微生物制片顯微觀察及檢測技術課件

微生物制片、顯微觀察

及檢測技術顯微操作顯微鏡是微生物檢驗中最常用的精密光學儀器。顯微鏡的種類很多，在實驗室中常用的有：普通光學顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。食品微生物檢驗中最常用的是普通光學顯微鏡。低倍鏡操作方法1.兩眼從側面注視低倍物鏡對準通光孔，使用粗調(diào)焦螺旋將鏡筒自上而下的調(diào)節(jié)，避免物鏡鏡頭接觸到玻片而損壞鏡頭和壓破玻片。當物鏡鏡頭與載物臺的玻片相距2～3mm時停止；2.左眼注視（注意右眼應該同時睜著），并轉動粗調(diào)焦螺旋，使鏡筒徐徐上升，直到看清物象為止；3.再用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。

注意：粗調(diào)調(diào)焦螺旋只用于上調(diào)載物臺，如觀察顯微鏡時，用粗調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)，有壓碎載玻片、損壞物鏡的危險。因此，用細調(diào)焦螺旋調(diào)節(jié)視野使其更清晰高倍鏡操作方法1.將低倍鏡觀察到的目標移動至視野中央；2.將低倍鏡鏡頭轉換成高倍鏡鏡頭。換用高倍鏡后，視野內(nèi)亮度變暗，因此一般選用較大的光圈并使用反光鏡的凹面；3.用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。觀看的物體數(shù)目變少，但是體積變大。

注意：高倍鏡觀察時，光線需增強。油鏡操作方法1.將高倍鏡觀察到的目標移動至視野中央；2.將高倍鏡鏡頭挪開，于載玻片上滴一滴香柏油；3.將油鏡鏡頭移動至視野，讓油鏡鏡頭浸入香柏油（至油暈不再擴大為止）；4.用微調(diào)焦螺旋調(diào)至清晰。

注意：油鏡的操作需要較強的關線，故需將光線調(diào)至最強。

用10倍和/或40倍物鏡為隨后的高倍油鏡（90倍或100倍）選擇合適的視野（油鏡鏡筒上通?？逃蠬.I.OIL或OEL等標志）油鏡用后的處理：第一遍：用擦鏡紙拭去鏡頭上的油；第二遍：用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去頭上殘留的油跡；第三遍：再用干凈的擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。染色方法(一)簡單染色法

簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細菌染上顏色，觀察細菌的形態(tài)。實驗材料1.顯微鏡、香柏油、二甲苯、擦鏡紙、吸水紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、蠟筆等。2.草酸銨結晶紫染液、碘液、95％乙醇、蕃紅染液、石炭酸復紅染液3.菌株：大腸桿菌，金黃色葡萄球菌3．固定手持載玻片的一端，標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過2~3次，共約2~3秒鐘，并不時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過60℃）,放置待冷后，進行染色。4．染色在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸復紅、草酸銨結晶紫或美藍任選一種)一滴，使染色液覆蓋涂片，染色約1min。5．水洗斜置載玻片，在自來水龍頭下用小股水流沖洗，直至洗下的水呈無色為止。6．干燥用吸水紙吸去涂片邊緣的水珠，置于室溫下自然干燥。用吸水紙時切勿將菌體擦掉。

7．鏡檢(二)細菌的革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復染→水洗→干燥→觀察1．取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同。2．用草酸銨結晶紫染色1min后水洗。3．加碘液媒染1min后水洗。4．斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20~30s，隨即水洗。5．用蕃紅染液復染1min，水洗。6．用吸水紙吸掉水滴，待標本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。革蘭氏染色圖解革蘭氏染色試劑

