最新基因工程5課件

基因工程5基因工程51大腸桿菌表達體系克隆基因正確表達的基本條件克隆基因表達活性的檢測大腸桿菌表達體系2最新基因工程5課件3最新基因工程5課件4最新基因工程5課件5最新基因工程5課件6最新基因工程5課件7最新基因工程5課件8真核基因在大腸桿菌中的表達真核基因在大腸桿菌中的表達9克隆基因表達活性的檢測

1.微細(xì)胞檢測法；2.巨細(xì)胞檢測法；3.偶聯(lián)反應(yīng)測定法?？寺』虮磉_活性的檢測10微細(xì)胞檢測法：這是一種適于檢測質(zhì)?；虮磉_的體內(nèi)檢測法。微細(xì)胞：指由某些細(xì)菌突變體菌株在其生長期間連續(xù)產(chǎn)生的一類微小的圓形的無核細(xì)胞。微細(xì)胞檢測法：11通過蔗糖梯度離心將微細(xì)胞與正常細(xì)胞分開，含有質(zhì)粒載體的微細(xì)胞是適于檢測重組子質(zhì)粒所攜帶的外源基因表達狀況的理想體系。通過蔗糖梯度離心將微細(xì)胞與正常細(xì)胞分開，含有質(zhì)粒載體12Example:

ColE1的衍生質(zhì)粒（缺失了106dal）,在微細(xì)胞中不能合成出56103dal、42103dal、30103dal、28103dal四種多肽。其中3種多肽是大腸桿菌E1的降解產(chǎn)物。當(dāng)一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片斷插入到卡那霉素基因內(nèi)部時，便能在微細(xì)胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2種其它的多肽分子。Example:13巨細(xì)胞檢測法1.經(jīng)紫外線照射的大腸桿菌recAuvrA細(xì)胞，DNA停止合成，而質(zhì)粒載體則可以繼續(xù)合成，在紫外線照射后6小時，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA的數(shù)量增加了10倍左右，在紫外線照射后的幾個小時內(nèi)，加入經(jīng)放射性標(biāo)記的氨基酸，此時合成的蛋白質(zhì)絕大部分是質(zhì)?；蛩幋a的。巨細(xì)胞檢測法142.將含有外源基因的λ噬菌體重組子，感染到事先經(jīng)過紫外線嚴(yán)格照射的大腸桿菌細(xì)胞上。由于細(xì)胞經(jīng)紫外線照射使DNA受到了損傷，自身基因的表達受到了嚴(yán)重的抑制。通過同λ噬菌體載體編碼的蛋白質(zhì)種類作比較，就可以鑒定出克隆基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。2.將含有外源基因的λ噬菌體重組子，感染到15偶聯(lián)反應(yīng)測定法使DNA模板在細(xì)菌無細(xì)胞體系中，進行轉(zhuǎn)錄－轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)過改良的這種體系中，可以使克隆在細(xì)菌質(zhì)粒或噬菌體基因組上的外源片斷進行體外表達，就可以比較容易的確定多肽片斷是由編碼模板上的哪個小片段指導(dǎo)合成的。

偶聯(lián)反應(yīng)測定法16優(yōu)點：1.放射性標(biāo)記參入到蛋白質(zhì)的效率，比體內(nèi)標(biāo)記法高的多，而且這個系統(tǒng)十分敏感。經(jīng)35S標(biāo)記的多肽分子，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影若干小時后可被迅速檢出；2.應(yīng)用這個體系，其它原核生物的基因也能夠得到有效的表達。優(yōu)點：17大腸桿菌表達載體大腸桿菌表達載體18核糖體結(jié)合位點啟動子轉(zhuǎn)錄終止子復(fù)制起點核糖體結(jié)合位點啟動子轉(zhuǎn)錄終止子復(fù)制19組成部分

1.啟動子：最佳啟動子具備的條件第一必須是將啟動子，能夠克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上第二這個啟動子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，因為在表達毒性蛋白質(zhì)或是有損于寄主細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的情況下，使用高度抑制型的啟動子是一種極為重要的條件

組成部分20第三這種啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)。（IPTG）第三這種啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘212.轉(zhuǎn)錄終止子啟動子封堵作用：由一個上游啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄作用，當(dāng)其通讀過下游啟動子時，便會使該啟動子的功能受到抑制，將這種由一個啟動子的功能活性抑制另一個啟動子轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象，叫做啟動子封堵作用。轉(zhuǎn)錄終止子還能增強mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。2.轉(zhuǎn)錄終止子223.轉(zhuǎn)譯起始序列5’-末端結(jié)構(gòu)特征，決定mRNA的轉(zhuǎn)譯起始效率。在核糖體結(jié)合位點（RBS）的序列結(jié)構(gòu)中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷殘基含量的比例，誘發(fā)堿基發(fā)生定點突變；或使用轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)系統(tǒng)進行克隆基因表達3.轉(zhuǎn)譯起始序列234.轉(zhuǎn)譯增強子顯著的增加異源基因在大腸桿菌中的表達效率。5.轉(zhuǎn)譯終止子mRNA轉(zhuǎn)譯終止必須存在終止密碼子。大腸桿菌格外偏愛使用終止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉(zhuǎn)譯終止的效率便會得到進一步的增強。4.轉(zhuǎn)譯增強子24功能啟動子的分離：

