宏基因組二代測序技術(shù)在新生兒感染性疾病中的臨床應用專家共識（2022年）

【標準·方案·指南】宏基因組二代測序技術(shù)在新生兒感染性疾病中的臨床應用專家共識摘要近年來基于高通量測序平臺的宏基因組二代測序（mNGS）技術(shù)在新生兒感染性疾病領(lǐng)域得到了廣泛應用。為了更加規(guī)范mNGS技術(shù)在新生兒重癥監(jiān)護病房的應用，中華醫(yī)學會兒科學分會新生兒學組和中華兒科雜志編輯委員會組織專家以國內(nèi)外循證醫(yī)學證據(jù)和最新進展為基礎(chǔ)，從mNGS技術(shù)的臨床適應證、標本采集與轉(zhuǎn)運、報告解讀等方面給出建議。宏基因組二代測序（metagenomicsnext-generationsequencing，mNGS）平臺是基于高通量測序技術(shù)對各種臨床樣本中的全部生物基因組進行測序的實驗室診斷技術(shù)，近年來已逐漸被認識并應用于各種感染性疾病的診斷。mNGS可以同時測定某一臨床樣本中數(shù)千萬條核酸序列，然后通過強大的生物信息學平臺將測序數(shù)據(jù)與病原體數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得病原體的分類信息，以鑒定可能的致病病原體。此外，mNGS還可以直接從臨床樣本分析耐藥基因，輔助臨床診斷以及分析人類宿主反應（轉(zhuǎn)錄組）數(shù)據(jù)以預測感染原因和評估疾病風險。mNGS技術(shù)的成功開展對部分感染性疾病患者尤其是免疫抑制人群及重癥感染人群的病原學診斷起到了突破性作用。長期以來新生兒感染一直是兒科醫(yī)生面臨的重大挑戰(zhàn)，新生兒的免疫系統(tǒng)不成熟，易感因素多，在接觸病原體時防御功能較為脆弱，導致相對高的發(fā)病率和病死率。由于新生兒感染的臨床表現(xiàn)往往不典型，病情較為隱匿、進展迅速，快速明確病原體對疾病的診治及轉(zhuǎn)歸十分重要。基于mNGS具有無偏倚性、覆蓋廣、敏感性高，用時相對較短等優(yōu)點，尤其可在混合感染或病毒感染方面展現(xiàn)其優(yōu)勢，因此mNGS在新生兒感染性疾病中具有廣闊的應用前景，但現(xiàn)階段在新生兒重癥監(jiān)護病房（neonatalintensivecareunit，NICU）實踐中仍存在一定的局限性及問題：成本相對昂貴；對新生兒的臨床適應證認識不足，送檢存在較大的盲目性和隨意性；樣本類型的選擇以及對樣本送檢的流程及注意事項不清楚；實驗檢測流程操作復雜，缺乏統(tǒng)一標準；測序結(jié)果復雜，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果誤導臨床等。以上問題均限制了mNGS在NICU中的臨床應用和推廣。為了提高mNGS的診斷質(zhì)量，規(guī)范其在新生兒感染性疾病領(lǐng)域的臨床應用，中華醫(yī)學會兒科學分會新生兒學組和中華兒科雜志編輯委員會成立專家組，廣泛征求意見和建議，基于國內(nèi)外臨床證據(jù)，結(jié)合臨床實踐經(jīng)驗，于2021年7—12月經(jīng)過專家反復討論，制定了“宏基因組二代測序技術(shù)在新生兒感染性疾病中的臨床應用專家共識”（簡稱本共識）。本共識主要目標讀者為兒科尤其是新生兒科專業(yè)醫(yī)生。一、mNGS在NICU感染性疾病中的應用共識1：患兒具有急危重癥表現(xiàn)，不除外感染，或有繼發(fā)或并發(fā)危及生命的嚴重感染，需要盡快明確病原體，建議常規(guī)檢測的同時送檢mNGS。