PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件

PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件1PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件2PCR（PolymeraseChainReaction)技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。1985年由美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明，榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR（PolymeraseChainReactio3DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)。PCR的基本原理DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；PCR的基本原理4PCR擴(kuò)增體系模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、cDNA，也可以使細(xì)菌、組織樣品等。引物（Primer）：確定擴(kuò)增目的序列的特異性；確定擴(kuò)增產(chǎn)物長度。DNA聚合酶（DNAPolymerase）：推動(dòng)PCR反應(yīng)進(jìn)行的機(jī)器。擴(kuò)增效率和保真性。緩沖液（Buffer）：控制體系的pH和離子強(qiáng)度，為DNA聚合酶提供最佳工作環(huán)境。脫氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本組成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。Mg2+、K+、增強(qiáng)劑PCR擴(kuò)增體系模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、51.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（45～65℃，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（

72℃，30～60s）。PCR的基本原理1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。P6PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件7PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件8高溫變性高溫變性9低溫退火低溫退火10中溫延伸中溫延伸11PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件12PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件13PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件14理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴(kuò)增30循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加230也就是109倍。實(shí)際：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106～107。理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴(kuò)增30循環(huán)，目標(biāo)DNA15PCR擴(kuò)增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互補(bǔ)序列，并與特定位點(diǎn)雜交。2.中期（M期）：擴(kuò)增反應(yīng)順利進(jìn)行，產(chǎn)物呈指數(shù)型增長。3.晚期（L期）：平臺(tái)期，DNA聚合酶過度損耗或者產(chǎn)物的抑制。PCR擴(kuò)增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互16PCR擴(kuò)增條件循環(huán)PCR擴(kuò)增條件循環(huán)17PCR反應(yīng)條件94℃5min94℃30s56.2℃30s72℃30s72℃7min4℃∞PC1-P20：模板：基因組DNA；產(chǎn)物：506bp舉個(gè)例子PCR體系（10μL）模板：1μL上游引物：0.2μL下游引物：0.2μLEasyTaq酶：0.1μLEasyTaqBuffer：1μLdNTP：0.8μLddH2O：6.7μL30個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)條件PC1-P20：舉個(gè)例子PCR體系（10μL181.避免PCR試劑的污染2.最適合的反應(yīng)條件3.設(shè)置對(duì)照組：①PCR空白對(duì)照：在反應(yīng)體系中剔除反應(yīng)模板。②PCR陰性對(duì)照：即反應(yīng)體系中用無關(guān)的基因片段代替目的模板。③PCR陽性對(duì)照：即反應(yīng)體系中以已知能夠成功進(jìn)行特異性擴(kuò)增的模板。PCR的注意事項(xiàng)1.避免PCR試劑的污染PCR的注意事項(xiàng)191.為什么完全沒有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物？①試劑質(zhì)量問題或者加樣時(shí)出錯(cuò)，導(dǎo)致反應(yīng)體系不完整。②聚合酶失活或反應(yīng)體系中有聚合酶抑制劑。③PCR儀溫度控制不精確。④模板DNA發(fā)生降解。⑤引物或反應(yīng)溫度設(shè)計(jì)不合理⑥靶片段GC含量過高或擴(kuò)增對(duì)象長多常見問題1.為什么完全沒有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物？常見問題202.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？①反應(yīng)體系被污染。②引物特異性差。③退火溫度不合適。常見問題2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？常見問題213.為什么PCR產(chǎn)物很少？①聚合酶活性過低。②循環(huán)次數(shù)偏低。③模板DNA濃度過低。常見問題3.為什么PCR產(chǎn)物很少？常見問題224.為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？①DNA聚合酶過多或酶活性差。②dNTP和Mg2+濃度過高。③退火溫度過低，PCR循環(huán)數(shù)偏多。④模板DNA用量過大或模板DNA不純。⑤引物特異性差、引物間形成二聚體導(dǎo)致非特意擴(kuò)增。常見問題4.為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？常見問題23普通PCR儀溫度梯度PCR儀普通PCR儀溫度梯度PCR儀24實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀25PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件26為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，同時(shí)也與PCR擴(kuò)增的效率密切相關(guān)。引物設(shè)計(jì)的最重要的原則：最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)的目的為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板D271、引物應(yīng)具有足夠的特異性。如果需要從基因組等較復(fù)雜的模板中擴(kuò)增特定的DNA序列，則需要考慮目的DNA序列的保守性，盡量避免所選引物設(shè)計(jì)區(qū)域序列的非特異性。引物與非特異序列的同源性不超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基。

