ch13微生物細(xì)胞工程課件

第十三章微生物細(xì)胞工程第十三章微生物細(xì)胞工程1微生物細(xì)胞的特點(diǎn)微生物作為可以獨(dú)立存在的個體，其生長特點(diǎn)、代謝的特點(diǎn)與植物、動物有著顯著的區(qū)別。一般情況下，微生物由其自身完成其基本功能；微生物細(xì)胞的特點(diǎn)微生物作為可以獨(dú)立存在的個體，其生長特點(diǎn)、代2微生物菌種選育的目的和意義微生物菌種選育的目的和意義3微生物細(xì)胞的改造－育種傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)雜交和原生質(zhì)體融合技術(shù)基因工程定向進(jìn)化微生物細(xì)胞的改造－育種傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)4傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)自發(fā)突變育種誘變育種傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)自發(fā)突變育種5微生物突變類型變異類型變異性狀形態(tài)變異菌落形態(tài)菌落大小、形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)、顏色、產(chǎn)孢子多寡或有無細(xì)胞形態(tài)鞭毛、夾膜、菌絲形狀、生長速度、分枝多少及形狀、孢子大小和形狀、產(chǎn)孢子器官形狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜、孢子的表面結(jié)構(gòu)及抗原構(gòu)造生理生化變異糖類分解能力、色素產(chǎn)生能力、有關(guān)酶的活性、營養(yǎng)要求和性質(zhì)、溫度敏感性、代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力抗性變異耐藥性、對自身代謝產(chǎn)物抗性、噬菌體抗性、對紫外線及其他輻射因子的抗性等病原性變異病原產(chǎn)生能力、表面抗原等微生物突變類型變異類型變異性6遺傳變異類型遺傳變異類型細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒、噬菌體和線粒體DNA體外重組轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞中DNA染色體數(shù)目（單、雙、多倍體和非整倍體）突變重組（轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和融合）點(diǎn)突變（DNA分子中某一個堿基發(fā)生順序或數(shù)目的變化所致）區(qū)段突變（染色體或DNA片段的缺失、易位、倒位、替換、添加等造成的突變）遺傳變異類型遺傳變異類型細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒、噬菌體和線粒體DN7自發(fā)突變育種從生產(chǎn)中育種定向培育優(yōu)良菌株卡介苗的獲得吡哆醇高產(chǎn)菌株的獲得自發(fā)突變育種從生產(chǎn)中育種卡介苗的獲得吡哆醇高產(chǎn)菌株的獲得8誘變育種誘變育種的基本環(huán)節(jié)誘變育種誘變育種的基本環(huán)節(jié)9谷氨酸棒桿菌的野生型（左）和dapD突變株（右）細(xì)胞的電鏡照片谷氨酸棒桿菌的野生型（左）和dapD突變株（右）細(xì)胞的電鏡照10誘變育種中的幾個原則挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株單一遺傳純菌株選用對誘變劑敏感的菌株選用有應(yīng)用前景的菌株來自生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株選擇簡單有效的誘變劑及合適劑量處理單細(xì)胞或單孢子懸液復(fù)合誘變劑的處理誘變育種中的幾個原則挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株11營養(yǎng)缺陷型的篩選方法1、誘變處理2、淘汰野生型抗生素法青霉素制霉菌素(抑制甾醇的合成)菌絲過濾法(適于真菌和放線菌)3、檢出缺陷型4、鑒定缺陷型營養(yǎng)缺陷型的篩選方法1、誘變處理12檢出缺陷型基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(含菌)基本培養(yǎng)基完全或補(bǔ)充培養(yǎng)基夾層培養(yǎng)法檢出缺陷型基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(含菌)基本培養(yǎng)基完全或補(bǔ)充培13限量補(bǔ)充法<1%蛋白胨大，野小，變檢出缺陷型限量補(bǔ)充法<1%蛋白胨大，野小，變檢出缺陷型14逐個檢出法完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基檢出缺陷型逐個檢出法完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基檢出缺陷型15培養(yǎng)完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基影印培養(yǎng)法檢出缺陷型培養(yǎng)完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基影印培養(yǎng)法檢出缺陷型16鑒定缺陷型含菌基本培養(yǎng)基含營養(yǎng)物濾紙片生長譜法(氨基酸、維生素、堿基等)鑒定缺陷型含菌基本培養(yǎng)基含營養(yǎng)物濾紙片生長譜法(氨基酸、維生17各種化學(xué)誘變劑常用濃度和處理時間誘變劑濃度處理時間（min）緩沖液終止反應(yīng)方法效