步驟1：用蒸餾水滴瓶滴一小滴蒸餾水于潔凈的載玻片上

步驟3：用接種環(huán)將培養(yǎng)物涂布成一薄層

步驟4：風干

步驟6：結晶紫染色1分鐘

步驟7：用蒸餾輕輕沖洗玻片

步驟9：酒精脫色至下滴液為無色，立即用蒸餾水沖洗

步驟10：番紅復染1分鐘，用蒸餾水輕輕沖洗

大腸桿菌（Escherichiacoli）革蘭氏染色圖

革蘭氏染色陰性桿菌（紅色）

注意事項1．革蘭氏染色成敗的關鍵是脫色時間，如脫色過度，革蘭氏陽性菌也可被脫色而被誤認為革蘭氏陰性菌；如脫色時間過短，革蘭氏陰性菌也會被誤認為是革蘭氏陽性菌。因此必須嚴格把握脫色時間。2．選用培養(yǎng)18-24小時菌齡的細菌為宜，若細菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭氏陽性菌轉呈陰性反應。3.干凈的玻片、熱固定、每一步水洗要徹底并且吸干等也是實驗成功的關鍵。微生物檢測技術介紹檢測技術的重要性革蘭氏染色鏡鑒按照標準進行傳統(tǒng)的生化反應鑒定API試劑條菌鑒定國際金標準

半自動細菌鑒定儀（ATBExpression）

全自動細菌鑒定儀（VITEK2）微生物鑒定MiniVIDAS篩選系統(tǒng)免疫凝集/免疫沉淀實驗微生物檢測實時熒光定量PCR色譜、光譜分析技術分子生物學技術一、微生物檢驗技術介紹傳統(tǒng)篩選系統(tǒng)微生物的檢測技術c)酶聯(lián)免疫熒光技術d)實時熒光定量PCRe)免疫磁珠技術b)乳膠凝集反應a)常規(guī)培養(yǎng)鑒定法—顯色培養(yǎng)基法

顯色培養(yǎng)基

顯色培養(yǎng)基檢測基本原理：利用不同種屬細菌代謝所產(chǎn)生的酶的特異性，在培養(yǎng)基中加入相應的特異性酶底物和抑制劑，當具有某特異酶的細菌與酶底物作用時，使顯色基團游離出來附著于菌落上，形成顏色獨特的菌落。根據(jù)菌落的顏色直接對菌屬（種）作出鑒定。

GB4789-2008、2010

中新技術的應用-顯色培養(yǎng)基

沙門氏菌志賀菌副溶血性弧菌O157：H7大腸埃希菌單增李斯特菌阪崎腸桿菌大腸桿菌計數(shù)顯色培養(yǎng)基的優(yōu)勢快速、簡便、節(jié)省時間-大多數(shù)顯色培養(yǎng)基只需在樣品增菌后，分離培養(yǎng)18~24h，即可根據(jù)菌落的顏色作出初步的鑒定。（陰性-棄去；陽性-進一步鑒定）。結果直觀，一目了然（根據(jù)顏色判定結果）。靈敏度高、特異性強，大大減少了后續(xù)的鑒定步驟（確證試驗）。顯色培養(yǎng)的缺陷假陽性：97%的大腸埃希菌含有β-葡萄糖苷酶，約10%的沙門氏菌屬中也含有此酶。假陰性：O157：H7大腸埃希菌沒有β-葡萄糖苷酶，在MUG-LST上呈陰性反應。不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培養(yǎng)基中呈陽性反應。提示：這是任何選擇性培養(yǎng)基都無法避免的問題。與普通選擇性培養(yǎng)基比較，顯色培養(yǎng)基的假陽性、假陰性的機率相對要低得多。

乳膠凝集反應

原理：乳膠凝劑試驗是以乳膠微粒為載體的間接凝集試驗。用人工方法將抗體包被于與免疫無關的大分子聚苯乙烯或羧化聚苯乙烯乳膠顆粒上。利用抗原抗體特異性結合的特性，當敏感的乳膠顆粒與待檢細菌菌懸液混合后，迅速形成肉眼可見的凝集團塊，用于篩選可疑菌。

常用Microgen乳膠凝集試驗盒

李斯特菌（listeria）沙門氏菌（salmonella）彎曲桿菌（camylobacter）大腸桿菌O157（E.coliO157）軍團菌（legionella）葡萄球菌（staph）

觀察凝集結果全自動熒光免疫分析儀(VIDAS-mini或30)

檢測項目：食品及環(huán)境中常見致病性細菌（李斯特菌屬、單核增生李斯特菌、彎曲菌屬、大腸埃希菌O157、沙門氏菌屬、葡萄球菌腸毒素檢測）的快速篩檢全自動熒光免疫分析儀(VIDAS)