一般程序：選用一種適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶，消化切割大腸桿菌的染色體DNA，接著將切割產(chǎn)生的DNA限制片斷群體，同一種無啟動子的質(zhì)粒載體重組，按實驗設(shè)計要求使克隆的片斷恰好插入在緊鄰報告基因的上游位置隨后把此重組混合物轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成質(zhì)粒載體基因文庫，并檢測報告基因的表達活性。功能啟動子的分離：25報告基因（reportergene）：特指那些編碼產(chǎn)物可以被快速測定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動子連接，因此其表達活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)。報告基因（reportergene）：特指那些編碼產(chǎn)26利用CAT基因進行功能啟動子的分離和活性測定無啟動子的CAT質(zhì)粒載體EcoliDNA構(gòu)建Ecoli基因文庫細(xì)胞裂解物、14C標(biāo)記得氯霉素乙酰輔酶A薄層層析放射自顯影CAT活性的檢測：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶可以催化氯霉素（2-或3-）發(fā)生乙?；饔谩＠肅AT基因無啟動子的CAT質(zhì)粒載體EcoliDNA構(gòu)建27使用tetr作報告基因分離功能啟動子

1.首先在大腸桿菌質(zhì)粒pBR316（含有一個tet基因、Hind位點）上的tet的啟動子序列中插入一個EcoR1的酶切位點（pBRH3B,pBRH1），使之失活。2.將純化的細(xì)菌染色體DNA片斷，克隆在pBRH3B或pBRH1的EcoR1限制性位點上；轉(zhuǎn)化給對tet敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。使用tetr作報告基因分離功能啟動子28最新基因工程5課件29使用galK（半乳糖激酶基因）作報告基因分離功能啟動子

能夠檢測啟動子活性強弱的新型質(zhì)粒載體系統(tǒng)。來源于pBR322使用galK（半乳糖激酶基因）作報告基因分離功能啟動子30轉(zhuǎn)譯終止密碼子無啟動子的galK轉(zhuǎn)譯終止密碼子無啟動子的galK31原理：半乳糖激酶能夠從ATP分子上轉(zhuǎn)移一個磷酸集團給半乳糖分子，從而催化半乳糖發(fā)生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素標(biāo)記ATP，測定從ATP轉(zhuǎn)移到半乳糖去的32P的放射性強度，可推算報告基因（galK）表達的半乳糖激酶的產(chǎn)量。原理：32最新基因工程5課件33分離功能的啟動子：將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質(zhì)粒載體的MCS區(qū)的單克隆位點上；將體外連接的DNA重組分子，轉(zhuǎn)化給具GalE＋、GalK－的大腸桿菌寄主細(xì)胞，避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾；將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（含有PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶紫，檢測碳水化合物）上，篩選轉(zhuǎn)化子（重組子產(chǎn)生紅色的菌落）。分離功能的啟動子：34pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動子的因素1.選用的報告基因galK的編碼產(chǎn)物半乳糖激酶，是一種易于快速定量檢測的蛋白質(zhì)（鑒定啟動子表達活性的強弱）；2.應(yīng)用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的顯色反應(yīng)特性，篩選能夠利用半乳糖的轉(zhuǎn)化子（分離功能啟動子）。3.采用半乳糖激酶缺陷型的大腸桿菌寄主菌株（GalE+GalT+GalK－）作轉(zhuǎn)化受體；pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動子的因素35常用的大腸桿菌表達載體

1.Lac啟動子的表達載體2.Trp啟動子的表達載體3.PL啟動子的表達載體常用的大腸桿菌表達載體36最新基因工程5課件37理論上，凡是具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的lac操縱子的質(zhì)粒，都基本上具備了用作克隆基因表達載體的條件。這類表達載體的最突出的特點是，含有一條足夠大的編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因片斷。因此，每當(dāng)有一個克隆的外源DNA片斷插入到這個啟動子之后，人保持著lacZ基因固有的讀碼結(jié)構(gòu)時，這個重組質(zhì)粒就會合成出一種由外源克隆基因編碼的多肽和β-半乳糖苷酶組成的融合蛋白質(zhì)。理論上，凡是具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的lac操縱子的381.經(jīng)過Hae切割的203bp的酶切片斷上具有Lac操縱子的控制區(qū)，包括阻遏物作用區(qū)、CAP作用區(qū)以及RNA聚合酶作用區(qū)、β-半乳糖苷酶的頭8個密碼子。有一些對阻遏物作用不敏感的啟動子，也被用來制備表達載體2.95bp的Alu片斷：不完整的CAP結(jié)合序列3.L8突變的203bp區(qū)段，在CAP結(jié)合序列里發(fā)生了G-A的轉(zhuǎn)換4.在uv5突變，使lac啟動子開始的轉(zhuǎn)錄顯得更有效。（RNA聚合酶結(jié)合區(qū)T-A顛換,相鄰堿基G-A的轉(zhuǎn)換）1.經(jīng)過Hae切割的203bp的酶切片斷上具有La39質(zhì)粒的構(gòu)建：將含有l(wèi)ac啟動子的Hae酶切片斷，經(jīng)平末端連接，克隆到經(jīng)EcoR1切割并對其粘性末端進行填補修復(fù)的pBR322質(zhì)粒上。質(zhì)粒的構(gòu)建：40增加2個堿基對增加2個堿基對41最新基因工程5課件42Trp啟動子的表達載體這種表達載體的優(yōu)點是，它所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于lac啟動子表達載體系統(tǒng)，并且是誘導(dǎo)型的。Trp啟動子的表達載體43構(gòu)建：1.大腸桿菌染色體DNA的5.4kbHind片斷，含有trp啟動子、操縱單元、前導(dǎo)序列、弱化子、trpE基因、trpD基因的部分序列。2.將此片斷，克隆到pBR322質(zhì)粒的Hind位點，構(gòu)建成了ptrpED3表達載體（含有兩個Hind位點）。

