。接種與觀察結(jié)果：將菌種接種于該培養(yǎng)基斜面上,適溫培養(yǎng)3－7d〔某些芽孢桿菌須培養(yǎng)21d。取10％的FeCl3水溶液4－5滴,滴加在生長菌苔的斜面上,當(dāng)斜面和試劑液面處呈藍(lán)綠色時為陽性反應(yīng),表示從苯丙氨酸形成苯丙酮酸。25、產(chǎn)糊精結(jié)晶試驗?zāi)承┬柩跹挎邨U菌能產(chǎn)生淀粉酶,使淀粉水解為糊精。該反應(yīng)僅用于區(qū)別多粘芽孢菌,浸麻芽孢菌和環(huán)狀芽孢菌的培養(yǎng)物。在大試管中〔200X20mm裝碾過的小麥〔或燕麥0.5g,CaCO30.2g,蒸餾水10mL,滅菌后接種,35℃培養(yǎng)3、5和7d后,取1滴盧哥爾氏碘液混勻,干燥后,用顯微鏡觀察有暗褐色或藍(lán)色的六角形結(jié)晶的糊精,假若大量形成,則排列為扇形或針狀。26、從甘油產(chǎn)生二羥基丙酮本試驗主要是用于區(qū)分醋酸單胞菌屬和假單胞菌屬以及某些芽孢桿菌的鑒定。生酮反應(yīng)是由相應(yīng)的多元醇的脫氫酶的作用,此反應(yīng)就是測定有否這些脫氫酶。接種與觀察結(jié)果：融化三角瓶中的培養(yǎng)基,倒成平板,凝固后在平板上劃短線接種,適溫培養(yǎng)10天,在平板上倒入斐林試劑A、B混合液,以覆蓋菌落為度,2小時內(nèi)檢查,若在菌落周圍出現(xiàn)紅色的暈者為陽性反應(yīng)。為了能掌握這一試驗,可接種多粘芽孢桿菌作陽性對照。27、厭氧硝酸鹽產(chǎn)氣在厭氧情況下,有些好氧細(xì)菌,能以硝酸鹽代替分子氧作為受氫體,進(jìn)行厭氧呼吸,將硝酸鹽還原為氣態(tài)氮,即為土壤中的反硝化作用。某些芽孢桿菌,假單胞菌及產(chǎn)堿菌等屬的細(xì)菌具有此反應(yīng)。接種封油：以斜面菌種用接種環(huán)接種后,用凡士林油〔凡士林和液體石蠟為1：1封管,封油的高度約1厘米。必須同時接種不含有硝酸鉀的肉汁胨培養(yǎng)液作對照。觀察結(jié)果：培養(yǎng)2－7d,觀察在含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有否生長和產(chǎn)生氣泡。如有氣泡產(chǎn)生,表示反硝化作用產(chǎn)生氮氣,為陽性反應(yīng)。但如不含硝酸鉀的對照培養(yǎng)基也可產(chǎn)生氣泡,則只能按可疑或陰性處理。28、馬尿酸鹽水解試驗本試驗作為區(qū)分某些芽孢桿菌的鑒定和黃單胞菌屬的鑒定之用。接種和觀察結(jié)果：以幼齡菌種接種于上述培養(yǎng)液中,適溫培養(yǎng)4周〔高溫芽孢菌培養(yǎng)2周,取1mL培養(yǎng)物,和1.5mL50％的；硫酸混合,靜置片刻,在酸性混合物中有針狀結(jié)晶出現(xiàn)為陽性,證明從馬尿酸鹽形成安息香酸。29、對疊氮化鈉的抗性本試驗用于高溫芽孢桿菌的測定。接種和觀察結(jié)果：取1環(huán)幼齡的菌液,接種于上述培養(yǎng)基中,同時接種營養(yǎng)肉湯作為對照。45℃培養(yǎng)7至14d觀察生長情況。30、氰化鉀試驗氰化鉀〔KCN是呼吸鏈末端抑制劑。能否在含有氰化鉀的培養(yǎng)基中生長,是鑒別腸桿菌科各屬常用的特征之一。接種和觀察結(jié)果：用幼齡菌種接種于加氰化鉀的測定培養(yǎng)基和未加氰化鉀的空白培養(yǎng)基中,適溫培養(yǎng)1－2d,觀察生長情況。能在測定培養(yǎng)基上生長者,表示氰化鉀對測定菌無毒害作用,為陽性。若在測定培養(yǎng)基和空白培養(yǎng)基上均不生長,表示空白培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分不適于測定菌的生長,必須選用其它合適的培養(yǎng)基。而測定菌在空白培養(yǎng)基上能生長,在含氰化鉀的測定培養(yǎng)基上不生長,為陰性結(jié)果。應(yīng)該注意：氰化鉀是劇毒藥品,操作時必須小心。培養(yǎng)基用畢,每管加幾粒硫酸亞鐵和0.5mL20％KOH以解毒,然后清洗。31、對溶菌酶抗性的測定在100mL的三角瓶中,放入60－65mL無菌的0.01mol/LHCL,在其中加入0.1g溶菌酶,瓶上塞無菌棉花,在小火上煮沸20分鐘后,冷到室溫,加無菌的0.01mol/LHCL補(bǔ)足到100mL。取1mL溶菌酶溶液與99mL無菌的肉湯培養(yǎng)液混合,分裝無菌試管,每管2.5mL,在含有0.001％溶菌酶肉湯管子及無溶菌酶的營養(yǎng)肉湯對照管中,各接種1環(huán)菌液,適溫培養(yǎng)5－7d,記錄兩管的生長情況。