BS3交聯(lián)分析β淀粉樣蛋白的寡聚結(jié)構(gòu)

BS3交聯(lián)分析p淀粉樣蛋白的寡聚結(jié)構(gòu)石鏡明;賀學(xué);廉會(huì)娟;吳濤;武美娜;孫正啟【摘要】使用交聯(lián)劑雙琥珀酰亞胺辛二酸酯磺酸鈉鹽(Bis(sulfosuccinimidyl),BS3)對(duì)A&1-42進(jìn)行交聯(lián)，通過(guò)與之前報(bào)道的戊二醛交聯(lián)進(jìn)行比較分析，可以看出BS3更適合分析蛋白的寡聚狀態(tài),這將為AP蛋白及類似的易聚集蛋白在體內(nèi)、夕卜研究提供很好的參考.％Anagentnamedbis(sulfosuccinimidyl)(BS3)isusedtocross-linkA&1-42.ComparedwithglutaraldehydewhichwaspreviouslyreportedasanA&cross-linkingagent,itisnotdifficulttofindthatBS3ismoresuitablefortheanalysisofproteininextra-membraneA&oligomersstates,whichwillprovideagoodexperimentalmethodtoanalyzeA&proteinandsimilareasyaggregationproteininvivoandvitrostudies.【期刊名稱】《西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》【年(卷)，期】2017(047)002【總頁(yè)數(shù)】5頁(yè)(P222-226)【關(guān)鍵詞】雙琥珀酰亞胺辛二酸酯磺酸鈉鹽(BS3);B淀粉樣蛋白;寡聚體【作者】石鏡明;賀學(xué);廉會(huì)娟;吳濤;武美娜;孫正啟【作者單位】西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院/高原環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽(yáng)712082;西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院/高原環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽(yáng)712082;西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院/高原環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽(yáng)712082;西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院/高原環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽(yáng)712082；西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院/高原環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽(yáng)712082;西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院/高原環(huán)境與疾病相關(guān)基因研究實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽(yáng)712082【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類】Q518.4AD是老年性癡呆癥中常見的型式，目前全世界大約2420萬(wàn)AD患者,預(yù)計(jì)每20年將翻一番，中國(guó)照料癡呆的直接花費(fèi)大約為每年28億美元［1-2］。人們普遍認(rèn)為AP是AD的致病主因［3］。AD腦脊液中的AP、總tau蛋白含量及磷酸化的tau蛋白(即A&1-42,T-tau蛋白和p-tau蛋白)含量，被用作生物標(biāo)識(shí)物(Biomarkers)加以檢測(cè)，這些指標(biāo)已經(jīng)成為防治AD不可缺少的一部分［4-5］。A&1-42是p淀粉樣前體蛋白(Amyloidprecursorprotein,APP)經(jīng)過(guò)B和Y分泌酶水解產(chǎn)生的，產(chǎn)生后訊速形成可溶性的寡聚體，這些寡聚體在AD病理起始階段中發(fā)揮著關(guān)鍵的毒性作用［6-7］°Ap1-42寡聚體并不是單一的幾聚體而是由很多種寡聚組成，例如,3聚體,4聚體,56聚體,高聚的原纖維(Protofibrils)等［6-8］,即便是電鏡上觀察非常均一的ADDL(Ap-deriveddiffusibleligands)也是由從2聚體至24聚體不等的幾十種混合物組成的彳艮難確定究竟是幾聚體在發(fā)揮毒性作用。在毒性機(jī)制基礎(chǔ)研究中,電泳分析是經(jīng)常用到的檢測(cè)方式之一。