3.Hind部分酶切消化，將靠近EcoR1位點的一個Hind位點，經(jīng)核酸外切酶和S1核酸酶處理，消除掉構(gòu)建新的質(zhì)粒載體ptrpED5-1.

構(gòu)建：44最新基因工程5課件45使用Hind接頭，將ptrpED5-1質(zhì)粒的Hinf1片斷克隆到了pBR322質(zhì)粒的Hind位點上，形成重組質(zhì)粒pWT111（含有trp調(diào)節(jié)序列和trpE基因的頭7個密碼子）。使用Hind接頭，將ptrpED5-1質(zhì)46最新基因工程5課件47Trp啟動子表達載體已用來生產(chǎn)了α-干擾素和γ-干擾素三啟動子串聯(lián)單元表達效率高于單啟動子單元Trp啟動子表達載體已用來生產(chǎn)了α-干擾素和γ-干擾素48PL啟動子的表達載體是一種最廣泛使用大腸桿菌表達載體的啟動子之一。

PL啟動子的表達載體49λ噬菌體的阻遏物－操作系統(tǒng)λ噬菌體的阻遏物－操作系統(tǒng)50cI基因存在一個溫度敏感突變等位基因。42度時，阻遏蛋白失活；28-30度時，PL啟動子完全被阻遏蛋白抑制。通過改變溫度來控制PL啟動子的開閉cI基因存在一個溫度敏感突變等位基因。51pPLc24表達載體：用來表達天然的蛋白質(zhì)和融合的蛋白質(zhì)。這個質(zhì)粒表達載體含有MS2-聚合酶基因開始的98個密碼子，不具有轉(zhuǎn)譯起始密碼子的外源片斷也能實現(xiàn)表達。在MS2-聚合酶基因下游，存在BamH和Hind單切點。EcoR單切點靠近λPL啟動子，處于轉(zhuǎn)譯起始密碼子之前。pPLc24表達載體：52最新基因工程5課件53pPLa2311表達載體可以控制具有轉(zhuǎn)譯起始區(qū)的外源片斷插入基因的表達。這種啟動子可接受熱敏感的λ阻遏蛋白質(zhì)的抑制。

pPLa2311表達載體54組成：1.pBR322的Hae－EcoR片斷；編碼ampr2.λ噬菌體的Hae-Hae片斷：λPL3.pMK20質(zhì)粒的Hae片斷：編碼kanr4.具有ColE1復(fù)制起點的Hae片斷：經(jīng)pMK20質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而來。組成：55最新基因工程5課件56pPLc2833表達載體調(diào)節(jié)型強啟動子：能夠使克隆的真核基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞中最有效的高水平表達。

pPLc2833表達載體57組成：1.一個調(diào)節(jié)型的強啟動子；2.一個用作選擇記號的氨芐青霉素抗性基因ampr；3.一個直接位于PL啟動子下游的多克隆位點（MCS）區(qū)。組成：58若由pKN402質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點取代pPLc2833質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點，由此形成的新質(zhì)粒pCP3。它在大腸桿菌寄主細(xì)胞中指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)合成的有效性可得到有效的提高。而且這種質(zhì)粒是溫度敏感型的載體。（42度，拷貝數(shù)提高5～10倍）若由pKN402質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點取代pPLc59克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達克隆的真核基因在60外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達部位融合蛋白質(zhì)的表達外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的穩(wěn)定性外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達部位61外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達部位1.細(xì)胞質(zhì)中表達2.周質(zhì)中表達3.胞外表達外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達部位62細(xì)胞質(zhì)中表達:外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達時，常會發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。影響其形成的關(guān)鍵因素：電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基組分細(xì)胞質(zhì)中表達:63優(yōu)點：1.形成包涵體a.蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離b.蛋白質(zhì)受保護而免受胞內(nèi)酶的降解作用c.蛋白質(zhì)沒有活性，因此不會使寄主細(xì)胞受傷害優(yōu)點：642.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高

二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，會導(dǎo)致外源片斷編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達。3.表達的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡單。2.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高65缺點：1.包涵體a.蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無法恢復(fù)其生物學(xué)活性b.蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低c.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴2.還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成（硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷氧還蛋白系統(tǒng)）