32、在pH5.7營養(yǎng)肉湯上的生長本試驗應(yīng)用于芽孢桿菌屬中種的鑒定。接種和觀察結(jié)果：取菌液一環(huán),接種于上述培養(yǎng)基中,同時接種普通肉湯液〔7.2pH作對照。適溫培養(yǎng)1－3d后觀察生長情況。該培養(yǎng)液要求十分澄清,pH必須準(zhǔn)確,最好用pH計調(diào)測。33、需氧性試樣若在培養(yǎng)基中加入還原劑,如巰基醋酸鈉和甲醛次硫酸鈉等,以除去培養(yǎng)基中的氧氣或氧化型物質(zhì),使厭氧菌能在有氧情況下生長。接種與觀察結(jié)果：用1小環(huán)〔外徑1.5毫米的接種環(huán)的肉湯菌液,穿刺接種到上述培養(yǎng)基中,必須穿刺到管底。30℃培養(yǎng),分別在3至7天觀察結(jié)果。如細(xì)菌在瓊脂柱表面上生長者為好氧菌,如沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌。34、明膠〔Gelatin液化試驗有些細(xì)菌具有明膠酶〔亦稱類蛋白水解酶,能將明膠先水解為多肽,又進(jìn)一步水解為氨基酸,失去凝膠性質(zhì)而液化。試驗方法：挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物,以較大量穿刺接種于明膠高層約2/3深度或點種于平板培養(yǎng)基。于20~22℃培養(yǎng)7~14天。明膠高層亦可培養(yǎng)于36±1℃。每天觀察結(jié)果,若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時應(yīng)不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再觀察其是否被細(xì)菌液化,如確被液化,即為試驗陽性。平板試驗結(jié)果的觀察為在培養(yǎng)基平板點種的菌落上滴加試劑,若為陽性,10~20min后,菌落周圍應(yīng)出現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰性。35、淀粉水解試驗?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生分解淀粉的酶,把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后,遇碘不再變藍(lán)色。試驗方法：以18~24h的純培養(yǎng)物,涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板〔一個平板可分區(qū)接種,試驗數(shù)種培養(yǎng)物或直接移種于淀粉肉湯中,于36±1°C培養(yǎng)24~48h,或于20°培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面,若為液體培養(yǎng)物,則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果,陽性反應(yīng)〔淀粉被分解為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程,因而試驗結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的能力、培養(yǎng)時間,培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性,以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱,因而以臨用時制備為妥。36、生長溫度的測定細(xì)菌生長的最高、最適和最低溫度,常常是某些細(xì)菌鑒定的特征之一。測定細(xì)菌的生長溫度,要求培養(yǎng)液十分清晰〔如普通肉湯培養(yǎng)液,并采用液體菌種直針接種〔不用接種環(huán)接種。放置于恒溫水浴培養(yǎng)。指示溫度計應(yīng)放在同樣的試管和培養(yǎng)基內(nèi),在指定溫度下培養(yǎng)2－5d,觀察生長情況。在接近0℃的低溫培養(yǎng),則觀察時間可延長至7－10d,甚至30d。觀察記錄結(jié)果：目測生長情況,與未接種的空白培養(yǎng)基對比,注意混濁度、沉淀物和懸浮物等項,并分級記錄如下：〔1"＋"：表示生長良好；與對照管相比,可清楚地判定是混濁的。〔2"＋－"：表示生長差；與對照管相比,只有在某一觀察角度時方能看到明顯的混濁。