肺結(jié)核診斷新技術(shù)課件

結(jié)核病診斷新技術(shù)及其評(píng)價(jià)

寶雞市人民醫(yī)院呼吸科魏勝全內(nèi)容二、生化檢測(cè)三、細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)一、微生物學(xué)檢測(cè)四、分子生物學(xué)檢測(cè)

呼吸醫(yī)生的尷尬？

先抗炎？？？再抗癆？？？實(shí)在不行，上化療？？？？你懂的！TB的診斷有時(shí)有多難！病原學(xué)檢測(cè)是診斷TB最重要的依據(jù)，但據(jù)2013年WHO統(tǒng)計(jì)，僅有58%的TB患者有病原學(xué)依據(jù)。一、微生物學(xué)檢測(cè)包括涂片染色鏡檢、結(jié)核分枝桿菌(MTB)分離培養(yǎng)、MTB藥敏和菌種鑒定等。染色涂片法是臨床上最便捷快速的診斷方法，但敏感度偏低，發(fā)達(dá)國家可檢出50%的活動(dòng)性肺結(jié)核，我國檢出率一般約為30%，且無法區(qū)別非MTB(

Mycobacteriumtuberculosis)。

MTB分離培養(yǎng)是確診TB最重要的依據(jù)，不僅能取得病原學(xué)結(jié)果，還能進(jìn)一步進(jìn)行藥敏檢測(cè)，指導(dǎo)治療。目前常用的細(xì)菌培養(yǎng)基包括Lowenstein-Jensen固相培養(yǎng)基(L-J法)和Middlebrook7H97H11液體培養(yǎng)基。固相培養(yǎng)基價(jià)格低，但耗時(shí)長，需要4~8周取得結(jié)果，加上菌種鑒定的時(shí)間耗時(shí)更長。基于BACTECMGIT960、BacT/Alert3D系統(tǒng)的液體培養(yǎng)基檢測(cè)速度有明顯提高(1~4周)，但費(fèi)用較高。一、微生物學(xué)檢測(cè)1.1MTB快速培養(yǎng)法BACTECMGIT960系統(tǒng)采用熒光增強(qiáng)原理，在培養(yǎng)管底部包埋對(duì)氧氣濃度高度敏感的指示劑，通過檢測(cè)氧氣濃度變化以監(jiān)測(cè)培養(yǎng)管內(nèi)MTB的生長狀態(tài)。陽性標(biāo)本檢出時(shí)間相對(duì)較短，平均為9d，后續(xù)菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)時(shí)間平均為4d。BACTECMGIT960系統(tǒng)為目前國際通行培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，培養(yǎng)陽性率較固體培養(yǎng)法高出10%左右，檢測(cè)界限<10個(gè)菌落形成單位(CFU)/mL。BacT/Alert3D系統(tǒng)采用比色法原理，通過監(jiān)測(cè)預(yù)處理標(biāo)本中產(chǎn)生CO2與標(biāo)本瓶中初始的CO2相比較，判斷是否存在MTB生長。同時(shí)可以進(jìn)行藥敏檢測(cè)。理論上培養(yǎng)速度較L-J法和BACTECMGIT960系統(tǒng)更快(6~22d)。1.2直接顯微鏡檢技術(shù)(MODS)工作原理依據(jù)于MTB在液體培養(yǎng)基中生長會(huì)出現(xiàn)特征性的索狀結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以通過倒置顯微鏡觀察到。檢測(cè)呼吸道標(biāo)本中是否存在MTB的敏感度為97.5%，特異度為94.4%，出現(xiàn)陽性結(jié)果的中位時(shí)間約為8d該方法無需昂貴的設(shè)備，簡(jiǎn)單，相對(duì)快速。二、生化檢測(cè)TB的生化檢測(cè)主要包括腺苷脫氨酶(ADA)、乳酸脫氫酶(LDH)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)等酶學(xué)檢測(cè)。此類方法簡(jiǎn)單快速，適用于TB早期診斷及鑒別診斷，但由于缺少結(jié)核特異性的酶標(biāo)而無確診價(jià)值。2.1ADAADA是嘌呤核苷代謝中重要的酶。胸(腹)腔積液ADA檢測(cè)對(duì)結(jié)核性胸(腹)膜炎鑒別診斷有重要意義，胸(腹)腔積液ADA濃度以45U/L為界，結(jié)核性大多超過此值，特異度及敏感度超過80%。胸(腹)腔積液ADA與血清ADA比值≥1更傾向結(jié)核性積液。而對(duì)于癌性及非特異性積液，其比值一般<1。ADA對(duì)于活動(dòng)性TB的敏感度為100%，特異度為97%。腦脊液中ADA活性檢測(cè)對(duì)于TB的診斷也有一定價(jià)值，尤其應(yīng)用于結(jié)核性腦膜炎與隱球菌腦膜炎、病毒性腦膜炎的鑒別。結(jié)核性腦膜炎腦脊液中ADA活性增高，通常>8U/L，而后兩者一般正常，ADA濃度≤8U/L。結(jié)核性腦膜炎表明，將ADA濃度>8U/L作為結(jié)核性腦膜炎診斷的閾值時(shí)，其診斷的總敏感度<59%，特異度>96%。二、生化檢測(cè)2.2LDH是一種糖酵解酶，幾乎存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)。對(duì)TB的診斷來說，LDH可用于區(qū)別滲出性積液與漏出性積液，胸(腹)腔積液LDH與血清LDH比值≥0.6，LDH濃度>200U/L傾向滲出液。結(jié)核性胸(腹)腔積液的LDH濃度一般>200U/L，與癌性胸(腹)腔積液LDH濃度變化無特征性差異。2.3ACE為二肽羧肽水解酶，又名激肽酶I，存在于肺、腎、腦、小腸、胎盤等組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞或上皮細(xì)胞及血漿。對(duì)TB的診斷來說，血清ACE的檢測(cè)主要用于TB與結(jié)節(jié)病的鑒別，后者血清ACE濃度升高多見。結(jié)核性胸腔積液ACE濃度一般不升高，胸腔積液ACE與血清ACE比值≥1更傾向結(jié)核性積液，而惡性積液的比值多<1。三、細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)

