高效液相色譜法及其應(yīng)用

高效液相色譜法及其應(yīng)用

趙建軍高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!高效液相色譜法

基本概念分離原理系統(tǒng)結(jié)構(gòu)分析方法實(shí)際應(yīng)用高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!1903年俄羅斯植物學(xué)家Tsweet茨維特

植物色素玻璃柱CaCO3石油醚淋洗石油醚色譜法（Chromatography）

希臘語chroma(色)和graphos(譜)

高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!

色譜分析法的定義色譜分析法是一種物理化學(xué)分離方法,其分離原理是：溶于流動(dòng)相(石油醚)中的樣品(植物色素)各組分經(jīng)過固定相

(CaCO3)時(shí)，其與固定相發(fā)生吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等相互作用，且其作用的大小、強(qiáng)弱不同，導(dǎo)致在固定相中滯留的時(shí)間也不同，從而先后從固定相中流出，實(shí)現(xiàn)了不同組分的分離。當(dāng)分離后的組分由流動(dòng)相攜帶進(jìn)入檢測器時(shí)，就得到了一個(gè)一個(gè)的色譜峰。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!色譜分離理論

分離過程：組分賽跑

同時(shí)起跑先后到達(dá)終點(diǎn)這取決于色譜過程的熱力學(xué)性質(zhì)、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!氣相色譜法超臨界流體色譜法

紙色譜法薄層色譜法

液相色譜法

特別適用于分離

沸點(diǎn)高和

熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)

色譜分析類方法是分析化學(xué)的主流

液相色譜類方法是色譜中的主流高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!高壓：一般可以達(dá)到150~300kg/cm2高效：分離效能很高,操作簡便易行。高速：一般可達(dá)l—10mL／min，分析一個(gè)試樣中的幾個(gè)組分一般只要幾到幾十分鐘。高靈敏度：紫外檢測器的最小檢測量可達(dá)0.01ng。高效液相色譜的高靈敏度還表現(xiàn)在所需試樣很少，微升數(shù)量級(jí)的樣品就足以進(jìn)行全分析。適用面廣：有多種分離模式可供選擇，可分析80%有機(jī)化合物。操作自動(dòng)化價(jià)格高：儀器設(shè)備相對(duì)較貴，操作費(fèi)用較高。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!

泵液進(jìn)樣分離檢測

記錄高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!手動(dòng)進(jìn)樣器-六通閥/定量環(huán)六通閥/定量環(huán)通廢液口定量環(huán)進(jìn)柱高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!

取樣時(shí)，流動(dòng)相直接進(jìn)柱，進(jìn)樣口與定量環(huán)連接，樣品充滿定量環(huán)后，多余樣品流出。

進(jìn)樣時(shí)，泵將流動(dòng)相壓入定量環(huán)，將樣品全部攜帶進(jìn)入色譜柱分析。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!

色譜柱的分離效率（簡稱柱效），可定量地用理論塔板數(shù)N來表示。

理論塔板數(shù)N柱效檢測次序：尿嘧啶/苯酚/4-氯硝基苯/甲苯AgilentXDB-C8柱：4.6×150mm,5μm高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!可變波長的紫外吸收檢測器高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!色譜工作站：把模擬信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào),然后采用色譜軟件處理，給出色譜圖等信息。進(jìn)樣器高壓泵流動(dòng)相色譜柱檢測器數(shù)據(jù)處理互動(dòng)控制功能高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!高效液相色譜方法開發(fā)

與色譜條件優(yōu)化高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!色譜圖和色譜峰參數(shù)

色譜圖：試樣中各組分經(jīng)色譜柱分離后，按先后次序經(jīng)過檢測器時(shí)，檢測器就將流動(dòng)相中各組分濃度變化轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號(hào)，由記錄儀所記錄下的信號(hào)——時(shí)間曲線或信號(hào)——流動(dòng)相體積曲線，稱為色譜流出曲線或色譜圖。

色譜圖由基線和若干色譜峰所組成。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!峰高：色譜峰頂點(diǎn)與峰底之間的垂直距離稱為峰高(peakheight)。用h表示。峰面積：峰與峰底之間的面積稱為峰面積(peakarea)，用A表示。峰底寬度（W）——自色譜峰上升沿和下降沿的拐點(diǎn)所作切線在基線上的截距。

半峰寬（Wh）——峰高一半處的色譜峰寬度。注意，W=1.70Wh。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!