應(yīng)備

注亞硝酸（液體）0.01~0.1M5~10pH4.5,1M醋酸緩沖液pH8.6,0.07MNa2HPO4溶液脫去堿基中的氨基后引起堿基轉(zhuǎn)換，造成突變有致癌作用，小心操作硫酸二乙酯（液體）o.5~1%(V/V)孢子15~30，菌絲18~24hpH7.0磷酸緩沖液Na2S2O3或大量稀釋誘變作用較強(qiáng)，殺菌作用較弱，使DNA的堿基和磷酸基發(fā)生烷化作用，引起突變。不溶于水，加微量乙醇可溶解亞硝基胍（固體）0.1~1.0mg/ml，孢子3mg/ml(高濃度及堿性pH)孢子30~120,菌絲90~120pH6.0,1M磷酸或醋酸緩沖液或三羥基甲基氨基甲烷-縮蘋果酸緩沖液大量稀釋pH低于5~5.5時，同硫酸二乙酯形成亞硝酸，堿性條件下產(chǎn)生重氮甲烷，引起殺菌和變異有致癌作用，小心操作，避光保存，易產(chǎn)生突變?nèi)焊鞣N化學(xué)誘變劑常用濃度和處理時間誘變劑濃度處理時間（min18誘變劑使用續(xù)1氮芥（液狀物）0.1~1mg/ml密閉反應(yīng)5~10甘氨酸或大量稀釋烷化劑，引起染色體畸變與NaHCO3作用即釋放N–芥子氣糜爛性毒氣，小心操作乙烯亞胺（液體）1:100~1:100028℃或低溫處理30~60稀釋烷化劑，高濃度效果較好有劇毒，易燃，可在4℃冰箱小心操作，避光保存鹽酸羥胺（液體）0.1~5%數(shù)小時或生長過程中誘變稀釋與胞嘧啶作用產(chǎn)生轉(zhuǎn)換，引起CG→AT突變有損健康，注意安全操作氯化鋰（白色粉末）0.3~0.5%加入培養(yǎng)基中，在生長過程中誘變稀釋需與紫外線、亞硝酸、硫酸二乙酯等復(fù)合處理才有效易溶于水，易潮解5-溴鳥嘧啶（白色粉末）20~30mg/ml與孢子懸浮液混合振蕩培養(yǎng)，處理一定時間后，稀釋涂皿稀釋有機(jī)體缺乏胸腺嘧啶時較易摻入DNA中引起突變，能誘發(fā)正突變與回復(fù)突變堿基類似物誘變劑使用續(xù)1氮芥（液狀物）0.1~1mg/ml密閉反應(yīng)5~19微生物原生質(zhì)體融合方法微生物放線菌（鏈霉菌）G+細(xì)菌（桿菌）霉菌（頂頭孢霉）菌體準(zhǔn)備液體培養(yǎng)基中加0.3%~1%甘氨酸液體培養(yǎng)基加0.5mol/L蔗糖0.2g濕菌體在含有0.01mol/LDTT的檸檬酸－磷酸鹽buffer中預(yù)處理60min穩(wěn)定劑Pbuffer※SMMADbuffer※※0.7mol/LNaCl酶及濃度溶菌酶1mg/ml，30℃，15~60min溶菌酶100mg/ml，42℃，30分鐘5mg/mlNovozyme、0.5%蝸牛酶＋1%纖維素酶，28℃，180min融合劑65%PEG（分子量4000）0.5~1min40%PEG（分子量6000）2min30%PEG（分子量6000），0.01mol/LCaCl2溶液＋0.05mol/L甘氨酸（pH=7.5）30℃，10min微生物原生質(zhì)體融合方法微生物放線菌G+細(xì)菌霉菌菌體準(zhǔn)備液體培20