3.2血清學(xué)檢測(cè)WHO和不少國家推薦使用IGRA(

interferongammareleaseassay)

進(jìn)行MTB感染的血清學(xué)檢測(cè)，這類試驗(yàn)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和(或)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)定量檢測(cè)全血和(或)外周血單核細(xì)胞在MTB特異性抗原刺激下釋放γ-干擾素的水平，用于診斷LTBI及輔助診斷TB。目前利用IGRA原理，有2種較為成熟的試劑盒，即QuantiFERONTBGOLDInTube試劑盒(QFT-GIT，CellestisIncorporated，Carnegie，Australia)和T-SPOT.TB試劑盒(OxfordImmunotec，Abingdon，UK)，先后被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。檢測(cè)結(jié)果陽性可被判斷為MTB感染。IGRA在24h之內(nèi)就可以獲得結(jié)果，花費(fèi)的時(shí)間比TST短，并且不會(huì)因?yàn)閺?fù)強(qiáng)效應(yīng)(Booster效應(yīng))受到影響，可反復(fù)進(jìn)行，在有試驗(yàn)條件的醫(yī)院里，該試驗(yàn)的操作和管理比TST更便捷，不需要專門的醫(yī)生多次觀察結(jié)果。同TST一樣，這種方法無法區(qū)分LTBI與活動(dòng)性肺結(jié)核，因此，不能單獨(dú)作為TB的確診依據(jù)。

細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)

目前IGRA檢測(cè)成本偏高，不適用于人群篩查。試驗(yàn)結(jié)果在一定程度上受到T細(xì)胞水平及活性的影響，對(duì)于免疫抑制或者免疫缺陷者可能會(huì)結(jié)果不準(zhǔn)確。雖然有資料表明對(duì)于HIV感染、血液病、惡性腫瘤、矽肺以及慢性腎衰者，預(yù)防性治療TB潛伏感染的常用方法是IGRA，但對(duì)于其中嚴(yán)重的免疫抑制者，IGRA的診斷價(jià)值會(huì)降低。對(duì)于中國人群來說，IGRA并不能顯示出明顯超過TST的優(yōu)勢(shì)。MTB核酸擴(kuò)增檢測(cè)(NAA):是近年來TB診斷領(lǐng)域中最有突破的，檢測(cè)手段日趨成熟。部分新型的核酸檢測(cè)技術(shù)(如分子線性探針檢測(cè))得到了WHO的認(rèn)可和推薦，可用于TB的診斷和耐藥檢測(cè)。理論上NAA敏感性很好，即使標(biāo)本中只有極低拷貝數(shù)的細(xì)菌也能檢出，一般24h之內(nèi)即可取得檢驗(yàn)結(jié)果，并且在生物安全級(jí)別上要求相對(duì)較低，還可以通過檢測(cè)異煙肼和利福平的常見耐藥基因位點(diǎn)，從而篩查出耐藥MTB。三、細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)