缺點：663.由于N－末端存在甲硫氨酸。使蛋白質(zhì)的真實性受影響4.蛋白質(zhì)會被酶解5.蛋白質(zhì)種類多，因此純化比較復(fù)雜3.由于N－末端存在甲硫氨酸。使蛋白質(zhì)的真實性受影響67周質(zhì)中表達：周質(zhì)：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在周質(zhì)中表達的蛋白，需要信號肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進入周質(zhì)。

周質(zhì)中表達：68優(yōu)點：1.由于周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類比較少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化就比較簡單2.蛋白質(zhì)酶解的程度不甚嚴(yán)重3.促進了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用（氧化環(huán)境）4.蛋白質(zhì)的N－末端結(jié)構(gòu)真實在正確折疊的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)運過程中，在體內(nèi)對信號肽進行切割優(yōu)點：69缺點：1.信號肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運2.有可能形成包涵體缺點：70胞外表達：使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進行分離純化。胞外表達：71途徑：1.用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序）2.誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。（可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）途徑：72優(yōu)點：1.蛋白質(zhì)的酶解作用程度低2.由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，因此目標(biāo)蛋白容易純化3.增進了蛋白質(zhì)的折疊作用4.蛋白質(zhì)N-末端的結(jié)構(gòu)真實優(yōu)點：73缺點：1.在大腸桿菌細(xì)胞中表達的外源真核蛋白質(zhì)，通常是不會分泌到胞外培養(yǎng)基中去的2.由于分泌在胞外培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)相當(dāng)稀釋，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化過程比較復(fù)雜缺點：74融合蛋白質(zhì)的表達融合基因：通常是指通過自發(fā)突變事件形成的、或是應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的、一類具有來自兩個或兩個以上不同基因的核苷酸序列的新型基因。

融合蛋白質(zhì)的表達75由DNA體外重組構(gòu)成的融合基因有兩種類型一、由報告基因的編碼序列區(qū)和另一個基因的啟動子及其調(diào)節(jié)序列構(gòu)成的二、由一種異源蛋白質(zhì)基因的編碼序列區(qū)同寄主細(xì)胞的誘導(dǎo)型啟動子構(gòu)成由DNA體外重組構(gòu)成的融合基因有兩種類型76融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個或數(shù)個不同基因的編碼序列組成的融合基因，轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的單一的多肽序列。它們的功能往往是異常的，或者是已經(jīng)發(fā)生了變化。融合蛋白質(zhì)：由克隆在一起的兩個或數(shù)個不同基因的編碼序列77融合蛋白質(zhì)的純化基本原理：利用與融合蛋白質(zhì)配偶體相對應(yīng)的配體作為吸附劑，制備親和層析柱，通過配偶體與配體之間的相互作用，過柱的融合蛋白質(zhì)被滯留下來，其它蛋白質(zhì)則流出駐外，經(jīng)洗脫處理，便可回收到純化的融合蛋白質(zhì)。融合蛋白質(zhì)的純化78融合蛋白質(zhì)的切割

將其中大腸桿菌多肽組分切除掉。1.溴化氰切割法：能特異性的從甲硫氨酸殘基處切割多肽鏈。2.胰蛋白酶切割法：能從精氨酸或是賴氨酸殘基羧基一側(cè)進行特異性的切割。3.Xa切割法：能唯一地從特異識別序列C－末端切割多肽融合蛋白質(zhì)的切割79影響克隆基因在大腸桿菌中的表達效率因素影響克隆基因在大腸桿菌中的805’-UTR對克隆基因表達效率的影響a.啟動子結(jié)構(gòu)對表達效率的影響大腸桿菌啟動子的保守序－35區(qū)（5’TTGACA）和－10(5’TATAAT)區(qū);它們之間的距離(17bp)。b.啟動子與克隆基因的間隔距離對表達效率的影響當(dāng)mRNA分子5’－末端與SD序列之間的長度小于15bp時，轉(zhuǎn)譯效率下降。

5’-UTR對克隆基因表達效率的影響812.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性對基因表達效率的影響a.質(zhì)粒載體點的拷貝數(shù)對表達效率的影響b.質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性對表達效率的影響2.質(zhì)粒載體的生物學(xué)特性對基因表達效率的影響823.mRNA轉(zhuǎn)錄本的分子特性對基因表達效率的影響a.轉(zhuǎn)譯起始序列對表達效率的影響SD序列后面的4個堿基，T或A時轉(zhuǎn)譯作用較高，C或G時，下降50%或25%；位于起始密碼子AUG上游的密碼三聯(lián)體的堿基，CUU或UAU時轉(zhuǎn)譯效率最有效，UUC、UCA或AGG時下降20倍；位于起始密碼子AUG下游的密碼子堿基組成，也影響轉(zhuǎn)譯的速率。b.mRNA的穩(wěn)定性對表達效率的影響3.mRNA轉(zhuǎn)錄本的分子特性對基因表達效率的影響834.遺傳密碼子的使用對基因表達效率的影響a.密碼子使用的偏愛性現(xiàn)象的規(guī)律性

幾乎在所有的簡并密碼子家族中，都有一個或兩個是優(yōu)先使用的偏愛性密碼子；一些密碼子在各種不同基因中都是最常用的（在編碼脯氨酸4種同義密碼子，CCC是優(yōu)先使用的）高表達活性的基因比低表達活性的基因，呈現(xiàn)出較高程度的密碼子偏愛性簡并密碼子的使用頻率，反應(yīng)它們相應(yīng)的tRNA豐度。