原生質(zhì)體融合-原生質(zhì)體融合-21原生質(zhì)體制備：（1）

根據(jù)材料選擇破壁酶

細(xì)菌：溶菌酶

真菌:Zymolyase-20T，5000T，Novozyme234，蝸牛酶，纖維素酶，

溶壁酶，崩潰酶，

幾丁質(zhì)酶等（2）

緩沖液（3）酶解條件

溫度、時間、酶成分配比等原生質(zhì)體制備：（1）根據(jù)材料選擇破壁酶22融合電融合技術(shù)：

原生質(zhì)體在電場中，由于加直流脈沖，膜被擊穿，導(dǎo)致融合的發(fā)生。特點(diǎn)：

空間定向，時間同步，顯微鏡監(jiān)視化學(xué)因子誘導(dǎo)融合：

聚乙二醇（polyetheneglycol,PEG）Ca2+

、Mg2+

等陽離子pH融合電融合技術(shù)：23再生

恢復(fù)細(xì)胞原貌，能夠再生長

高滲培養(yǎng)基

蔗糖

（0.6M）

山梨醇(1.0M)

氯化鈉(0.7M)再生恢復(fù)細(xì)胞原貌，能夠再生長24基因工程一、概念

基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，即用人工方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)－DNA大分子提取出來，在離體條件下進(jìn)行切割后，把它和載體的DNA分子連接起來，然后導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，以讓外來的遺傳物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)。所以基因工種是人們在分子生物學(xué)理論指導(dǎo)下的一種自覺的能象工程一樣可事先設(shè)計和控制的育種新技術(shù)，是人工的離體的分子水平上的一種遺傳重組技術(shù)，是一種可完全超遠(yuǎn)緣雜交的育種新技術(shù)，因而是一種最新、最有前途的定向育種新技術(shù)?；蚬こ桃弧⒏拍?5二、主要操作過程

（一）基因分離

1、分別提取供體細(xì)胞（各種生物都可選用）的DNA與作為載體的松馳型細(xì)菌質(zhì)粒（也可用噬菌體或病毒作載體）。2、根據(jù)“工程藍(lán)圖”的要求，在供體DNA中加入專一性很強(qiáng)的限制性核酸內(nèi)切酶，從而獲得帶有特定基因并露出粘性末端的DNA單鏈部分（必須時可人工合成粘性末端）。二、主要操作過程（一）基因分離26（二）體外重組

把供體細(xì)胞DNA片段與質(zhì)粒DNA片段放在試管中，在較低的溫度（56℃）下混合“退火”。由于每一種限制性內(nèi)切酶所切斷的雙鏈DNA片段的粘接末端有相同的核苷酸組成，所以當(dāng)兩者混在一起時，凡粘接末端上堿基互補(bǔ)片段就會因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鏈，這時在外加的連接酶作用下，供體的DNA與質(zhì)粒DNA片段相連，形成了一個完整復(fù)制能力的環(huán)狀重組體“雜種質(zhì)粒”。

（二）體外重組把供體細(xì)胞DNA片段與質(zhì)粒D27（三）重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)（四）復(fù)制、表達(dá)

這種雜種質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，通過自我復(fù)制而擴(kuò)增，并使受體細(xì)胞表達(dá)為供體細(xì)胞所固有的部分遺傳性狀，這種受體菌，即成為“工程菌”。

（三）重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)（四）復(fù)制、表達(dá)28（五）篩選、繁殖