急危重癥指多器官功能衰竭，由新生兒敗血癥、腦膜炎、重癥肺炎、腹腔感染等引起者應及時明確致病微生物，這對于制定有效的治療方案具有重要作用。但由于其致病微生物復雜，常規(guī)方法易遺漏部分病原微生物，因此建議常規(guī)檢測的同時送檢mNGS。多項研究表明mNGS對敗血癥的檢測靈敏度遠遠高于傳統(tǒng)培養(yǎng)。亦有研究通過檢測敗血癥患者血漿樣本的細胞游離DNA，表明基于mNGS的檢測結(jié)果有53%的患者治療方案進行了調(diào)整。共識2：高度懷疑患兒存在新生兒血流感染甚至敗血癥時，若經(jīng)驗治療3d效果不佳且常規(guī)微生物學檢查送檢陰性，建議調(diào)整經(jīng)驗抗微生物治療方案的同時采集血液樣本送檢mNGS。推薦DNA測序作為血流感染的首選檢測方法，在高度懷疑RNA病毒感染的情況下可同時進行RNA測序。Yan等的回顧性研究是應用mNGS檢測兒科重癥監(jiān)護病房中疑似敗血癥患兒的血液微生物組，在血液樣本中的游離循環(huán)DNA檢測出了潛在的致病微生物。由于大部分血流感染的病原體（包括細菌、真菌、寄生蟲、DNA病毒）均以DNA作為遺傳物質(zhì)，如果根據(jù)適應證送檢mNGS，推薦DNA測序作為血流感染的首選檢測方法。但也應根據(jù)臨床流行病學，如發(fā)病季節(jié)、母親疾病史、生后時間及臨床表現(xiàn)共同判斷，選擇進行DNA或RNA測序。共識3：對于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)（centralnervoussystem，CNS）感染的患兒，條件允許的情況下建議留取常規(guī)、生化及微生物檢查所需腦脊液的同時留取mNGS所需腦脊液，若腦脊液檢查結(jié)果提示常規(guī)和（或）生化指標異常且常規(guī)微生物檢測陰性且經(jīng)驗性抗感染治療3d無效，建議立即送檢mNGS。mNGS應用于新生兒CNS感染方面的研究較少，多為病例報告，揭示了mNGS在疑難病例中的應用價值；以mNGS為基礎(chǔ)檢測CNS感染病原以病毒感染多見，細菌檢測的研究較少，同時經(jīng)驗性抗菌藥物在NICU中應用較為廣泛，因此mNGS在CNS感染中的應用更傾向于病毒、非典型病原體或已應用抗菌藥物的細菌感染病例。Guo等應用mNGS技術(shù)對北京兒童醫(yī)院99例細菌性腦膜炎患兒的腦脊液標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)mNGS將病原體檢測陽性率提高了13.1%；Li等在22.1%的疑似CNS感染病例中發(fā)現(xiàn)了潛在的致病病原體，而這些病例多是常規(guī)微生物檢測方法陰性情況下才送檢mNGS的。此外，有報道稱通過mNGS檢測細菌性腦膜炎患兒的腦脊液和血液標本，分析其不同的微生物組特征有助于臨床分析及診療過程。Ge等提出對于疑似CNS感染的患兒，mNGS聯(lián)合全外顯子測序可顯著提高病因診斷率?？紤]到腦脊液常規(guī)微生物檢查的陽性率較其他類型樣本低且腦脊液樣本所含人核酸含量較低，因此腦脊液較適合開展mNGS檢測。在測序方法的選擇上，若臨床排除病毒感染的可能，優(yōu)先進行DNA測序。當腦脊液常規(guī)、生化無明顯異常且腦脊液微生物學檢查陰性，臨床上仍高度懷疑CNS感染，或臨床表現(xiàn)復雜、無特定懷疑方向送檢mNGS時，推薦對腦脊液樣本中的DNA和RNA同時進行測序。