肝硬化和肝癌動物模型構建實驗

肝硬化動物造模實驗一、原理CCI4是使用最早、應用最廣泛的誘導肝硬化動物模型的化學藥品。CCI4經肝微粒體細胞色素P450激活生成三氯化碳（CCl3），后者攻擊肝細胞膜結構上的磷脂，引起脂質過氧化，破壞細胞的模型結構；CCl3還與細胞內蛋白質形成共價鍵，損害線粒體，使還原性輔酶A（NADH）與三磷酸腺苷（ATP）在肝內生成減少，脂肪酸氧化受到抑制，影響三羧酸循環(huán)，致使肝細胞"窒息”死亡；內質網、線粒體、高爾基體甚至細胞膜的變形和破壞，導致蛋白合成、能量代謝和脂質氧化障礙，三酰甘油和脂肪酸在肝細胞內蓄積，出現脂肪變性，肝細胞壞死并發(fā)生纖維化。高濃度CCl4主要累及中樞神經系統(tǒng)，低濃度反復應用則損害肝和腎，肝臟損害-修復-損害最終形成肝硬化。采用CCl4誘導肝硬化模型通常選用30%-60%濃度作為致模溶液，以大鼠作為造模對象，通過皮下或腹腔注射、灌胃、蒸汽吸入或拌于食物中喂養(yǎng)等各種方法輸入動物體內。二、模型特點模型制作觀察過程中，模型動物精神萎靡，食欲不振，嗜睡，易激怒，時見相互間撕咬和攻擊，體重先減輕后增加。腹建注射30%CCl4溶液的動物在造模7周時，其血清丙氨酸轉氨酶（ALT）總蛋白（TP）球蛋白（GLO）總膽固醇（TC）三酰甘油（TG）和肝組織TC、TG、L-羥脯氨酸（HPA）含量明顯上升，血清白蛋白（ALB）含量和白蛋白/球蛋白比例（A/G）顯著下降，光鏡下全部模型動物肝組織出現纖維化，大部分形成假小葉；電鏡下模型動物肝細胞超微結構明顯異常，肝細胞呈不同程度的腫脹，部分肝細胞膜破裂，內質網擴張斷裂，常見大片脂質空區(qū)，線粒體基質電子密度增大，脊消失，肝竇中多見中性粒細胞。皮下注射40%、50%、60%CCI4溶液連續(xù)42-66d，動物成活率為46%-77%，肝硬化模型成功率為72%-100%。成模動物正常肝組織被破壞、由廣泛增生的纖維組織將原來的肝小葉分割包繞成大小不等的圓形狀，形成假小葉。假小葉內肝細胞索排列紊亂，小葉中央靜脈缺如、偏位或出現兩個以上的中央靜脈，再生的肝細胞結節(jié)肝細胞索排列紊亂、胞體大、核大、著色深，肝細胞還出現氣泡樣變和脂肪變性等。三、 模型應用肝硬化相關機制研究；藥物篩選和療效評價；比較醫(yī)學研究等。四、 實驗動物大鼠五、實驗方法成年雄性大鼠經其腹腔注射30%CCI4石蠟油溶液2ml/kg體重,2次/周連續(xù)7周。或皮下注射40%CCl4大豆油溶液3ml/kg體重首劑5ml/kg體重每3d一次共14次，期間，在實驗開始后前2周，飼以80%玉米面和20%豬油混合飼料，2周后在飼料中混入0.5%膽固醇，以30%乙醇作為唯一飲品，連續(xù)42d?；蚱は伦⑸?0%CCl4大豆油溶液3ml/kg體重，首劑5ml/kg體重，每4d-次，第5次起，改為肌肉注射，共15次，期間飲10%乙醇替代飲水，食常規(guī)顆粒飼料，連續(xù)60d?；蚱は伦⑸?0%CCl4礦物油溶液3-5ml/kg體重，每4d-次，共15次，其中頭4次劑量為5ml/kg體重，5-11次為3ml/kg體重，12-15次為5ml/kg體重，同時以10%乙醇作為唯一飲用水，連續(xù)66d。造模過程中，每日觀察動物的一般活動狀況，每周稱量動物體重，造模結束后抽取全血制備血清、稱取部分肝組織制備勻漿作生化檢測，摘取肝脾等器官稱重，計算臟器系數，并作組織形態(tài)學檢查。