NCBIPrimerBLAST

引物設(shè)計(jì)的基本原則1、引物應(yīng)具有足夠的特異性。引物設(shè)計(jì)的基本原則282、避開易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域。

分子內(nèi)互補(bǔ)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、分子間互補(bǔ)。

二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)這家引物與模板雜交以及PCR的困難，因此要盡可能避開這種序列區(qū)域。

用有關(guān)軟件預(yù)測(cè)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)。

引物設(shè)計(jì)的基本原則2、避開易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域。引物設(shè)計(jì)的基本原則293、引物長度一般為18-30個(gè)堿基之間。引物長度與反應(yīng)的特異性和解鏈溫度成正相關(guān)。過短：擴(kuò)增特異性下降過長：引物自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及引物二聚體。引物設(shè)計(jì)的基本原則3、引物長度一般為18-30個(gè)堿基之間。引物設(shè)計(jì)的基本原則304、G+C含量一般為40%-60%引物的堿基組成也會(huì)對(duì)引物的解鏈溫度產(chǎn)生影響。G+C含量過低：引物解鏈溫度低，引物易于從模板上解離。G+C含量過高：引物解鏈溫度高，易與非特異性序列雜交，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。引物設(shè)計(jì)的基本原則4、G+C含量一般為40%-60%引物設(shè)計(jì)的基本原則315、Tm值之差應(yīng)小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。一對(duì)引物的Tm值差過大可直接導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率下降或失敗。對(duì)于20bp左右的引物：Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）

一般情況下，PCR的最佳退火溫度比引物Tm值低5℃左右。引物設(shè)計(jì)的基本原則5、Tm值之差應(yīng)小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。引物設(shè)326、引物中四種堿基最好是隨機(jī)分布的避免4個(gè)以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重復(fù)。特別是引物的3’端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G或C，否則會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)域產(chǎn)生錯(cuò)配，降低擴(kuò)增的特異性。引物設(shè)計(jì)的基本原則6、引物中四種堿基最好是隨機(jī)分布的引物設(shè)計(jì)的基本原則337、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身互補(bǔ)——發(fā)夾結(jié)構(gòu)

引物之間互補(bǔ)——二聚體

引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不應(yīng)超過3個(gè)，引物之間連續(xù)互補(bǔ)堿基不應(yīng)超過4個(gè)，尤其避免3’端的互補(bǔ)重疊。引物設(shè)計(jì)的基本原則7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物設(shè)計(jì)的基本原則348、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物的5’端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。如：加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、引入點(diǎn)突變等。

由于延伸是從3’端開始的，所以不能進(jìn)行任何修飾。引物設(shè)計(jì)的基本原則8、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物設(shè)計(jì)的基本原359、引物的3’端不可以A結(jié)尾。引物3’端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3’端最好選擇T。引物設(shè)計(jì)的基本原則9、引物的3’端不可以A結(jié)尾。引物設(shè)計(jì)的基本原則3610、引物3’端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增序列位于基因編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。引物設(shè)計(jì)的基本原則10、引物3’端要避開密碼子的第3位。引物設(shè)計(jì)的基本原則371、避免重復(fù)堿基，尤其是G。2、引物退火溫度在58-60℃之間。

3、G+C為30-80%。

4、3’端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C。5、引物的產(chǎn)物大小一般在80-250bp之間；80-150bp最為合適（可以延長至300bp）。

Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)原則1、避免重復(fù)堿基，尤其是G。Real-TimePCR引物設(shè)386、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。7、Real-TimePCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，以避免基因組DNA污染影響。

Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)原則6、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。Real-39PrimerPremier5.0Oligo6Primer3（在線）Primer-BLAST（在線）引物設(shè)計(jì)常用軟件PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)常用軟件40FileNewDNAsequence粘貼模板序列FileNewDNAsequence粘貼模板序41PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件42引物搜索引物搜索43引物位置產(chǎn)物大小引物長度引物位置產(chǎn)物大小引物長度44PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件45PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件46PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件47PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件48PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件49PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件50PrimerBLASTPrimerBLAST51PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件52PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件53PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件54PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件55PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件56由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱作逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR），由依賴RNA的DNA聚合酶（逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。

逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱作逆轉(zhuǎn)57逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理58逆轉(zhuǎn)錄PCR的反應(yīng)體系1、模板RNA2、逆轉(zhuǎn)錄酶3、逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄PCR的反應(yīng)體系1、模板RNA59PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件60PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件61PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件62Thanks！Thanks！63

93-96℃，較高的溫度變性更快更徹底，尤其是對(duì)富含G+C的靶序列而言。93-96℃，較高的溫度變性更快更徹底，尤其是對(duì)富含64

退火溫度與時(shí)間取決于引物的堿基組成、長度和濃度。退火溫度可以通過計(jì)算推斷，通常采用溫度梯度PCR的方法進(jìn)行摸索。

45.045.546.949.051.453.856.258.660.963.164.565.0MPC1-P20退火溫度摸索退火溫度與時(shí)間取決于引物的堿基組成、長度和濃度。退火65

延伸的溫度通常為所以DNA聚合酶的最適工作溫度，一般為72℃；延伸的時(shí)間主要取決于目的片段的大小，不同種類的聚合酶的合成效率也不同，因此還與DNA聚合酶的種類有關(guān)。EasyTaq：1-2kb/minTransStartTaq:1-2kb/minFastPfu:2-4kb/min延伸的溫度通常為所以DNA聚合酶的最適工作溫度，一般66循環(huán)數(shù)：

在其他參數(shù)都已優(yōu)化的條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度。一般情況下30-35個(gè)循環(huán)即可。循環(huán)數(shù)太多：會(huì)增加非特異擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量和復(fù)雜性。循環(huán)數(shù)太少：PCR產(chǎn)量太低。循環(huán)數(shù)：67逆轉(zhuǎn)錄引物：

（1）隨機(jī)六聚核苷酸引物

僅長6個(gè)核苷酸，每個(gè)核苷酸位點(diǎn)上隨機(jī)加入4中不同的脫氧核苷酸，因此是46中不同引物的集合體。

所有RNA分子均可以充當(dāng)模板，合成的cDNA中有96%來自rRNA。逆轉(zhuǎn)錄引物：68逆轉(zhuǎn)錄引物：

（2）Oligo（dT）

僅由dTTP構(gòu)成，長度一般為18-24個(gè)核苷酸。

識(shí)別mRNA的3’端poly（A）尾，因此僅mRNA可被逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄引物：69逆轉(zhuǎn)錄引物：

（3）特異性引物

能與目標(biāo)RNA堿基序列互補(bǔ)的寡核苷酸引物，僅產(chǎn)生待分析基因的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄引物：70PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件71PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件72PCR（PolymeraseChainReaction)技術(shù)即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。1985年由美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明，榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。PCR（PolymeraseChainReactio73DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；體外DNA分子于不同溫度下可變性和復(fù)性的性質(zhì)。PCR的基本原理DNA半保留復(fù)制的機(jī)理；PCR的基本原理74PCR擴(kuò)增體系模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、cDNA，也可以使細(xì)菌、組織樣品等。引物（Primer）：確定擴(kuò)增目的序列的特異性；確定擴(kuò)增產(chǎn)物長度。DNA聚合酶（DNAPolymerase）：推動(dòng)PCR反應(yīng)進(jìn)行的機(jī)器。擴(kuò)增效率和保真性。緩沖液（Buffer）：控制體系的pH和離子強(qiáng)度，為DNA聚合酶提供最佳工作環(huán)境。脫氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本組成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。Mg2+、K+、增強(qiáng)劑PCR擴(kuò)增體系模板（Template）：基因組、質(zhì)粒DNA、751.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。2.退火：低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（45～65℃，30s）。3.延伸：中溫延伸。DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（