共識4：對于疑似呼吸道感染的重癥患兒，常規(guī)微生物檢查（培養(yǎng)或核酸檢測）陰性且治療3d無效，可送檢mNGS，應同時進行DNA及RNA測序。樣本類型優(yōu)先選擇肺泡灌洗液，其次考慮氣管插管下獲得痰液及鼻咽拭子樣本。mNGS可對包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同時進行檢測，同時對于多重感染的鑒定具有極大優(yōu)勢。已有多篇報道應用mNGS技術(shù)診斷兒童呼吸道感染性疾病的病原體，mNGS技術(shù)在傳統(tǒng)病原微生物檢測（包括培養(yǎng)、PCR等）陰性及免疫功能抑制的患兒中應用價值更高。新生兒肺部存在的定植微生物參與其出生后的免疫系統(tǒng)發(fā)育和成熟，因此關(guān)注呼吸道微生物的構(gòu)成對于評估患兒病情也很重要。共識5：疑似新發(fā)病原體、臨床上提示可能有一定的傳染性，或者疑似特殊病原體或罕見病原感染，常規(guī)微生物檢測方法陰性，建議盡快完善mNGS。mNGS檢測無需提前設定目標病原體，其直接對樣本中所有核酸進行測序，具有檢測新發(fā)病原和罕見病原的能力。新發(fā)病原體指引起人群中出現(xiàn)某種新的臨床表型的病原，或過去存在但其引起的發(fā)病率或地理分布明顯增加的病原。但對于新發(fā)病原，由于缺乏參考基因組，完整的鑒定種屬以及和已知種屬的進化關(guān)系，需要較高的測序序列數(shù)，建議優(yōu)先采集病灶標本或進行富集。共識6：疑似存在混合感染，常規(guī)微生物檢查結(jié)果不能解釋臨床表現(xiàn)的全貌或抗感染治療的反應，經(jīng)驗性治療3d無效時，建議進一步完善常規(guī)檢測的基礎(chǔ)上，開展mNGS。相比于常規(guī)方法有限的檢測范圍，mNGS的原理使得其具有更廣泛的檢測范圍，理論上可以檢測任意病原微生物。這一特點使得其更易檢出混合感染。Wang等的研究表明對于肺部混合感染的檢測，mNGS的靈敏度達到97.2%，而常規(guī)方法僅為13.9%。共識7：出現(xiàn)某種感染性疾病的聚集性發(fā)病或者疑似院內(nèi)感染暴發(fā)，在常規(guī)快速檢測不能明確病原時，建議開展mNGS。mNGS能夠通過重構(gòu)病原微生物間的親緣關(guān)系，并結(jié)合流行病學信息，鑒定傳播簇以及傳播鏈，具有鑒定、監(jiān)控傳染性疾病的暴發(fā)和院內(nèi)感染的能力。Casto等通過mNGS實現(xiàn)了對兒童諾如病毒院內(nèi)感染暴發(fā)的實時監(jiān)控，在13例患兒中鑒定到3個不同的傳播簇，并發(fā)現(xiàn)4例社區(qū)傳播的病毒毒株和院內(nèi)感染病毒毒株成簇，提示兩者之間具有潛在的傳播關(guān)系。Xu等利用mNGS對25例呼吸道樣本的測序，發(fā)現(xiàn)8例偏肺病毒毒株均來源于血液科病房，提示存在院內(nèi)傳播。由于病毒的基因組較小，對全基因組范圍遺傳多樣性的刻畫所需的測序數(shù)據(jù)量較小，因此利用mNGS對傳染性疾病傳播的推斷主要集中于病毒。亦有研究利用mNGS對糞便樣本進行測序，通過將測序序列和地區(qū)流行的肺炎克雷伯成簇代表性菌株進行比對的方式，鑒定可能的傳播來源。共識8：疑似局部感染，如眼部（角膜炎或潰瘍、眼內(nèi)炎、急性視網(wǎng)膜壞死等）、鼻部、耳部或局部蜂窩織炎等，在常規(guī)微生物檢測未能明確病原情況下，可開展mNGS。