AP1-42很容易受到變性劑SDS破壞,還會(huì)受到丙烯酰胺膠孔道的擠壓,Ap單體和寡聚體條帶常常僅以單體、3聚和4聚3種形式出現(xiàn)，而不能顯示出其本身的聚集形式。這需要使用天然膠或者交聯(lián)劑,不被SDS等去垢劑破壞，研究者使用戊二醛交聯(lián)或光交聯(lián)［9-11］來(lái)達(dá)到分析目的。BS3作為一種易溶于水的化合物在蛋白及抗體的交聯(lián)過(guò)程中曾有過(guò)報(bào)道［12-13］,本文將詳細(xì)報(bào)道BS3對(duì)于AP1-42/40的交聯(lián)，區(qū)分蛋白的單體和各種寡聚體形式，為AD病理機(jī)制的分析提供很好的幫助。1.1材料表達(dá)的AP1-42肽購(gòu)自rpeptide公司(Athens,GA,美國(guó))，交聯(lián)劑BS3購(gòu)自Sigma.鼠源單克隆抗體DE2,ECL顯色劑均購(gòu)自Millipore(Millipore,MA),1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol(HFIP)、二甲基亞砜DMS。均購(gòu)自Sigma,F-12培養(yǎng)基(Ham'sF-12,BioSource,澳大利亞),透射電子顯微鏡型號(hào)TecnaiG20(FEI)。1.2方法AP1-42單體化處理1mgA&瓶中加入222ulHFIP,在旋渦振蕩5min,4°C慢搖過(guò)夜，按8.6"/管分裝,N2流吹干,-80C下凍存?zhèn)溆茫?4］。ADDL寡聚體和原纖維寡聚體的制備ADDL的制備條件,A&1-42加入F12培養(yǎng)基中使得終濃度為100pmol/L,在4C孵育24h［15］。原纖維的制備條件,A&1-42加入至1」Tris緩沖液(50mmol/LTris,100mmol/LNaCl,PH=7.4)濃度為200pmol/L,室溫下慢搖孵育24h［16］。1.2.3交聯(lián)及電泳條件將AP1-42加入PBS緩沖液中,加入0.3mmol/LBS3,冰浴交聯(lián)2min,加入1mol/LTris,PH7.4的終止液終止，電泳時(shí)加入5x上樣緩沖液,90C煮5min上樣。戊二醛交聯(lián)，使用0.3mmol/L或其他濃度的戊二醛，交聯(lián)1min,加入1mol/LTris,PH7.4的終止液終止，加入5x上樣緩沖液,90C煮5min上樣。銀染分析選用4%濃縮膠和16.5%Tris-Tricine分離膠,所有的WestBlot實(shí)驗(yàn)中，采用4%~16.5%的梯度膠進(jìn)行。1.2.4電鏡樣品制備用AP42溶液2pL加到放電/親水化處理的碳膜上，孵育1min后，用超純水清洗,然后用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))磷鎢酸鈉負(fù)染1min。吸去多余液體，將篩格在空氣中干燥備用。辛二酸二琥珀酰亞胺(Disuccinimidylsuberate,DSS)是一種不溶于水的N-羥基的琥珀酰亞胺酯(NHS-ester),如圖1A所示。雙琥珀酰亞胺辛二酸酯磺酸鈉鹽(Bis(sulfosuccinimidyl),BS3)是DSS水溶性的形式，當(dāng)BS3溶解后，就會(huì)訊速脫去含N部分，從而在分子的兩頭與蛋白N-端的a-氨基酸或者賴氨酸發(fā)生反應(yīng),AP1-42具有Lysine-18和Lysine-28兩個(gè)賴氨基酸與BS3產(chǎn)生交聯(lián),反應(yīng)可以通過(guò)1mol/LTris，HCl或者1mol/LGlycine溶液來(lái)終止。本文采用易溶于水的BS3交聯(lián)AP1-42蛋白，并使用1mol/LTris,HCl來(lái)終止交聯(lián)反應(yīng)。BS3對(duì)AR單體的交聯(lián)控制先前的AR交聯(lián)報(bào)道中，對(duì)AR1-40與膜作用進(jìn)行了說(shuō)明［10-11,16］。本文采用0.3mmol/L,0.6mmol/L,1.2mmol/L3個(gè)濃度梯度，并采用不同的交聯(lián)時(shí)間,在冰浴條件下對(duì)AR42/40單體進(jìn)行交聯(lián)比較，并通過(guò)同樣濃度的BS3對(duì)AR1-42/40單體進(jìn)行交聯(lián)，通過(guò)對(duì)交聯(lián)劑濃度、交聯(lián)時(shí)間的控制，結(jié)果如圖2所示，可以看出,戊二醛即使在最低濃度（0.3mmol/L）下,采用很短的交聯(lián)時(shí)間（1min）,不管是AR1-40還是AR1-42均會(huì)被交聯(lián)成寡聚體;而使用BS3交聯(lián)1min,兩種蛋白單體不會(huì)導(dǎo)致寡聚體形成，時(shí)間延長(zhǎng)至5min,單體也會(huì)發(fā)生寡聚變化。這說(shuō)明使用BS3作為交聯(lián)劑只要控制交聯(lián)時(shí)間在5min以內(nèi)就不會(huì)導(dǎo)致單體的交聯(lián)發(fā)生。