4.遺傳密碼子的使用對基因表達效率的影響84b.密碼子使用偏愛性對基因表達效率的影響富含大腸桿菌罕用密碼子的外源真核基因，很難在大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中得到有效的表達。不同生物密碼子的偏愛性，是阻礙外源基因在大腸桿菌中高效表達的一種重要因素。b.密碼子使用偏愛性對基因表達效率的影響855.寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)對基因表達效率的影響培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)方式、培養(yǎng)溫度等環(huán)境因素能影響大腸桿菌生理狀態(tài)。5.寄主細(xì)胞的生理狀態(tài)對基因表達效率的影響86最新基因工程5課件87基因工程5基因工程588大腸桿菌表達體系克隆基因正確表達的基本條件克隆基因表達活性的檢測大腸桿菌表達體系89最新基因工程5課件90最新基因工程5課件91最新基因工程5課件92最新基因工程5課件93最新基因工程5課件94最新基因工程5課件95真核基因在大腸桿菌中的表達真核基因在大腸桿菌中的表達96克隆基因表達活性的檢測

1.微細(xì)胞檢測法；2.巨細(xì)胞檢測法；3.偶聯(lián)反應(yīng)測定法?？寺』虮磉_活性的檢測97微細(xì)胞檢測法：這是一種適于檢測質(zhì)粒基因表達的體內(nèi)檢測法。微細(xì)胞：指由某些細(xì)菌突變體菌株在其生長期間連續(xù)產(chǎn)生的一類微小的圓形的無核細(xì)胞。微細(xì)胞檢測法：98通過蔗糖梯度離心將微細(xì)胞與正常細(xì)胞分開，含有質(zhì)粒載體的微細(xì)胞是適于檢測重組子質(zhì)粒所攜帶的外源基因表達狀況的理想體系。通過蔗糖梯度離心將微細(xì)胞與正常細(xì)胞分開，含有質(zhì)粒載體99Example:

ColE1的衍生質(zhì)粒（缺失了106dal）,在微細(xì)胞中不能合成出56103dal、42103dal、30103dal、28103dal四種多肽。其中3種多肽是大腸桿菌E1的降解產(chǎn)物。當(dāng)一段含有EcoR1甲基化酶的DNA片斷插入到卡那霉素基因內(nèi)部時，便能在微細(xì)胞中合成EcoR1甲基化酶和另外2種其它的多肽分子。Example:100巨細(xì)胞檢測法1.經(jīng)紫外線照射的大腸桿菌recAuvrA細(xì)胞，DNA停止合成，而質(zhì)粒載體則可以繼續(xù)合成，在紫外線照射后6小時，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)粒DNA的數(shù)量增加了10倍左右，在紫外線照射后的幾個小時內(nèi)，加入經(jīng)放射性標(biāo)記的氨基酸，此時合成的蛋白質(zhì)絕大部分是質(zhì)?；蛩幋a的。巨細(xì)胞檢測法1012.將含有外源基因的λ噬菌體重組子，感染到事先經(jīng)過紫外線嚴(yán)格照射的大腸桿菌細(xì)胞上。由于細(xì)胞經(jīng)紫外線照射使DNA受到了損傷，自身基因的表達受到了嚴(yán)重的抑制。通過同λ噬菌體載體編碼的蛋白質(zhì)種類作比較，就可以鑒定出克隆基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。2.將含有外源基因的λ噬菌體重組子，感染到102偶聯(lián)反應(yīng)測定法使DNA模板在細(xì)菌無細(xì)胞體系中，進行轉(zhuǎn)錄－轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)反應(yīng)。經(jīng)過改良的這種體系中，可以使克隆在細(xì)菌質(zhì)?；蚴删w基因組上的外源片斷進行體外表達，就可以比較容易的確定多肽片斷是由編碼模板上的哪個小片段指導(dǎo)合成的。

偶聯(lián)反應(yīng)測定法103優(yōu)點：1.放射性標(biāo)記參入到蛋白質(zhì)的效率，比體內(nèi)標(biāo)記法高的多，而且這個系統(tǒng)十分敏感。經(jīng)35S標(biāo)記的多肽分子，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影若干小時后可被迅速檢出；2.應(yīng)用這個體系，其它原核生物的基因也能夠得到有效的表達。優(yōu)點：104大腸桿菌表達載體大腸桿菌表達載體105核糖體結(jié)合位點啟動子轉(zhuǎn)錄終止子復(fù)制起點核糖體結(jié)合位點啟動子轉(zhuǎn)錄終止子復(fù)制106組成部分

1.啟動子：最佳啟動子具備的條件第一必須是將啟動子，能夠克隆基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達量占細(xì)胞總蛋白的10%-30%以上第二這個啟動子應(yīng)能呈現(xiàn)出一種低限的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平，因為在表達毒性蛋白質(zhì)或是有損于寄主細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)的情況下，使用高度抑制型的啟動子是一種極為重要的條件

