DNA重組技術(shù)的基本工具課件

專(zhuān)題11.1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程專(zhuān)題11.1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程DNA重組技術(shù)的基本工具課件對(duì)基因工程的概念的理解別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程實(shí)質(zhì)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平獲得人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組對(duì)基因工程的概念的理解別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程實(shí)基因工程的理論依據(jù)1.DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)，——部分病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，其他生物的遺傳物質(zhì)是DNA都由4種脫氧核苷酸聚合而組成DNA具有雙螺旋結(jié)構(gòu)不同生物的DNA基本單位和結(jié)構(gòu)相同基因工程的理論依據(jù)1.DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)，—4脫氧核糖磷酸含氮堿基脫氧核苷酸堿基對(duì)氫鍵磷酸二酯鍵基本骨架DNA的基本結(jié)構(gòu)脫氧核糖磷酸含氮堿基脫氧核苷酸堿基對(duì)氫鍵磷酸二酯鍵基本骨架D52.中心法則：DNARNA蛋白質(zhì)（性狀）復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制在絕大多數(shù)生物中，親代DNA通過(guò)復(fù)制而將遺傳信息傳遞給子代；DNA通過(guò)控制蛋白質(zhì)合成而控制個(gè)體性狀表達(dá)基因工程的理論依據(jù)2.中心法則：DNARNA蛋白質(zhì)（性狀）復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆63.基因是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位基因是指有遺傳效應(yīng)的DNA片段一個(gè)DNA分子上有多個(gè)基因基因工程的理論依據(jù)4.各種生物共用一套遺傳密碼——相同的DNA堿基序列,在不同生物細(xì)胞中翻譯出相同的蛋白質(zhì)，表達(dá)為相同的性狀;3.基因是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位基因是指有遺傳效應(yīng)的7科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論達(dá)8科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論孟德?tīng)柼岢龌虻姆蛛x定律和自由組合定律科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論孟9科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律。科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論摩10科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體?？萍继剿髦罚夯A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論艾11科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論12科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論梅13科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論克14科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明?？萍继剿髦罚夯A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論115“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶一.主要來(lái)源：—原核生物中分離純化出來(lái)的一類(lèi)酶1、限制酶主要存在原核生物，它有什么意義？限制酶在原核生物中主要是切割外源DNA，使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自己的目的?！胺肿邮中g(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶一.主要來(lái)源：—16二.功能：——識(shí)別特定的核苷酸序列，在特定的部位斷裂磷酸二酯鍵。（1）識(shí)別序列：限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對(duì)稱(chēng)、重復(fù)排列的。二.功能：——識(shí)別特定的核苷酸序列，在特定的部位斷裂磷酸二酯17（2）切割部位：磷酸二酯鍵（2）切割部位：磷酸二酯鍵18

EcoRⅠ黏性末端黏性末端三.作用結(jié)果形成粘性末端或平末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端三.作用結(jié)果形成粘性末端192、為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。2、為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本原核生物中不存在該酶20現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出與約4000種限制性?xún)?nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia

marcesens）大腸桿菌（Escherichia

coli

R）練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出與約4000種限21生物A基因片段生物B基因片段EcoRⅠEcoRⅠDNA連接酶生物A基因片段生物B基因片段EcoRⅠEcoRⅠDNA連接酶22（二）“分子縫合針”DNA連接酶1.作用：將雙鏈DNA片段之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)2.種類(lèi)：⑴E·coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶（二）“分子縫合針”DNA連接酶1.作用：將雙鏈DNA片段23

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低類(lèi)型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)來(lái)源功能相同點(diǎn)差別T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效24DNA重組技術(shù)的基本工具課件25比較：DNA連接酶與DNA聚合酶DNA聚合酶DNA連接酶作用底物模板相同點(diǎn)1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板比較：DNA連接酶與DNA聚合酶DNA聚合酶DNA連接酶相同26三、基因的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”1、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；

載體的作用：

1、將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去（攜帶重組DNA分子）。2、能夠使外源基因復(fù)制和表達(dá)的工具。載體必須具備的條件：2、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；

3、對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害

問(wèn)題：霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它來(lái)做分子運(yùn)輸車(chē)嗎？問(wèn)題：目的基因有沒(méi)有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

4、有某些標(biāo)記基因，便于篩選；5、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，大小適中三、基因的載體——“分子運(yùn)輸車(chē)”1、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便27能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制是切割和插入位點(diǎn)有標(biāo)記基因（1）質(zhì)?！羌?xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子，大小只有普通細(xì)菌擬核DNA的百分之一。實(shí)際操作的質(zhì)粒一般都是人工改造過(guò)的能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制是切割和插入位點(diǎn)有標(biāo)記基28DNA重組技術(shù)的基本工具課件29能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立的復(fù)制而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立的復(fù)制而實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增30將自己插入到宿主細(xì)胞染色體中來(lái)進(jìn)行復(fù)制將自己插入到宿主細(xì)胞染色體中來(lái)進(jìn)行復(fù)制31（2）噬菌體的基本特征