質(zhì)粒，或所帶DNA能表達(dá)產(chǎn)生一定產(chǎn)物，可通過一選擇性培養(yǎng)基或試劑鑒別出來。

原來100000g胰臟僅能提取3－4g胰島素，而用工程菌發(fā)酵生產(chǎn)，只要幾升發(fā)酵液便可取得同樣數(shù)量的產(chǎn)品。（五）篩選、繁殖質(zhì)粒，或所帶DNA能表達(dá)產(chǎn)29分子育種容錯PCRDNAshuffling分子育種容錯PCR30容錯PCR（Error-pronePolymeraseChainReaction,ep-PCR）Taq聚合酶是從一株耐熱細(xì)菌Thermusaquaticus中分離獲得，由于它缺乏3’－5’的校正活性，因此在PCR過程中會插入一些錯誤的堿基。在通常情況下，發(fā)生錯誤堿基插入的頻率為0.1～2x10-4。通過改變PCR的一些反應(yīng)條件，可以增加這種錯誤堿基插入的頻率，從而可用來實現(xiàn)基因的定向進(jìn)化。容錯PCR（Error-pronePolymeraseC31在PCR系統(tǒng)中可用于增加堿基錯誤插入頻率的方法增加MgCl2濃度；加入一定濃度的MnCl2；在PCR中采用不平衡的核苷酸濃度；核苷酸類似物的三磷酸衍生物的混合物.在PCR系統(tǒng)中可用于增加堿基錯誤插入頻率的方法增加MgCl32DNAshufflingDNAShuffling技術(shù)一個或多個不同來源的基因切成片段無引物PCR擴(kuò)增篩選一個或多個所需的性狀重復(fù)DNAShuffling獲得高百分比的功能基因庫主要優(yōu)點(diǎn)：大大減少與鑒別所需候選產(chǎn)物有 關(guān)的成本和時間

難點(diǎn)：設(shè)計一個高效的分析和篩選方法DNAshufflingDNAShuffling技術(shù)33第十三章微生物細(xì)胞工程第十三章微生物細(xì)胞工程34微生物細(xì)胞的特點(diǎn)微生物作為可以獨(dú)立存在的個體，其生長特點(diǎn)、代謝的特點(diǎn)與植物、動物有著顯著的區(qū)別。一般情況下，微生物由其自身完成其基本功能；微生物細(xì)胞的特點(diǎn)微生物作為可以獨(dú)立存在的個體，其生長特點(diǎn)、代35微生物菌種選育的目的和意義微生物菌種選育的目的和意義36微生物細(xì)胞的改造－育種傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)雜交和原生質(zhì)體融合技術(shù)基因工程定向進(jìn)化微生物細(xì)胞的改造－育種傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)37傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)自發(fā)突變育種誘變育種傳統(tǒng)菌種選育技術(shù)自發(fā)突變育種38微生物突變類型變異類型變異性狀形態(tài)變異菌落形態(tài)菌落大小、形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)、顏色、產(chǎn)孢子多寡或有無細(xì)胞形態(tài)鞭毛、夾膜、菌絲形狀、生長速度、分枝多少及形狀、孢子大小和形狀、產(chǎn)孢子器官形狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞膜、孢子的表面結(jié)構(gòu)及抗原構(gòu)造生理生化變異糖類分解能力、色素產(chǎn)生能力、有關(guān)酶的活性、營養(yǎng)要求和性質(zhì)、溫度敏感性、代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力抗性變異耐藥性、對自身代謝產(chǎn)物抗性、噬菌體抗性、對紫外線及其他輻射因子的抗性等病原性變異病原產(chǎn)生能力、表面抗原等微生物突變類型變異類型變異性39遺傳變異類型遺傳變異類型細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒、噬菌體和線粒體DNA體外重組轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染進(jìn)入宿主細(xì)胞中DNA染色體數(shù)目（單、雙、多倍體和非整倍體）突變重組（轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和融合）點(diǎn)突變（DNA分子中某一個堿基發(fā)生順序或數(shù)目的變化所致）區(qū)段突變（染色體或DNA片段的缺失、易位、倒位、替換、添加等造成的突變）遺傳變異類型遺傳變異類型細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)質(zhì)粒、噬菌體和線粒體DN40自發(fā)突變育種從生產(chǎn)中育種定向培育優(yōu)良菌株卡介苗的獲得吡哆醇高產(chǎn)菌株的獲得自發(fā)突變育種從生產(chǎn)中育種卡介苗的獲得吡哆醇高產(chǎn)菌株的獲得41誘變育種誘變育種的基本環(huán)節(jié)誘變育種誘變育種的基本環(huán)節(jié)42谷氨酸棒桿菌的野生型（左）和dapD突變株（右）細(xì)胞的電鏡照片谷氨酸棒桿菌的野生型（左）和dapD突變株（右）細(xì)胞的電鏡照43誘變育種中的幾個原則挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株單一遺傳純菌株選用對誘變劑敏感的菌株選用有應(yīng)用前景的菌株來自生產(chǎn)中的自發(fā)突變菌株選擇簡單有效的誘變劑及合適劑量處理單細(xì)胞或單孢子懸液復(fù)合誘變劑的處理誘變育種中的幾個原則挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株44營養(yǎng)缺陷型的篩選方法1、誘變處理2、淘汰野生型抗生素法青霉素制霉菌素(抑制甾醇的合成)菌絲過濾法(適于真菌和放線菌)3、檢出缺陷型4、鑒定缺陷型營養(yǎng)缺陷型的篩選方法1、誘變處理45檢出缺陷型基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(含菌)基本培養(yǎng)基完全或補(bǔ)充培養(yǎng)基夾層培養(yǎng)法檢出缺陷型基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(含菌)基本培養(yǎng)基完全或補(bǔ)充培46限量補(bǔ)充法<1%蛋白胨大，野小，變檢出缺陷型限量補(bǔ)充法<1%蛋白胨大，野小，變檢出缺陷型47逐個檢出法完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基檢出缺陷型逐個檢出法完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基檢出缺陷型48培養(yǎng)完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基影印培養(yǎng)法檢出缺陷型培養(yǎng)完全培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基影印培養(yǎng)法檢出缺陷型49鑒定缺陷型含菌基本培養(yǎng)基含營養(yǎng)物濾紙片生長譜法(氨基酸、維生素、堿基等)鑒定缺陷型含菌基本培養(yǎng)基含營養(yǎng)物濾紙片生長譜法(氨基酸、維生50各種化學(xué)誘變劑常用濃度和處理時間誘變劑濃度處理時間（min）緩沖液終止反應(yīng)方法效