72℃，30～60s）。PCR的基本原理1.變性：高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（95℃，30s）。P76PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件77PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件78高溫變性高溫變性79低溫退火低溫退火80中溫延伸中溫延伸81PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件82PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件83PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件84理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴(kuò)增30循環(huán)，目標(biāo)DNA可增加230也就是109倍。實(shí)際：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，逐漸由指數(shù)形式變?yōu)榫€性形式，所以實(shí)際上進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)一般可達(dá)106～107。理論：2n遞增（n為循環(huán)次數(shù)），如果擴(kuò)增30循環(huán)，目標(biāo)DNA85PCR擴(kuò)增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互補(bǔ)序列，并與特定位點(diǎn)雜交。2.中期（M期）：擴(kuò)增反應(yīng)順利進(jìn)行，產(chǎn)物呈指數(shù)型增長。3.晚期（L期）：平臺(tái)期，DNA聚合酶過度損耗或者產(chǎn)物的抑制。PCR擴(kuò)增曲線1.早期（E期）:引物在單鏈DNA模板上搜索互86PCR擴(kuò)增條件循環(huán)PCR擴(kuò)增條件循環(huán)87PCR反應(yīng)條件94℃5min94℃30s56.2℃30s72℃30s72℃7min4℃∞PC1-P20：模板：基因組DNA；產(chǎn)物：506bp舉個(gè)例子PCR體系（10μL）模板：1μL上游引物：0.2μL下游引物：0.2μLEasyTaq酶：0.1μLEasyTaqBuffer：1μLdNTP：0.8μLddH2O：6.7μL30個(gè)循環(huán)PCR反應(yīng)條件PC1-P20：舉個(gè)例子PCR體系（10μL881.避免PCR試劑的污染2.最適合的反應(yīng)條件3.設(shè)置對(duì)照組：①PCR空白對(duì)照：在反應(yīng)體系中剔除反應(yīng)模板。②PCR陰性對(duì)照：即反應(yīng)體系中用無關(guān)的基因片段代替目的模板。③PCR陽性對(duì)照：即反應(yīng)體系中以已知能夠成功進(jìn)行特異性擴(kuò)增的模板。PCR的注意事項(xiàng)1.避免PCR試劑的污染PCR的注意事項(xiàng)891.為什么完全沒有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物？①試劑質(zhì)量問題或者加樣時(shí)出錯(cuò)，導(dǎo)致反應(yīng)體系不完整。②聚合酶失活或反應(yīng)體系中有聚合酶抑制劑。③PCR儀溫度控制不精確。④模板DNA發(fā)生降解。⑤引物或反應(yīng)溫度設(shè)計(jì)不合理⑥靶片段GC含量過高或擴(kuò)增對(duì)象長多常見問題1.為什么完全沒有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物？常見問題902.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？①反應(yīng)體系被污染。②引物特異性差。③退火溫度不合適。常見問題2.為什么出現(xiàn)多條非特異性條帶？常見問題913.為什么PCR產(chǎn)物很少？①聚合酶活性過低。②循環(huán)次數(shù)偏低。③模板DNA濃度過低。常見問題3.為什么PCR產(chǎn)物很少？常見問題924.為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？①DNA聚合酶過多或酶活性差。②dNTP和Mg2+濃度過高。③退火溫度過低，PCR循環(huán)數(shù)偏多。④模板DNA用量過大或模板DNA不純。⑤引物特異性差、引物間形成二聚體導(dǎo)致非特意擴(kuò)增。常見問題4.為什么PCR產(chǎn)物出現(xiàn)片狀拖尾？常見問題93普通PCR儀溫度梯度PCR儀普通PCR儀溫度梯度PCR儀94實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀95PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件96為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，同時(shí)也與PCR擴(kuò)增的效率密切相關(guān)。引物設(shè)計(jì)的最重要的原則：最大限度地提高擴(kuò)增效率和特異性；同時(shí)盡可能減少非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)的目的為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板D971、引物應(yīng)具有足夠的特異性。如果需要從基因組等較復(fù)雜的模板中擴(kuò)增特定的DNA序列，則需要考慮目的DNA序列的保守性，盡量避免所選引物設(shè)計(jì)區(qū)域序列的非特異性。引物與非特異序列的同源性不超過70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基。

NCBIPrimerBLAST

引物設(shè)計(jì)的基本原則1、引物應(yīng)具有足夠的特異性。引物設(shè)計(jì)的基本原則982、避開易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域。

分子內(nèi)互補(bǔ)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、分子間互補(bǔ)。

二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)這家引物與模板雜交以及PCR的困難，因此要盡可能避開這種序列區(qū)域。