肝癌動物模型構建誘發(fā)性肝癌模型（實驗中常用方法之一）誘發(fā)性肝癌模型一般是指使用特定的化學誘導劑誘導肝癌發(fā)生的過程。常用的誘導劑包括二乙基亞硝胺（DEN）,黃曲霉素（AF）,二甲基氨基偶氮苯（DAB）等。以下為DEN誘導的常用步驟：:化學逶耳剖勰（DEN）發(fā)展過程：肝纖雉化f薩硬化一?肝煌優(yōu)點：與人體肝瘩發(fā)展逗程基本一致，常用睦之一.0*25%DENDENDENDENgy° 7 14 21 28a?：t選依重約為15S200g的蔭性大鼠（呂D/F祐he『344）IS性大鼠園躥素的圧抗作用誘導成功率低；玄每周一次按照10mgAgJg喂大鼠Q25綁DfM*洛液；4.約16局后即可誘發(fā)肝癟 ;>営-；徑加左DEN誘導是化學誘導中最常用的方法，也有2種或2種以上的誘導劑同時誘導，雖然會加速肝癌的發(fā)生，但是也會使動物死亡率升高。2.移植性肝癌模型（常見到的模型之一）移植性肝癌模型是實驗研究中常見的模型之一，分為細胞移植（CDTX）和病人組織腫瘤模型（PDTX）構建過程如下：一般構建方法：采用肝癌細胞（如MHCC-97L、HepG2）或者腫瘤組織（病人來源）先在免疫缺陷鼠（nude品系）皮下荷瘤，成功后再將腫瘤組織塊切成2-3mm3塊狀，然后再移植到小鼠的皮下或者肝臟，此法可以將成功率提高到95%以上。缺點：因為肝癌發(fā)病機理相對復雜，目前的肝癌細胞系荷瘤成功率較低且生長緩慢；不能夠完全模擬肝癌的發(fā)生過程，而且操作相對比較復雜。鑒于該模型的缺陷，今天為大家介紹一種：基于肝硬化的原位肝癌移植模型優(yōu)點：一種能夠最大程度模擬人類肝癌發(fā)生過程，并先后經歷了纖維化、肝硬化、肝癌，與人體肝癌的發(fā)生進程基本一致。簡要流程如下所示：第一歩:肝硬化小鼠檯型的誘導準備20%CCI.（CO?/橄機由1:4）準備小層，每組10只；每只小塞灌l(xiāng)g150nlCCI4I每周三次，持續(xù)12周I在最后一次處理后2-3天,稱重開準備在肝硬化原位置種植HCC細胞iiJS：誘導時期較長?應采用口眼可以更好地使小踰受；灌喂操■（囪要,匱免灌入I盛從而使小鼠室息死亡；給藥期間密切監(jiān)測小鼠的健廣狀況亠 Tumormocutetoond 1CCI4admimsbon?} ] ]?TumorformabotvWeekO Week12WwklVU第二步：肝癌卿胞的原拉種植用50%?^膠重暮kKife仙琲胡的HOV闊胞.毎只小鼠1（/個挖仲1體泵；麻醉小鼠：齷用戊巴比爰鈉或吾阿氟丁廚剛'鼠，麻醉后綁定；剃毛后沿蹬中坯切開皮膚,快麼丸m左右f祐出劍狀軟爵」將切口執(zhí)開；先綁簽撞用生理啟水濯浦.然啟將胖左葉（撮大的一吋｝用梯簽挑起；I5-餵懂注射20口1圳胞懸液,注射信停田血，旋轉週出針頭?邂免蜩胞回渝，拄射成功后在肝臟部位一般能■封白色突起6.注射完華后消超曲腔.戀后童合飭口*肝原位腫瘤的檢測：一般1-2周后即可長成塊狀腫瘤組織，可以使用CT檢測?；蛲ㄟ^注射D-去甲熒光素，檢測熒光強度來判定腫瘤長勢?；蚬こ谈伟┠Ｐ椭袊伟┗颊咧幸腋尾《荆℉BV）或丙肝病毒（HCV）陽性率高達80%，可見HBV或者HCV是誘導肝癌的重要因素。由于人的HBV和HCV不能誘導小鼠或者大鼠發(fā)生肝炎和肝癌，建立這些模型時通常需要嵌入人肝細胞。構建方法：一般通過轉基因的方法把HBV/HCV的DNA序列整合到小鼠的宿主基因組中，從而構建HBV/HCV感染慢性攜帶者的轉基因小鼠模型