組成部分107第三這種啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)。（IPTG）第三這種啟動子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過簡單的方式使用廉價的誘1082.轉(zhuǎn)錄終止子啟動子封堵作用：由一個上游啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄作用，當(dāng)其通讀過下游啟動子時，便會使該啟動子的功能受到抑制，將這種由一個啟動子的功能活性抑制另一個啟動子轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象，叫做啟動子封堵作用。轉(zhuǎn)錄終止子還能增強mRNA分子的穩(wěn)定性，從而提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的水平。2.轉(zhuǎn)錄終止子1093.轉(zhuǎn)譯起始序列5’-末端結(jié)構(gòu)特征，決定mRNA的轉(zhuǎn)譯起始效率。在核糖體結(jié)合位點（RBS）的序列結(jié)構(gòu)中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷殘基含量的比例，誘發(fā)堿基發(fā)生定點突變；或使用轉(zhuǎn)譯偶聯(lián)系統(tǒng)進行克隆基因表達3.轉(zhuǎn)譯起始序列1104.轉(zhuǎn)譯增強子顯著的增加異源基因在大腸桿菌中的表達效率。5.轉(zhuǎn)譯終止子mRNA轉(zhuǎn)譯終止必須存在終止密碼子。大腸桿菌格外偏愛使用終止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四聯(lián)核苷酸的情況下，轉(zhuǎn)譯終止的效率便會得到進一步的增強。4.轉(zhuǎn)譯增強子111功能啟動子的分離：

一般程序：選用一種適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶，消化切割大腸桿菌的染色體DNA，接著將切割產(chǎn)生的DNA限制片斷群體，同一種無啟動子的質(zhì)粒載體重組，按實驗設(shè)計要求使克隆的片斷恰好插入在緊鄰報告基因的上游位置隨后把此重組混合物轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主細(xì)胞，構(gòu)成質(zhì)粒載體基因文庫，并檢測報告基因的表達活性。功能啟動子的分離：112報告基因（reportergene）：特指那些編碼產(chǎn)物可以被快速測定的功能核苷酸編碼單元（半乳糖苷酶基因、堿性磷酸酶基因、螢光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因等）。追蹤某種特定的DNA結(jié)構(gòu)（重組質(zhì)粒）是否已經(jīng)導(dǎo)入寄主細(xì)胞、抑或是器官和組織；也可用來同任何一種目的啟動子連接，因此其表達活性可作為檢測啟動子功能的依據(jù)。報告基因（reportergene）：特指那些編碼產(chǎn)113利用CAT基因進行功能啟動子的分離和活性測定無啟動子的CAT質(zhì)粒載體EcoliDNA構(gòu)建Ecoli基因文庫細(xì)胞裂解物、14C標(biāo)記得氯霉素乙酰輔酶A薄層層析放射自顯影CAT活性的檢測：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶可以催化氯霉素（2-或3-）發(fā)生乙酰化作用。利用CAT基因無啟動子的CAT質(zhì)粒載體EcoliDNA構(gòu)建114使用tetr作報告基因分離功能啟動子

1.首先在大腸桿菌質(zhì)粒pBR316（含有一個tet基因、Hind位點）上的tet的啟動子序列中插入一個EcoR1的酶切位點（pBRH3B,pBRH1），使之失活。2.將純化的細(xì)菌染色體DNA片斷，克隆在pBRH3B或pBRH1的EcoR1限制性位點上；轉(zhuǎn)化給對tet敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。使用tetr作報告基因分離功能啟動子115最新基因工程5課件116使用galK（半乳糖激酶基因）作報告基因分離功能啟動子

能夠檢測啟動子活性強弱的新型質(zhì)粒載體系統(tǒng)。來源于pBR322使用galK（半乳糖激酶基因）作報告基因分離功能啟動子117轉(zhuǎn)譯終止密碼子無啟動子的galK轉(zhuǎn)譯終止密碼子無啟動子的galK118原理：半乳糖激酶能夠從ATP分子上轉(zhuǎn)移一個磷酸集團給半乳糖分子，從而催化半乳糖發(fā)生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。用同位素標(biāo)記ATP，測定從ATP轉(zhuǎn)移到半乳糖去的32P的放射性強度，可推算報告基因（galK）表達的半乳糖激酶的產(chǎn)量。原理：119最新基因工程5課件120分離功能的啟動子：將大腸桿菌基因組的酶切片斷，克隆在pOK1質(zhì)粒載體的MCS區(qū)的單克隆位點上；將體外連接的DNA重組分子，轉(zhuǎn)化給具GalE＋、GalK－的大腸桿菌寄主細(xì)胞，避免內(nèi)源半乳糖激酶的干擾；將它們涂布在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基（含有PH值指示劑的中性紅和結(jié)晶紫，檢測碳水化合物）上，篩選轉(zhuǎn)化子（重組子產(chǎn)生紅色的菌落）。分離功能的啟動子：121pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動子的因素1.選用的報告基因galK的編碼產(chǎn)物半乳糖激酶，是一種易于快速定量檢測的蛋白質(zhì)（鑒定啟動子表達活性的強弱）；2.應(yīng)用麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基的顯色反應(yīng)特性，篩選能夠利用半乳糖的轉(zhuǎn)化子（分離功能啟動子）。3.采用半乳糖激酶缺陷型的大腸桿菌寄主菌株（GalE+GalT+GalK－）作轉(zhuǎn)化受體；pOK1質(zhì)粒載體分離功能啟動子的因素122常用的大腸桿菌表達載體