4.2改進(jìn)的核酸檢測(cè)技術(shù)傳統(tǒng)PCR檢測(cè)總的敏感性尚不理想，同時(shí)可能存在污染、操作失當(dāng)?shù)纫蛩氐挠绊?，因此隨后產(chǎn)生了多種改進(jìn)手段，包括整合的MTB核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒以及全自動(dòng)化MTB檢測(cè)系統(tǒng)。前者包括如GenProbeMTB核酸直接擴(kuò)增檢測(cè)(GenProbeamplifiedMTBdirecttest，AMTD；SanDiego，CA，USA)、羅氏AmplicorMTB檢測(cè)(RocheamplicorMTBtest，Basel，Switzerland)、BD-ProbeTecSDAtest(BectonDickinson，MD，USA)，實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(simultaneousamplificationandtesting，SAT；仁度生物，中國)等商業(yè)試劑盒；后者主要指GeneXpertMTB/RIF系統(tǒng)(Cepheid，USA)。分子生物學(xué)檢測(cè)其中由于WHO的推薦，GeneXpertMTB/RIF已在全球60多個(gè)國家使用，下文分別予以介紹。4.2.1GenProbeMTB核酸直接擴(kuò)增檢測(cè)恒溫?cái)U(kuò)增16SrRNA，以MTB復(fù)合群特異性探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，采用化學(xué)發(fā)光物啞啶酯標(biāo)記的DNA探針與擴(kuò)增的靶基因進(jìn)行雜交，探針與擴(kuò)增產(chǎn)物交叉后利用雜交保護(hù)試驗(yàn)去除未雜交的標(biāo)記探針，最后利用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，可在2h內(nèi)做出診斷。據(jù)報(bào)道，該方法的特異度>95%，對(duì)痰細(xì)菌培養(yǎng)陽性肺結(jié)核敏感度為92%~100%，對(duì)于痰細(xì)菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核敏感度為40%~93%，對(duì)于肺外結(jié)核敏感度約為93%。4.2.2

羅氏AmplicorMTB檢測(cè)擴(kuò)增引物

16SrRNA基因片段，然后于各種分枝桿菌菌種特異性的寡核苷酸探針進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交或微孔板反向雜交鑒定菌群，部分研究表明，該方法總的特異度>95%，對(duì)于痰細(xì)菌培養(yǎng)陽性肺結(jié)核檢出>97%，對(duì)痰細(xì)菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核敏感度為40%~73%，對(duì)肺外結(jié)核敏感度為77%~98%。分子生物學(xué)檢測(cè)4.2.3BD-ProbeTecSDAtest半定量的鏈置換擴(kuò)增技術(shù)，以IS6110和16SrRNA為靶序列，經(jīng)加熱變性后與特異性引物雜交，在DNA聚合酶的作用下產(chǎn)生帶限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的靶DNA序列，然后核酸內(nèi)切酶在其識(shí)別位點(diǎn)將DNA雙鏈打開缺口，DNA聚合酶繼之延伸缺口3’端并替換下一條DNA鏈。被替換下來的DNA單鏈可以與引物結(jié)合并被DNA聚合酶延伸成雙鏈。該過程不斷反復(fù)，使靶序列高效擴(kuò)增。該方法總的特異性>90%，對(duì)于痰細(xì)菌培養(yǎng)陽性肺結(jié)核檢出達(dá)90%~100%，對(duì)于痰細(xì)菌培養(yǎng)陰性肺結(jié)核敏感度33%~100%，對(duì)于肺外結(jié)核敏感度為76%。4.2.4實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)在同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸的1個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)(100~1000)RNA拷貝；每個(gè)RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況。實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

試劑盒通過檢測(cè)RNA來證實(shí)MTB的存在，擴(kuò)增效率極高，15~30min即可將模板擴(kuò)增109倍，理論上檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于其他核酸檢測(cè)技術(shù)；該技術(shù)采用實(shí)時(shí)熒光閉管檢測(cè)，使污染得到有效控制；即使污染產(chǎn)生，由于擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA，環(huán)境中極易降解，從而大幅度提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。目前該試劑盒已獲批準(zhǔn)于我國應(yīng)用。PCR原理分子生物學(xué)檢測(cè)4.2.5GeneXpertMTB/RIF系統(tǒng)

GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)試劑盒為美國Cepheid公司開發(fā)的，適用于GeneXpert儀器，可在2h內(nèi)直接從患者新鮮痰液或凍存痰液中檢測(cè)是否還有MTB及對(duì)利福平的耐藥情況，整個(gè)過程都在一密閉環(huán)境中進(jìn)行，該方法采用全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理，將樣品處理、核酸擴(kuò)增、目標(biāo)序列的實(shí)時(shí)檢測(cè)整合于一體，通過對(duì)MTB特有的序列rpoB基因上于利福平耐藥相關(guān)81bp的核心區(qū)域(RRDR)進(jìn)行檢查。Boehme等在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表報(bào)道，對(duì)4個(gè)TB高負(fù)擔(dān)國家的1730例疑似TB患者進(jìn)行診斷評(píng)估，對(duì)于細(xì)菌培養(yǎng)陽性