應(yīng)備

注亞硝酸（液體）0.01~0.1M5~10pH4.5,1M醋酸緩沖液pH8.6,0.07MNa2HPO4溶液脫去堿基中的氨基后引起堿基轉(zhuǎn)換，造成突變有致癌作用，小心操作硫酸二乙酯（液體）o.5~1%(V/V)孢子15~30，菌絲18~24hpH7.0磷酸緩沖液Na2S2O3或大量稀釋誘變作用較強(qiáng)，殺菌作用較弱，使DNA的堿基和磷酸基發(fā)生烷化作用，引起突變。不溶于水，加微量乙醇可溶解亞硝基胍（固體）0.1~1.0mg/ml，孢子3mg/ml(高濃度及堿性pH)孢子30~120,菌絲90~120pH6.0,1M磷酸或醋酸緩沖液或三羥基甲基氨基甲烷-縮蘋果酸緩沖液大量稀釋pH低于5~5.5時，同硫酸二乙酯形成亞硝酸，堿性條件下產(chǎn)生重氮甲烷，引起殺菌和變異有致癌作用，小心操作，避光保存，易產(chǎn)生突變?nèi)焊鞣N化學(xué)誘變劑常用濃度和處理時間誘變劑濃度處理時間（min51誘變劑使用續(xù)1氮芥（液狀物）0.1~1mg/ml密閉反應(yīng)5~10甘氨酸或大量稀釋烷化劑，引起染色體畸變與NaHCO3作用即釋放N–芥子氣糜爛性毒氣，小心操作乙烯亞胺（液體）1:100~1:100028℃或低溫處理30~60稀釋烷化劑，高濃度效果較好有劇毒，易燃，可在4℃冰箱小心操作，避光保存鹽酸羥胺（液體）0.1~5%數(shù)小時或生長過程中誘變稀釋與胞嘧啶作用產(chǎn)生轉(zhuǎn)換，引起CG→AT突變有損健康，注意安全操作氯化鋰（白色粉末）0.3~0.5%加入培養(yǎng)基中，在生長過程中誘變稀釋需與紫外線、亞硝酸、硫酸二乙酯等復(fù)合處理才有效易溶于水，易潮解5-溴鳥嘧啶（白色粉末）20~30mg/ml與孢子懸浮液混合振蕩培養(yǎng)，處理一定時間后，稀釋涂皿稀釋有機(jī)體缺乏胸腺嘧啶時較易摻入DNA中引起突變，能誘發(fā)正突變與回復(fù)突變堿基類似物誘變劑使用續(xù)1氮芥（液狀物）0.1~1mg/ml密閉反應(yīng)5~52微生物原生質(zhì)體融合方法微生物放線菌（鏈霉菌）G+細(xì)菌（桿菌）霉菌（頂頭孢霉）菌體準(zhǔn)備液體培養(yǎng)基中加0.3%~1%甘氨酸液體培養(yǎng)基加0.5mol/L蔗糖0.2g濕菌體在含有0.01mol/LDTT的檸檬酸－磷酸鹽buffer中預(yù)處理60min穩(wěn)定劑Pbuffer※SMMADbuffer※※0.7mol/LNaCl酶及濃度溶菌酶1mg/ml，30℃，15~60min溶菌酶100mg/ml，42℃，30分鐘5mg/mlNovozyme、0.5%蝸牛酶＋1%纖維素酶，28℃，180min融合劑65%PEG（分子量4000）0.5~1min40%PEG（分子量6000）2min30%PEG（分子量6000），0.01mol/LCaCl2溶液＋0.05mol/L甘氨酸（pH=7.5）30℃，10min微生物原生質(zhì)體融合方法微生物放線菌G+細(xì)菌霉菌菌體準(zhǔn)備液體培53