1.Lac啟動子的表達載體2.Trp啟動子的表達載體3.PL啟動子的表達載體常用的大腸桿菌表達載體123最新基因工程5課件124理論上，凡是具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的lac操縱子的質(zhì)粒，都基本上具備了用作克隆基因表達載體的條件。這類表達載體的最突出的特點是，含有一條足夠大的編碼β-半乳糖苷酶的lacZ基因片斷。因此，每當(dāng)有一個克隆的外源DNA片斷插入到這個啟動子之后，人保持著lacZ基因固有的讀碼結(jié)構(gòu)時，這個重組質(zhì)粒就會合成出一種由外源克隆基因編碼的多肽和β-半乳糖苷酶組成的融合蛋白質(zhì)。理論上，凡是具有包括控制區(qū)段在內(nèi)的lac操縱子的1251.經(jīng)過Hae切割的203bp的酶切片斷上具有Lac操縱子的控制區(qū)，包括阻遏物作用區(qū)、CAP作用區(qū)以及RNA聚合酶作用區(qū)、β-半乳糖苷酶的頭8個密碼子。有一些對阻遏物作用不敏感的啟動子，也被用來制備表達載體2.95bp的Alu片斷：不完整的CAP結(jié)合序列3.L8突變的203bp區(qū)段，在CAP結(jié)合序列里發(fā)生了G-A的轉(zhuǎn)換4.在uv5突變，使lac啟動子開始的轉(zhuǎn)錄顯得更有效。（RNA聚合酶結(jié)合區(qū)T-A顛換,相鄰堿基G-A的轉(zhuǎn)換）1.經(jīng)過Hae切割的203bp的酶切片斷上具有La126質(zhì)粒的構(gòu)建：將含有l(wèi)ac啟動子的Hae酶切片斷，經(jīng)平末端連接，克隆到經(jīng)EcoR1切割并對其粘性末端進行填補修復(fù)的pBR322質(zhì)粒上。質(zhì)粒的構(gòu)建：127增加2個堿基對增加2個堿基對128最新基因工程5課件129Trp啟動子的表達載體這種表達載體的優(yōu)點是，它所合成的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于lac啟動子表達載體系統(tǒng)，并且是誘導(dǎo)型的。Trp啟動子的表達載體130構(gòu)建：1.大腸桿菌染色體DNA的5.4kbHind片斷，含有trp啟動子、操縱單元、前導(dǎo)序列、弱化子、trpE基因、trpD基因的部分序列。2.將此片斷，克隆到pBR322質(zhì)粒的Hind位點，構(gòu)建成了ptrpED3表達載體（含有兩個Hind位點）。

3.Hind部分酶切消化，將靠近EcoR1位點的一個Hind位點，經(jīng)核酸外切酶和S1核酸酶處理，消除掉構(gòu)建新的質(zhì)粒載體ptrpED5-1.

構(gòu)建：131最新基因工程5課件132使用Hind接頭，將ptrpED5-1質(zhì)粒的Hinf1片斷克隆到了pBR322質(zhì)粒的Hind位點上，形成重組質(zhì)粒pWT111（含有trp調(diào)節(jié)序列和trpE基因的頭7個密碼子）。使用Hind接頭，將ptrpED5-1質(zhì)133最新基因工程5課件134Trp啟動子表達載體已用來生產(chǎn)了α-干擾素和γ-干擾素三啟動子串聯(lián)單元表達效率高于單啟動子單元Trp啟動子表達載體已用來生產(chǎn)了α-干擾素和γ-干擾素135PL啟動子的表達載體是一種最廣泛使用大腸桿菌表達載體的啟動子之一。

PL啟動子的表達載體136λ噬菌體的阻遏物－操作系統(tǒng)λ噬菌體的阻遏物－操作系統(tǒng)137cI基因存在一個溫度敏感突變等位基因。42度時，阻遏蛋白失活；28-30度時，PL啟動子完全被阻遏蛋白抑制。通過改變溫度來控制PL啟動子的開閉cI基因存在一個溫度敏感突變等位基因。138pPLc24表達載體：用來表達天然的蛋白質(zhì)和融合的蛋白質(zhì)。這個質(zhì)粒表達載體含有MS2-聚合酶基因開始的98個密碼子，不具有轉(zhuǎn)譯起始密碼子的外源片斷也能實現(xiàn)表達。在MS2-聚合酶基因下游，存在BamH和Hind單切點。EcoR單切點靠近λPL啟動子，處于轉(zhuǎn)譯起始密碼子之前。pPLc24表達載體：139最新基因工程5課件140pPLa2311表達載體可以控制具有轉(zhuǎn)譯起始區(qū)的外源片斷插入基因的表達。這種啟動子可接受熱敏感的λ阻遏蛋白質(zhì)的抑制。