R=1

分離程度達(dá)95.4%

R>=1.5

完全分離,達(dá)>=99.7

也叫基線分離

R<1

二峰明顯重疊分離條件的優(yōu)化：

分離度(resolution，R)--相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率，表示相鄰兩峰的分離程度。

高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!高效液相色譜分析方法

定性分析方法

定量分析方法：

外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法

高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!內(nèi)標(biāo)法

方法：選擇一種試樣中不存在的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，將一定量的內(nèi)標(biāo)物加入到準(zhǔn)確稱量的試樣之中，混勻后取一定體積進(jìn)樣分離，通過外加的內(nèi)標(biāo)物與待測物的峰面積、校正因子之間的比例關(guān)系，由內(nèi)標(biāo)物的量來確定待測物的量。

優(yōu)點(diǎn)：不受試樣中的各組分是否都出峰的限制，也可以消除由于進(jìn)樣量和其它實(shí)驗(yàn)條件的波動(dòng)對(duì)定量的影響。

缺點(diǎn)：每一個(gè)試樣均需加入一定量的內(nèi)標(biāo)物，增加了測定的工作量。

高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!不過，內(nèi)標(biāo)物的選擇要符合以下要求：（1）內(nèi)標(biāo)物的峰與組分峰能完全分離（2）內(nèi)標(biāo)物峰在色譜圖上出現(xiàn)的位置，最好在欲定量組分峰的鄰近位置。如果樣品中有幾個(gè)組分需要定量，并且他們的k’之差別較大，這時(shí)就需要用幾個(gè)內(nèi)標(biāo)物來作定量測定。（3）內(nèi)標(biāo)物的性質(zhì)和濃度盡量與預(yù)測定峰的接近。（4）內(nèi)標(biāo)物是樣品中不存在的，與樣品各組分、柱填料和移動(dòng)相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。根據(jù)組分百分含量與其色譜峰面積成正比的關(guān)系進(jìn)行計(jì)算：高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!樣品處理、

預(yù)先稀釋：使用流動(dòng)相溶解樣品

--減少溶劑峰，尤其是組分峰靠近溶劑峰時(shí)尤為重要

--保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在柱中產(chǎn)生沉淀樣品瓶進(jìn)樣前準(zhǔn)備

0.45μm

濾膜

樣品過濾高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁!流動(dòng)相脫氣吹氦脫氣法抽真空脫氣法超聲波脫氣法在線真空脫氣法高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁!5重新連接色譜柱，設(shè)定適當(dāng)流速，當(dāng)流動(dòng)相流出約30倍于色譜柱體積，并且檢測器基線平衡后，流動(dòng)相更換完畢流動(dòng)相的更換——更換互溶流動(dòng)相1將新流動(dòng)相置于儲(chǔ)液瓶中(已過濾和超聲處理的)

2打開排空閥，啟動(dòng)泵,使新的流動(dòng)相從排空閥出口流出20ml左右3關(guān)閉排空閥，然后將進(jìn)樣閥與色譜柱相連接端卸開，用小容器放置于進(jìn)樣閥的出口處4啟動(dòng)恒流泵，讓流動(dòng)相從進(jìn)樣閥出口流出10ml左右高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁!色譜柱在任何情況下不能碰撞、彎曲或強(qiáng)烈震動(dòng)色譜柱的保養(yǎng)8945612370xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:::::::輸液時(shí)不要打開排液閥瞬間壓力劇烈變化高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁!常見問題分析原因解決辦法峰形展寬“鬼峰”脫尾峰雙重峰或分叉峰高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁!幾個(gè)概念：

相(Phase):——“相”是物理化學(xué)術(shù)語,特指在某一系統(tǒng)中,具有相同成分及相同物理、化學(xué)性質(zhì)的均勻物質(zhì)部分。各相之間有明顯可分的界面

固定相(StationaryPhase)：色譜柱內(nèi)保持固定、起分離作用的填充物。

流動(dòng)相(MobilePhase)：流經(jīng)固定相空隙或表面的液體或氣體。

色譜柱：進(jìn)行色譜分離用的細(xì)長管柱。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁!慢中等快Temporalcourse流動(dòng)相各組分的理化特性不同

吸附、分配、離子吸引、排阻、親和等相互作用的大小、強(qiáng)弱各不相同分離原理：兩相分配高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁!高效液相色譜法

(HPLC)HighPerformanceLiquidChromatographyHighPerssureLiquidChromatographyHighSpeedLiquidChromatography

特點(diǎn)：高高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁!高效液相色譜儀溶劑傳輸系統(tǒng)：心臟高壓泵樣品引入系統(tǒng)：進(jìn)樣器樣品分離系統(tǒng)：關(guān)鍵色譜柱信號(hào)檢測系統(tǒng)：檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：工作站高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁!高壓輸液泵

往復(fù)型泵工作原理圖單向閥/紅寶石球高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁!泵體材料耐腐蝕泵腔的體積要小，以便快速更換溶劑能在高壓下連續(xù)工作,耐壓40-50MPa/

cm2壓力平穩(wěn)，無脈沖高壓輸液泵輸出流量穩(wěn)定，重復(fù)性高,輸出流量范圍寬高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁!開始分析廢液樣品

淋洗液至分離柱進(jìn)樣閥樣品裝樣廢液

淋洗液至分離柱（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）樣品環(huán)

因HPLC柱壓高，需先將試樣注入到色譜儀進(jìn)樣閥的采樣環(huán)中，然后切換進(jìn)樣閥，將一定體積的試樣注入到色譜柱的柱頭。進(jìn)樣系統(tǒng)高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第34頁!色譜柱（固定相、填料）