用有關(guān)軟件預(yù)測(cè)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)。

引物設(shè)計(jì)的基本原則2、避開易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板序列區(qū)域。引物設(shè)計(jì)的基本原則993、引物長度一般為18-30個(gè)堿基之間。引物長度與反應(yīng)的特異性和解鏈溫度成正相關(guān)。過短：擴(kuò)增特異性下降過長：引物自身形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，以及引物二聚體。引物設(shè)計(jì)的基本原則3、引物長度一般為18-30個(gè)堿基之間。引物設(shè)計(jì)的基本原則1004、G+C含量一般為40%-60%引物的堿基組成也會(huì)對(duì)引物的解鏈溫度產(chǎn)生影響。G+C含量過低：引物解鏈溫度低，引物易于從模板上解離。G+C含量過高：引物解鏈溫度高，易與非特異性序列雜交，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。引物設(shè)計(jì)的基本原則4、G+C含量一般為40%-60%引物設(shè)計(jì)的基本原則1015、Tm值之差應(yīng)小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。一對(duì)引物的Tm值差過大可直接導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率下降或失敗。對(duì)于20bp左右的引物：Tm（℃）=2（A+T）+4（G+C）

一般情況下，PCR的最佳退火溫度比引物Tm值低5℃左右。引物設(shè)計(jì)的基本原則5、Tm值之差應(yīng)小于1℃，最適退火溫度在55-60℃。引物設(shè)1026、引物中四種堿基最好是隨機(jī)分布的避免4個(gè)以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重復(fù)。特別是引物的3’端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G或C，否則會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)域產(chǎn)生錯(cuò)配，降低擴(kuò)增的特異性。引物設(shè)計(jì)的基本原則6、引物中四種堿基最好是隨機(jī)分布的引物設(shè)計(jì)的基本原則1037、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身互補(bǔ)——發(fā)夾結(jié)構(gòu)

引物之間互補(bǔ)——二聚體

引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不應(yīng)超過3個(gè)，引物之間連續(xù)互補(bǔ)堿基不應(yīng)超過4個(gè)，尤其避免3’端的互補(bǔ)重疊。引物設(shè)計(jì)的基本原則7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物設(shè)計(jì)的基本原則1048、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物的5’端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。如：加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、引入點(diǎn)突變等。

由于延伸是從3’端開始的，所以不能進(jìn)行任何修飾。引物設(shè)計(jì)的基本原則8、引物的5’端可以修飾，3’端不可以修飾。引物設(shè)計(jì)的基本原1059、引物的3’端不可以A結(jié)尾。引物3’端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3’端最好選擇T。引物設(shè)計(jì)的基本原則9、引物的3’端不可以A結(jié)尾。引物設(shè)計(jì)的基本原則10610、引物3’端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增序列位于基因編碼區(qū)域，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。引物設(shè)計(jì)的基本原則10、引物3’端要避開密碼子的第3位。引物設(shè)計(jì)的基本原則1071、避免重復(fù)堿基，尤其是G。2、引物退火溫度在58-60℃之間。

3、G+C為30-80%。

4、3’端最后5個(gè)堿基內(nèi)不能有多于2個(gè)的G或C。5、引物的產(chǎn)物大小一般在80-250bp之間；80-150bp最為合適（可以延長至300bp）。

Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)原則1、避免重復(fù)堿基，尤其是G。Real-TimePCR引物設(shè)1086、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。7、Real-TimePCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，以避免基因組DNA污染影響。

Real-TimePCR引物設(shè)計(jì)原則6、要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。Real-109PrimerPremier5.0Oligo6Primer3（在線）Primer-BLAST（在線）引物設(shè)計(jì)常用軟件PrimerPremier5.0引物設(shè)計(jì)常用軟件110FileNewDNAsequence粘貼模板序列FileNewDNAsequence粘貼模板序111PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件112引物搜索引物搜索113引物位置產(chǎn)物大小引物長度引物位置產(chǎn)物大小引物長度114PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件115PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件116PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件117PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件118PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件119PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件120PrimerBLASTPrimerBLAST121PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件122PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件123PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件124PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件125PCR、引物設(shè)計(jì)及逆轉(zhuǎn)錄PCR解析課件126由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）稱作逆