共識9：由于各種原因?qū)е碌男厍环e液及腹腔積液，在送檢常規(guī)生化及培養(yǎng)的同時留取胸、腹腔積液樣本，若常規(guī)、培養(yǎng)陰性或經(jīng)驗性抗感染治療3d無效，仍懷疑感染所致者，建議立即送檢mNGS。共識10：對于mNGS檢測陰性但臨床高度懷疑感染的患兒，必要時再次取樣復查mNGS。共識11：對常規(guī)微生物學檢查容易明確病原體且經(jīng)驗治療通常有效的感染，不建議常規(guī)進行mNGS檢測。不建議應用mNGS評估抗感染治療效果。圖1為新生兒感染性疾病送檢mNGS的流程圖，以便臨床醫(yī)生快速查閱。二、標本采集和轉(zhuǎn)運臨床上采集的樣本類型主要包括靜脈血、腦脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔積液、腹腔積液、組織、咽拭子、局灶穿刺物等。不同類型的樣本采集需遵循以下原則。1.從無菌部位（如靜脈血、腦脊液、胸腔積液、腹腔積液等）采集標本時，應嚴格無菌操作，采集前對局部及周圍皮膚的消毒，消毒液與皮膚需要作用一定時間，待其干燥后采樣。采集后的標本須用無菌容器盛裝。血液標本建議取1~3ml（不同實驗室要求不同，最低限為0.5ml），采用專用采血管，即游離DNA樣本保存管，其內(nèi)由乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）和保護劑組成，可抑制血漿中核酸酶及有核細胞中DNA的釋放，采血后上下顛倒混勻5~10次；腦脊液樣本常規(guī)建議應為1ml以上（新生兒因腦脊液樣本較難獲得，最低樣本量為600μl），采用專用采血管或無菌凍存管；胸、腹腔積液需富集后提取核酸，至少采集5ml，避免經(jīng)引流管采集。若增加RNA測序時，需提前聯(lián)系實驗室提供添加RNA穩(wěn)定劑的采血管或無菌凍存管，在采集樣本時須同時采2管；若樣本同時進行DNA及RNA測序，1管樣本量為單獨DNA測序的2倍，同時向檢測實驗室特殊說明需立即進行核酸提取。2.從有菌部位（如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等）采集標本時，應采取必要措施，嚴格無菌操作等，盡量減少污染，以免干擾后續(xù)檢測結(jié)果；同時標明樣本的采集部位。肺泡灌洗液樣本應為3ml以上，采用無菌凍存管；痰液樣本應為3ml以上，采用無菌凍存管；咽拭子只適用于呼吸道病毒檢測。共識12：各類型樣本采集需要無菌操作，血液、高凝狀態(tài)的胸腔積液、腹腔積液、腦脊液樣本，采集后需上下顛倒混勻5~10次。非血液標本采集通常采用帶螺旋蓋的無菌凍存管，但預期可能凝集的標本及血液樣本需采用專用采血管。所有樣本采集完成后，均需要封口膜密封，條碼標記。共識13：推薦直接從患兒感染部位的體液或組織中采集樣本。共識14：患兒存在感染表現(xiàn)但病情危重或不能耐受有創(chuàng)操作時，可考慮采集患兒的血液標本進行常規(guī)微生物方法檢測的同時送檢mNGS。原則上，送檢感染部位的體液或者組織標本靈敏度、特異度和可信度更高。有創(chuàng)操作不耐受時，可送檢血液標本，但可能會降低檢測結(jié)果的準確性。有研究發(fā)現(xiàn)，對于重癥肺部感染患者，痰液或肺泡灌洗液和血液標本檢測病原體的一致性為40%~50%。標本轉(zhuǎn)運：所有樣本均應及時送檢。若樣本在24h內(nèi)到達實驗室并開始檢測，可考慮冰袋低溫運輸；若運輸時間24~72h，應干冰運輸（血液樣本應先分離血漿后保存運輸）。