色譜柱是色譜儀的心臟（起分離作用），其核心是優(yōu)質(zhì)的固定相（填料）。進(jìn)行色譜分離的首要工作是選擇性能良好和適宜的色譜柱，即在確定的分離條件下分離效率高和分析時(shí)間短的色譜柱。

色譜柱的選擇應(yīng)考慮：固定相類型的選擇,主要取決于樣品及其分離模式；柱填料的結(jié)構(gòu),主要指顆粒的形狀大小、均勻性、比表面、平均孔徑和孔容等；柱規(guī)格指柱內(nèi)徑、柱長度和填料粒度高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第35頁!高效液相色譜檢測器

近幾年出現(xiàn)的蒸發(fā)激光散射檢測器（ELSD）有望成為高效液相色譜全新的通用靈敏的質(zhì)量檢測器。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第36頁!檢測器(detector)的主要性能要求：靈敏度（sensitivity）高（檢測限低）噪音（noise）低線性范圍（linearrange）寬重復(fù)性（repeatability）好適用范圍廣（通用型、專屬型）

峰的檢測切線色譜峰的判斷最小面積高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第37頁!建立高效液相色譜分析方法

①根據(jù)被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。②選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規(guī)格（柱內(nèi)徑及柱長）和選用固定相（粒徑及孔徑）。③選擇適當(dāng)?shù)幕騼?yōu)化的分離操作條件，確定流動(dòng)相的組成、流速及洗脫方式。④由獲得的色譜圖進(jìn)行定性分析和定量分析。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第38頁!高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第39頁!

色譜法：是一種用來分離、分析多組分混合物的極為有效的物理化學(xué)分析方法。廣泛用于化工、食品、醫(yī)藥、生化、衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)和高能化合物等生產(chǎn)和科研工作中。高效液相色譜的應(yīng)用高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第40頁!色譜圖相關(guān)術(shù)語

色譜峰:當(dāng)組分隨流動(dòng)相進(jìn)入檢測器時(shí)，其響應(yīng)信號(hào)大小隨時(shí)間變化所形成的峰形曲線，正常的色譜峰呈正態(tài)分布。

基線:在操作條件下，僅有純流動(dòng)相進(jìn)入檢測器時(shí)的流出曲線。

←色譜峰基線↓峰高峰寬時(shí)間(分)響應(yīng)值高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第41頁!保留時(shí)間(retentiontime,tR)——從進(jìn)樣開始到檢測器測到某組分信號(hào)最大值(即流動(dòng)相中該組分的濃度最大值)時(shí)所需的時(shí)間。死時(shí)間(deadtime,t0)——完全不溶解于固定相因而不被固定相所保留的組分從進(jìn)樣到該組分信號(hào)最大值出現(xiàn)時(shí)所需要的時(shí)間。校正保留時(shí)間(adjustedretentiontime

，t'R)——組分的保留時(shí)間減去死時(shí)間。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第42頁!色譜參數(shù)的用途：根據(jù)保留值可進(jìn)行定性分析；根據(jù)峰高或峰面積可進(jìn)行定量分析；根據(jù)色譜峰的保留值和峰寬參數(shù)可以評(píng)價(jià)色譜的分離效率。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第43頁!外標(biāo)法---標(biāo)準(zhǔn)曲線法

具體作法：

用待測組分標(biāo)準(zhǔn)物制備一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的色譜條件下取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分離，用待測組分的峰面積對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，此標(biāo)準(zhǔn)工作曲線應(yīng)是通過原點(diǎn)的直線。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的斜率即為絕對(duì)校正因子。分析試樣時(shí)，在相同的色譜條件下取同樣體積的試樣進(jìn)樣分離，由所得待測組分的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得待測組分的含量。

特點(diǎn)：

外標(biāo)法操作簡單，適合大批量試樣的分析。但是，進(jìn)樣量等實(shí)驗(yàn)條件對(duì)測定的準(zhǔn)確度有很大的影響。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第44頁!

內(nèi)標(biāo)法在色譜分析中是一種常用的定量分析法。它尤其廣泛的應(yīng)用于高壓液相色譜中。這種方法可以抵消儀器和過程帶來的誤差。

將一定量的某種純物質(zhì)，作為內(nèi)標(biāo)物加入到已知重量的樣品中，進(jìn)行色譜分析，內(nèi)標(biāo)物在色譜圖上得到分離的峰。根據(jù)已知含量的內(nèi)標(biāo)物的峰面積和樣品的峰面積，計(jì)算組分的百分含量。

只要主要組分能被分離和能被檢測就可使用這個(gè)方法，一些次要組分成為重疊峰或者對(duì)檢測器無響應(yīng)就可以允許存在。高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第45頁!HPLC的日常操作條件最好是恒溫、恒濕溫度：15—30℃相對(duì)濕度<80%房間應(yīng)有良好的通風(fēng)避免光線直射遠(yuǎn)離高電磁干擾、高振動(dòng)設(shè)備優(yōu)良的常規(guī)操作高效液相色譜法及其應(yīng)用共51頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第46頁!流動(dòng)相的選擇（超純水

、乙腈）

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采用“HPLC”級(jí)溶劑。