原生質(zhì)體融合-原生質(zhì)體融合-54原生質(zhì)體制備：（1）

根據(jù)材料選擇破壁酶

細(xì)菌：溶菌酶

真菌:Zymolyase-20T，5000T，Novozyme234，蝸牛酶，纖維素酶，

溶壁酶，崩潰酶，

幾丁質(zhì)酶等（2）

緩沖液（3）酶解條件

溫度、時間、酶成分配比等原生質(zhì)體制備：（1）根據(jù)材料選擇破壁酶55融合電融合技術(shù)：

原生質(zhì)體在電場中，由于加直流脈沖，膜被擊穿，導(dǎo)致融合的發(fā)生。特點(diǎn)：

空間定向，時間同步，顯微鏡監(jiān)視化學(xué)因子誘導(dǎo)融合：

聚乙二醇（polyetheneglycol,PEG）Ca2+

、Mg2+

等陽離子pH融合電融合技術(shù)：56再生

恢復(fù)細(xì)胞原貌，能夠再生長

高滲培養(yǎng)基

蔗糖

（0.6M）

山梨醇(1.0M)

氯化鈉(0.7M)再生恢復(fù)細(xì)胞原貌，能夠再生長57基因工程一、概念

基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，即用人工方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)－DNA大分子提取出來，在離體條件下進(jìn)行切割后，把它和載體的DNA分子連接起來，然后導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，以讓外來的遺傳物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)。所以基因工種是人們在分子生物學(xué)理論指導(dǎo)下的一種自覺的能象工程一樣可事先設(shè)計和控制的育種新技術(shù)，是人工的離體的分子水平上的一種遺傳重組技術(shù)，是一種可完全超遠(yuǎn)緣雜交的育種新技術(shù)，因而是一種最新、最有前途的定向育種新技術(shù)?；蚬こ桃?、概念58二、主要操作過程

（一）基因分離

1、分別提取供體細(xì)胞（各種生物都可選用）的DNA與作為載體的松馳型細(xì)菌質(zhì)粒（也可用噬菌體或病毒作載體）。2、根據(jù)“工程藍(lán)圖”的要求，在供體DNA中加入專一性很強(qiáng)的限制性核酸內(nèi)切酶，從而獲得帶有特定基因并露出粘性末端的DNA單鏈部分（必須時可人工合成粘性末端）。二、主要操作過程（一）基因分離59（二）體外重組

把供體細(xì)胞DNA片段與質(zhì)粒DNA片段放在試管中，在較低的溫度（56℃）下混合“退火”。由于每一種限制性內(nèi)切酶所切斷的雙鏈DNA片段的粘接末端有相同的核苷酸組成，所以當(dāng)兩者混在一起時，凡粘