不能及時送檢樣本長期保存原則：（1）DNA測序為-20℃保存不超過7d；（2）RNA測序應置-80℃理論上可長期保存；（3）避免樣本反復凍融，一般不得超過3次；（4）若懷疑高致病性或突發(fā)傳染病，嚴格按照國內(nèi)傳染病法等相關(guān)法律要求包裝及轉(zhuǎn)運。盡可能在醫(yī)院生物安全防護條件下抽提核酸后再送測序。三、報告解讀共識15：解讀mNGS檢測報告應參考檢測方法的數(shù)據(jù)和檢出病原序列數(shù)量、基因組覆蓋度、微生物豐度等指標，結(jié)合標本采集部位、檢出病原的致病特性以及患兒臨床資料進行個體化解讀。mNGS由于檢出結(jié)果豐富，雖然提高了病原微生物檢測敏感性，也對正確判讀致病微生物造成了困難。尤其是有菌區(qū)的樣本，由于定植微生物和致病微生物的混雜以及不同微生物基因組大小和核酸提取效率的差異，單純依靠檢出序列數(shù)判讀并不準確。建議由臨床感染或臨床微生物學從業(yè)人員在相關(guān)的生物信息學培訓后進行解讀。通常，mNGS報告通過測序短序列的數(shù)量、基因組覆蓋度及微生物豐度進行病原體鑒定，即指示某個潛在病原體的堿基序列片段數(shù)量越多，基因組覆蓋率及微生物豐度越高，表明該物種在樣本中存在的可能性越高，可信度越大。陽性的判讀通過建立閾值實現(xiàn)，閾值往往包含以上3個指標及內(nèi)參對照的檢出等情況，不同實驗室采取的閾值標準往往不同。在陽性報告中，達到陽性閾值的微生物檢測結(jié)果即可信，但如果有多種微生物存在，則應結(jié)合樣本類型考慮定植微生物相關(guān)假陽性結(jié)果；在陰性報告中，需判斷陰性結(jié)果原因，是因為病原體載量未達到陽性閾值標準還是因為確實不存在病原體，需結(jié)合患兒具體臨床信息。此外，陰性結(jié)果標本如僅進行DNA測序，建議進一步進行RNA測序以防RNA病毒作為病原體引起假陰性結(jié)果。結(jié)果報告信息：（1）患兒姓名、出生日期和性別；（2）送檢單位名稱及實驗室的名稱、地址及聯(lián)系方式；（3）樣本采集日期和時間、驗收日期和測試日期；（4）報告發(fā)布日期；（5）實驗操作分析人員及審核人員；（6）檢測方法相關(guān)指標包括測序質(zhì)量、讀長（測序儀單個測序反應所得到的堿基序列）等，同時對相關(guān)專業(yè)術(shù)語進行解釋說明，并注明檢測方法的局限性、檢測靈敏度和特異度等；（7）檢測病原微生物列表、檢出病原序列數(shù)量、深度、離散度、基因組覆蓋度或綜合以上多個指標計算而得的鑒定置信度和相對豐度等；（8）結(jié)論及建議。結(jié)果報告常用術(shù)語解釋：（1）深度為該微生物基因組上某段序列被檢測到的次數(shù)；（2）離散度指檢測到某病原微生物的序列在該病原微生物基因組上分布的隨機性；（3）基因組覆蓋度指達到給定深度的測序堿基占整個基因組或目標區(qū)域的百分比；（4）微生物豐度指除去宿主序列之后，某微生物物種序列在相應大類物種中的分布比例；（5）鑒定置信度指綜合離散度、基因組覆蓋度、深度等多個參數(shù)計算所得的簡化參數(shù)，用于判斷樣本是否存在疑似致病微生物核酸序列。共識16：源于微生物正常定植部位的標本（例如支氣管肺泡灌洗液），鑒別檢出序列是屬于致病微生物、污染物，還是定植菌群較為困難，應綜合患兒臨床表現(xiàn)及輔助檢查綜合判斷。微生物和宿主因素復雜的相互作用影響患兒健康，例如微生物組在調(diào)節(jié)宿主免疫反應中的作用，或者難以區(qū)分檢測到的微生物是污染物、定植者還是真正的病原體。因此建議在出具檢測報告時，結(jié)合不同標本類型與檢出病原微生物的種類進行解讀，關(guān)注疑似病原體