——一類(lèi)能夠特異性侵染細(xì)菌的病毒，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。（2）噬菌體的基本特征

——一類(lèi)能夠特異性侵染細(xì)菌的病毒，結(jié)32DNA重組技術(shù)的基本工具課件33專(zhuān)題11.1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程專(zhuān)題11.1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程34專(zhuān)題11.1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程專(zhuān)題11.1DNA重組技術(shù)的基本工具基因工程DNA重組技術(shù)的基本工具課件對(duì)基因工程的概念的理解別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程實(shí)質(zhì)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平獲得人類(lèi)需要的基因產(chǎn)物剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組對(duì)基因工程的概念的理解別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過(guò)程實(shí)基因工程的理論依據(jù)1.DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)，——部分病毒的遺傳物質(zhì)是RNA，其他生物的遺傳物質(zhì)是DNA都由4種脫氧核苷酸聚合而組成DNA具有雙螺旋結(jié)構(gòu)不同生物的DNA基本單位和結(jié)構(gòu)相同基因工程的理論依據(jù)1.DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)，—38脫氧核糖磷酸含氮堿基脫氧核苷酸堿基對(duì)氫鍵磷酸二酯鍵基本骨架DNA的基本結(jié)構(gòu)脫氧核糖磷酸含氮堿基脫氧核苷酸堿基對(duì)氫鍵磷酸二酯鍵基本骨架D392.中心法則：DNARNA蛋白質(zhì)（性狀）復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制在絕大多數(shù)生物中，親代DNA通過(guò)復(fù)制而將遺傳信息傳遞給子代；DNA通過(guò)控制蛋白質(zhì)合成而控制個(gè)體性狀表達(dá)基因工程的理論依據(jù)2.中心法則：DNARNA蛋白質(zhì)（性狀）復(fù)制轉(zhuǎn)錄翻譯逆403.基因是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位基因是指有遺傳效應(yīng)的DNA片段一個(gè)DNA分子上有多個(gè)基因基因工程的理論依據(jù)4.各種生物共用一套遺傳密碼——相同的DNA堿基序列,在不同生物細(xì)胞中翻譯出相同的蛋白質(zhì)，表達(dá)為相同的性狀;3.基因是遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的基本單位基因是指有遺傳效應(yīng)的41科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論達(dá)42科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論孟德?tīng)柼岢龌虻姆蛛x定律和自由組合定律科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論孟43科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律?？萍继剿髦罚夯A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論摩44科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論艾45科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型?？萍继剿髦罚夯A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論46科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論梅塞爾松、斯塔爾證明DNA的半保留復(fù)制科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論梅47科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論克48科技探索之路：基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明?？萍继剿髦罚夯A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程早期基礎(chǔ)理論149“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶一.主要來(lái)源：—原核生物中分離純化出來(lái)的一類(lèi)酶1、限制酶主要存在原核生物，它有什么意義？限制酶在原核生物中主要是切割外源DNA，使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自己的目的。“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶一.主要來(lái)源：—50二.功能：——識(shí)別特定的核苷酸序列，在特定的部位斷裂磷酸二酯鍵。（1）識(shí)別序列：限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對(duì)稱(chēng)、重復(fù)排列的。二.功能：——識(shí)別特定的核苷酸序列，在特定的部位斷裂磷酸二酯51（2）切割部位：磷酸二酯鍵（2）切割部位：磷酸二酯鍵52

EcoRⅠ黏性末端黏性末端三.作用結(jié)果形成粘性末端或平末端EcoRⅠ黏性末端黏性末端三.作用結(jié)果形成粘性末端532、為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。2、為什么細(xì)菌中限制酶不剪切細(xì)菌本原核生物中不存在該酶54現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出與約4000種限制性?xún)?nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia

marcesens）大腸桿菌（Escherichia

coli

R）練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出與約4000種限55生物A基因片段生物B基因片段EcoRⅠEcoRⅠDNA連接酶生物A基因片段生物B基因片段EcoRⅠEcoRⅠDNA連接酶56（二）“分子縫合針”DNA連接酶1.作用：將雙鏈DNA片段之間的磷酸二酯鍵連接起來(lái)2.種類(lèi)：⑴E·coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶（二）“分子縫合針”DNA連接酶1.作用：將雙鏈DNA片段57

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低類(lèi)型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)來(lái)源功能相同點(diǎn)差別T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效58DNA重組技術(shù)的基本工具課件59比較：DNA連接酶與DNA聚合酶DNA聚合酶DNA連接酶作用底物模板相同點(diǎn)1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板比較：DNA連接酶與DNA聚合酶DNA聚合酶DNA連接酶相同60