pPLa2311表達載體141組成：1.pBR322的Hae－EcoR片斷；編碼ampr2.λ噬菌體的Hae-Hae片斷：λPL3.pMK20質(zhì)粒的Hae片斷：編碼kanr4.具有ColE1復(fù)制起點的Hae片斷：經(jīng)pMK20質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而來。組成：142最新基因工程5課件143pPLc2833表達載體調(diào)節(jié)型強啟動子：能夠使克隆的真核基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞中最有效的高水平表達。

pPLc2833表達載體144組成：1.一個調(diào)節(jié)型的強啟動子；2.一個用作選擇記號的氨芐青霉素抗性基因ampr；3.一個直接位于PL啟動子下游的多克隆位點（MCS）區(qū)。組成：145若由pKN402質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點取代pPLc2833質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點，由此形成的新質(zhì)粒pCP3。它在大腸桿菌寄主細(xì)胞中指導(dǎo)外源蛋白質(zhì)合成的有效性可得到有效的提高。而且這種質(zhì)粒是溫度敏感型的載體。（42度，拷貝數(shù)提高5～10倍）若由pKN402質(zhì)粒的DNA復(fù)制起點取代pPLc146克隆的真核基因在大腸桿菌細(xì)胞中的表達克隆的真核基因在147外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達部位融合蛋白質(zhì)的表達外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的穩(wěn)定性外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達部位148外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達部位1.細(xì)胞質(zhì)中表達2.周質(zhì)中表達3.胞外表達外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞中的表達部位149細(xì)胞質(zhì)中表達:外源基因在大腸桿菌寄主細(xì)胞質(zhì)中高效表達時，常會發(fā)生一種特殊的生理現(xiàn)象，形成包涵體。包涵體：存在于細(xì)胞質(zhì)中的一種由不可溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結(jié)構(gòu)物。影響其形成的關(guān)鍵因素：電荷的平均數(shù)、形成轉(zhuǎn)角的氨基酸殘基組分細(xì)胞質(zhì)中表達:150優(yōu)點：1.形成包涵體a.蛋白質(zhì)易于以高純度和高濃度方式分離b.蛋白質(zhì)受保護而免受胞內(nèi)酶的降解作用c.蛋白質(zhì)沒有活性，因此不會使寄主細(xì)胞受傷害優(yōu)點：1512.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高

二硫鍵的斷裂以及轉(zhuǎn)譯修飾作用的喪失，會導(dǎo)致外源片斷編碼的蛋白質(zhì)在大腸桿菌中超量表達。3.表達的質(zhì)粒載體構(gòu)建比較簡單。2.蛋白質(zhì)的產(chǎn)量高152缺點：1.包涵體a.蛋白質(zhì)折疊了，再折疊的蛋白質(zhì)可能無法恢復(fù)其生物學(xué)活性b.蛋白質(zhì)的終產(chǎn)量偏低c.蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本比較昂貴2.還原的環(huán)境不利于二硫鍵的形成（硫氧還蛋白系統(tǒng)、谷氧還蛋白系統(tǒng)）

缺點：1533.由于N－末端存在甲硫氨酸。使蛋白質(zhì)的真實性受影響4.蛋白質(zhì)會被酶解5.蛋白質(zhì)種類多，因此純化比較復(fù)雜3.由于N－末端存在甲硫氨酸。使蛋白質(zhì)的真實性受影響154周質(zhì)中表達：周質(zhì)：在大腸桿菌一類格蘭氏陰性菌中，位于內(nèi)膜和外膜之間的細(xì)胞結(jié)構(gòu)部分。在周質(zhì)中表達的蛋白，需要信號肽序列才能從細(xì)胞質(zhì)中穿過細(xì)胞質(zhì)內(nèi)膜進入周質(zhì)。

周質(zhì)中表達：155優(yōu)點：1.由于周質(zhì)中蛋白質(zhì)種類比較少，因此目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化就比較簡單2.蛋白質(zhì)酶解的程度不甚嚴(yán)重3.促進了二硫鍵的形成及蛋白質(zhì)的折疊作用（氧化環(huán)境）4.蛋白質(zhì)的N－末端結(jié)構(gòu)真實在正確折疊的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)運過程中，在體內(nèi)對信號肽進行切割優(yōu)點：156缺點：1.信號肽并非總是有助于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運2.有可能形成包涵體缺點：157胞外表達：使克隆在大腸桿菌細(xì)胞中表達的外源蛋白質(zhì)，分泌到胞外培養(yǎng)基中進行分離純化。胞外表達：158途徑：1.用大腸桿菌細(xì)胞固有的途徑，使真正屬于分泌型的蛋白質(zhì)直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。（不是特別有效的程序）2.誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞的外膜發(fā)生有限的滲漏，導(dǎo)致胞內(nèi)的蛋白質(zhì)向胞外培養(yǎng)基方向分泌。（可以分離到中等產(chǎn)量的蛋白質(zhì)）途徑：159優(yōu)點：1.蛋白質(zhì)的酶解作用程度低2.由于分泌到胞外的蛋白質(zhì)種類少，因此目標(biāo)蛋白容易純化3.增進了蛋白質(zhì)的折疊作用4.蛋白質(zhì)N-末端的結(jié)構(gòu)真實優(yōu)點：160缺點：1.在大腸桿