從圖2還可以看出1.2mmol/L濃度交聯(lián)更弱。BS3較戊二醛更適用于AR的交聯(lián)ADDL與原纖維是最常見的兩種AR1-42聚集形式［16］,通過(guò)16.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的Tris-tricine膠分析AR1-42的單體、ADDL及原纖維3種形式。在不交聯(lián)的情況下，沒有明顯的差別（圖3不交聯(lián)的兩圖）。使用0.3mmol/L戊二醛交聯(lián)AR1-42單體、ADDL及原纖維3種形式，即使只有30s也很容易出現(xiàn)整體過(guò)度交聯(lián)，從而導(dǎo)致AR1-42的3種形式并沒有差異（圖30.3mmol/L戊二醛交聯(lián)所示）。使用0.3mmol/L蛋白濃度的BS3交聯(lián)10min,3種蛋白條帶之間存在較大差別岸體交聯(lián)后,出現(xiàn)少量3聚和4聚形式,ADDL除3聚和4聚外還出現(xiàn)其他5聚體和更高的寡聚形式，原纖維經(jīng)過(guò)交聯(lián)后,4聚和3聚減少,但是明顯有其他形式的聚集體存在，還可能存在高聚未進(jìn)入分離膠內(nèi)，結(jié)果如圖3所示,0.25mmol/LBS3交聯(lián)所示。BS3能區(qū)分單體和寡聚體狀態(tài)的AP1-42，且3種蛋白在條帶上存在明顯的差異性，單體交聯(lián)后以單體、3聚、4聚3種形式出現(xiàn)，與未交聯(lián)的ADDL相比,ADDL的四聚體增多而原纖維形式的Api-42,4聚體沒有增多，卻出現(xiàn)較大的寡聚形式,停留在分離膠入口處。戊二醛很容易導(dǎo)致A&1-42"過(guò)度”交聯(lián)從而難以比較Api-423種形式的差別。2.3電鏡分析戊二醛、BS3對(duì)Api-42的交聯(lián)情況使用透射電鏡(TEM)觀察AP1-42的單體、ADDL及原纖維三種形式的交聯(lián)情況如圖4,分別是未交聯(lián)、0.3mmol/L戊二醛及BS3交聯(lián)過(guò)的A&1-42樣品,A&1-42單體直徑僅為1nm,電鏡很難觀察到，但戊二醛交聯(lián)后的AP1-42出現(xiàn)寡聚。由圖4可以看出,BS3交聯(lián)以后，蛋白有明顯的聚集，而戊二醛的交聯(lián)明顯要嚴(yán)重，即BS3對(duì)AP1-42的交聯(lián)很〃溫和”，與上述電泳結(jié)果相符合。綜合以上電泳和電鏡結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)BS3對(duì)AP1-42的電泳電鏡分析均能起到固定狀態(tài)的效果，其作用主要有以下幾個(gè)方面:①BS3適度交聯(lián),可以在Tris-Tricine電泳中識(shí)別出AP1-42單體、ADDL及原纖維等形態(tài);②相對(duì)于戊二醛的交聯(lián),BS3顯得更合適,不會(huì)導(dǎo)致過(guò)度交聯(lián)寡聚物的產(chǎn)生;③BS3交聯(lián)后使用電泳分析,可以得到與電鏡相支持的結(jié)果?？扇苄訟P寡聚體在AD的病源學(xué)過(guò)程中起著很重要的作用。2003年JBC曾專門報(bào)道如何控制AR蛋白的單體和寡聚體狀態(tài)[14],這成為AP1-42單體處理的標(biāo)準(zhǔn)方法。人們還對(duì)除AR以外的一些易聚集蛋白進(jìn)行寡聚檢測(cè)加a-突觸核蛋白,IAPP等[11,17],以顯示它們可能存在共同的毒性機(jī)制。本文選用最常用的兩種常見寡聚體ADDL和protofibril進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。戊二醛作為交聯(lián)劑曾被報(bào)道，然而在AR狀態(tài)分析的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)戊二醛容易過(guò)度交聯(lián)，即使很低的交聯(lián)劑濃度和很短的交聯(lián)時(shí)間,單體狀態(tài)的蛋白也會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重聚集，這就不能達(dá)到分析AR狀態(tài)的目的,BS3對(duì)蛋白的交聯(lián)相對(duì)〃溫和”，不容易對(duì)AR1-42單體產(chǎn)生過(guò)度交聯(lián)，結(jié)果如圖2,3所示。BS3提高到1.2mmol/L,結(jié)果卻并沒有0.3mmol/L濃度明顯這是因?yàn)?.2mmol/L交聯(lián)劑加入后，形成大的聚集體可能并未進(jìn)入膠內(nèi)，此外在染色過(guò)程中，整塊丙烯酰胺膠處在培養(yǎng)皿中作旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，中間部分具有一定的銀染優(yōu)勢(shì).而邊沿條帶染料容易被洗脫?？