原理：

以免疫技術捕獲目標微生物，應用酶聯(lián)免疫法，最后測藍色熒光（ELFA）。包被針上有抗體包被，所測得的熒光與標本中抗原的含量成正比。特點：結果準確：對每個標本做兩次免疫反應，保證結果的可靠。靈敏度比可見光方法高出1000倍。已獲得美國FDA、日本厚生省、AOAC、USDA、中國進出口商品檢驗局等政府及權威機構認可?？赏瑫r進行12個相同或不同的測試。每天進行約60—80項測試特異性強：標本不需分離出目標微生物即可上機檢測。避免交叉污染：沒有采樣針，避免標本之間交叉污染；樣品不與儀器接觸，儀器內(nèi)沒有抽吸樣品的管路，杜絕了標本對環(huán)境的污染熒光定量PCR聚合酶鏈式反應技術（PCR）是分子生物學技術最具有代表性的技術。它是一種能在體外將微量生物DNA分子進行數(shù)百萬倍放大的新型檢測技術。熒光定量PCR技術在普通PCR技術基礎上，通過熒光染料的結合，將檢測信號進一步放大，其靈敏度是普通PCR的幾百倍，擴增和檢測過程由儀器自動完成，檢測同量高，速度快除去樣品前增菌時間，2-4小時內(nèi)可得到檢測結果微生物檢測限可能達到1copy，抗雜菌干擾能力強

免疫磁珠技術由于受到抽樣數(shù)量、檢驗方法和試驗取樣量的限制，無法將全部樣品進行檢查。磁珠分離技術，能簡單快速地捕捉特異的蛋白、遺傳物質和其他生物分子。通過免疫磁珠富集手段，將微量的目標物質通過磁珠富集到可檢測的水平。這一技術不僅可應用于致病微生物的檢測，還可用于食品中致敏原蛋白質、核酸以及各類細菌毒素的富集，應用范圍廣闊，適宜高通量、全自動操作。Principle:ImmunomagneticMicroparticleSeparation/ConcentrationofBacterialCellsNBioLumixTM微生物實時快速檢測系統(tǒng)是最新推出的用于食品、保健品、乳制品、肉制品、飲料、化妝品、洗化產(chǎn)品和制藥等工業(yè)領域和監(jiān)管部門等使用的微生物快速檢測系統(tǒng)。可以快速確定樣本中細菌總數(shù)、大腸菌群/大腸桿菌、致病菌、霉菌等的存在與數(shù)量。BioLumixTM實時快檢系統(tǒng)----簡便、快速并可降低微生物試驗的操作成本。-裝有增菌培養(yǎng)基和指示劑的檢測管。-數(shù)小時內(nèi)得到檢測結果（而非數(shù)天）-結果易解釋并自動傳輸?shù)叫枰焖侔l(fā)運安全產(chǎn)品的地方。-非微生物專業(yè)技術人員也能夠操作?？蓹z測的項目:大腸菌群大腸桿菌腸桿菌科革蘭氏陰性菌乳酸菌酵母菌和霉菌假單胞菌蠟樣芽胞桿菌葡萄球菌沙門氏菌衛(wèi)生監(jiān)控保質期預測腐敗菌檢測無菌檢驗挑戰(zhàn)實驗微生物限定檢測嗜熱菌計數(shù)嗜冷菌計數(shù)抗生素殘留檢測生物體可以在BioLumix儀器中進行孵育，孵育溫度可以在15°C到60°C的范圍內(nèi)預先設定，以使各種菌株都能獲得最佳的生長條件。

檢測原理BioLumixTM專利的完整檢測的基礎是：使用新開發(fā)的染色技術檢測生物體的代謝過程。這一技術通過將染色、新的光源和光傳感器相結合，能夠用同一個檢測器同步檢測顏色和熒光的變化。當代謝過程發(fā)生時，試劑的光譜模式會發(fā)生改變。光傳感器可檢測到這些改變，并以預先設定的時間間隔進行監(jiān)控。BioLumixTM的靈敏度和檢測范圍

靈敏度為每個樣本管內(nèi)一個細菌或真菌的活細胞。一個細菌通常可在8-14個小時內(nèi)檢出一個酵母菌可在20-24個小時內(nèi)檢出；菌數(shù)越多，檢測時間越短盡管系統(tǒng)可以檢出少至每管一個細胞，但是生物體必須首先要增長到超過預