〔3"－"：表示不生長；在適宜的角度下觀察,與對照無差異?？傊?培養(yǎng)5d,能生長者均按生長計,否則按不生長計,凡培養(yǎng)5d仍屬可疑者或不生長者必須重測,在重測時,可能出現(xiàn)有時生長,有時不生長的不穩(wěn)定現(xiàn)象,這可能有兩種原因：一種是水浴溫度不穩(wěn)定,培養(yǎng)時溫度波動大；另一種原因可能是所測定的溫度,恰好是測定菌的臨界生長溫度,在這種情況下,可用提高一度或降低一度的辦法肯定之。必須注意,當(dāng)測定的試管較多時,不可將試管捆成一捆浸于水浴中,這樣捆著的試管內(nèi)外溫度不一致,易出現(xiàn)誤差。最好用特制試管架放試管,所用溫度計應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)溫度計標(biāo)定過。37、形成芽孢的培養(yǎng)基形成芽孢是芽孢桿菌的關(guān)鍵性特征,但不是所有的芽孢桿菌都能在任何條件下形成芽孢。在鑒定細(xì)菌時,為了確定是否屬芽孢菌,需要對那些在一般條件下不形成芽孢的細(xì)菌,采用生孢子培養(yǎng)基,來確定是否能形成芽孢。38、O/129的敏感性試驗O/129即2,4－二氨基－6,7－二異丙醇喋啶,為弧菌抑制劑。該試驗用于弧菌屬、氣單胞菌屬和假單胞菌屬的鑒定。取2,4－二氨基－6,7－二異丙醇喋啶150mg,溶于10mL1：1的乙醇：二乙基乙醚中。把6mm大小的濾紙片浸入該溶液后取出,在空氣中晾桿,然后放在帶菌的半固體培養(yǎng)基上做擴(kuò)散敏感試驗。三、血清學(xué)試驗血清學(xué)反應(yīng)是指：相應(yīng)的抗原與抗體在體外一定條件下作用,可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀、凝集現(xiàn)象。在食品微生物檢驗中,常用血清學(xué)反應(yīng)來鑒定分離到的細(xì)菌,以最終確認(rèn)檢測結(jié)果。血清學(xué)反應(yīng)的一般特點：1>抗原體的結(jié)合具有特異性,當(dāng)有共同抗原體存在時,會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。2>抗原體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合,這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定,但是可逆的。3>抗原體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的,只有比例適當(dāng)時,才能出現(xiàn)可見反應(yīng)。4>血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個階段進(jìn)行,但其間無嚴(yán)格界限。第一階段為抗原體特異性結(jié)合階段,反應(yīng)速度很快,只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢,但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象。第二階段為抗原體反應(yīng)的可見階段,表現(xiàn)為凝集、沉淀、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等。反應(yīng)速度慢,需幾分、幾十分以至更長時間。而且,在第二階段反應(yīng)中,電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化,都直接影響血清學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。習(xí)慣上將經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)分三種類別：凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)。１、凝集反應(yīng)顆粒性抗原〔細(xì)菌、紅細(xì)胞等與相應(yīng)抗體結(jié)合,在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見的凝集現(xiàn)象,稱為凝集反應(yīng)〔Agglutinationreaction。其中的抗原稱為凝集原,抗體稱為凝集素。在該反應(yīng)中,因為單位體積抗體量大,做定量實驗時