傊贏P1-42等易聚蛋白狀態(tài)檢測(cè)過(guò)程中，使用BS3交聯(lián)可以顯示出蛋白條帶的特異性從而達(dá)到區(qū)分AP不同聚集形式的目的，在AP與AD的毒性機(jī)制研究中，使用BS3交聯(lián)的手段可以起到很好的幫助作用。【相關(guān)文獻(xiàn)】REITZC,BRAYNEC,MAYEUXR.EpidemiologyofAlzheimerdisease[J].NatRevNeurol2011,7(3):137-152.FEIGHINVL,FOROUZANFARMH,KRISHNAMURTHIR,etal.Globalandregionalburdenofstrokeduring1990-2010:FindingsfromtheGlobalBurdenofDiseaseStudy2010[J].Lancet,2014,383(9913):245-254.TARASOFF-CONWAYJM,CARARERO,OSORIORS,etal.Clearancesystemsinthebrain-implicationsforAlzheimerdisease[J].NatRevNeurol,2015,11(8):457-470.BRKICM,BALUSUS,VANWONTERGHEME,etal.Amyloidbetaoligomersdisruptblood-CSFbarrierintegritybyactivatingmatrixmetalloproteinases[J].JNeurosci,2015,35(37):12766-12778.FORTEAJ,VILAPLANAE,ALCOLEAD,etal.Cerebrospinalfluidbeta-amyloidandphospho-taubiomarkerinteractionsaffectingbrainstructureinpreclinicalAlzheimerdisease[J].AnnNeurol,2014,76(2):223-230.BENILOVAI,KARRANE,DESTROOPEB.ThetoxicAbetaoligomerandAlzheimer'sdisease:Anemperorinneedofclothes[J].NatNeurosci,2012,15(3).349-357.KLEINWL.Synaptotoxicamyloid-betaoligomers:amolecularbasisforthecause,diagnosis,andtreatmentofAlzheimer'sdisease?[J].JAlzheimersDis,2013,33(1):49-65.JANAMK,CAPPAIR,PHAMCL,etal.MembraneboundtetramerandtrimerAbetaoligomericspeciescorrelatewithtoxicitytowardsculturedneurons[J].JNeurochem,2015.LEVINEH.3rd.SolublemultimericAlzheimerbeta(1-40)pre-amyloidcomplexesindilutesolution[J].NeurobiolAging,1995,16(5):755-764.BITANG,KIRKITADZEMD,LOMAKINA,etal.Amyloidbeta-protein(Abeta)assembly:Abeta40andAbeta42oligomerizethroughdistinctpathways[J].ProcNatlAcadSciUSA2003，100(1):330-335.QUISTA,DOUDEVSKII,LINH,etal.Amyloidionchannels:Acommonstructurallinkforprotein-misfoldingdisease[J].ProcNatlAcadSciUSA，2005，102(30):10427-10432.SCHMIDTC,ROBINSONCV.Acomparativecross-linkingstrategytoprobeconformationalchangesinproteincomplexes[J].NatProtoc，2014，9(9):2224-2236.IVANOVKI,BASICM,VARJOSALOM,etal.One-steppurificationoftwin-strep-taggedproteinsandtheircomplexesonstrep-tactinresincross-linkedwithbis(sulfosuccinimidyl)suberate(BS3)[J].JVisExp，2014，(86):183-197.STINEWB,Jr.InVitroCharacterizationofConditionsforAmyloid-Peptideoligomerizationandfibrillogenesis[J].JBiolChem，2003.LAMBERTMP,BARLOWAK,CHROMYBA,etal.Diffusible,nonfibrillarligandsderivedfromAbeta1-42arepotentcentralne