蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件

蛋白質(zhì)檢測(cè)研究進(jìn)展蛋白質(zhì)檢測(cè)研究進(jìn)展1Contents、蛋白質(zhì)簡(jiǎn)介2、蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法3、蛋白質(zhì)與疾病的關(guān)系Contents2蛋白質(zhì)簡(jiǎn)介蛋白質(zhì)是由氨基酸脫水縮合形成的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子有機(jī)物,其主要化學(xué)元素為C(約50%)、O(約23%)、N(約16%)、H(約7%)、S(約0~3%)。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位,蛋白質(zhì)既具有氨基酸的部分理化特性,也具有其它有機(jī)物的一些共性以及眾多的自身獨(dú)有特點(diǎn)與性質(zhì):高分子、兩性解離及等電點(diǎn)、水合作用、變性作用、顯色反應(yīng)(雙縮脲反應(yīng)、Folin-酚反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、米倫反應(yīng)、黃蛋白反應(yīng)、乙醛酸反應(yīng)、坂口反應(yīng)、偶氮反應(yīng)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)、氨基酸的α氦基及α-羧基反應(yīng)、)蛋白質(zhì)的異常表達(dá)與體內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)蛋白質(zhì)簡(jiǎn)介3蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法√傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測(cè)方法:免疫印跡法;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)常規(guī)方法:物理法:紫外吸收法化學(xué)法:凱氏定氮法;比色法√高效液相色譜法毛細(xì)管凝膠電泳法√近紅外光譜法質(zhì)譜法熒光法蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法4免疫印跡法(Westernblot)√原理:蛋白樣品經(jīng)過(guò)電泳分離后,轉(zhuǎn)移并固定于膜上,然后應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。Wester雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定相結(jié)合的特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法√免疫印跡法是檢測(cè)蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定目的蛋白的定性方法,也可以作為確定同一種蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或同種細(xì)胞在不同條件下的相對(duì)含量的半定量方法免疫印跡法(Westernblot)5樣品的凝膠電泳蛋白印跡封閉反應(yīng)免疫印跡法檢測(cè)樣品中特異與特異性抗體(一抗)孵育蛋白質(zhì)的基本流程與酶耦聯(lián)的二抗孵育顯色或化學(xué)發(fā)光顯影觀察和記錄結(jié)果樣品的凝膠電泳6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbantsay,ELISA)是一種固相免疫測(cè)定技術(shù),先將已知的抗原或抗體包被到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí),將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗原或抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。最后加入酶反應(yīng)底物根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其光密度(OD)值的大小進(jìn)行定性或定量分析。優(yōu)點(diǎn):靈敏度高;特異性好;簡(jiǎn)便;重復(fù)性好√LISA和Wester雜交都利用抗原抗體間的分子識(shí)別作用,借助不同的抗體分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)7紫外吸收法√理論基礎(chǔ):蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氦酸殘基使其在280n處具有紫外吸收,其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。此外,蛋白質(zhì)溶液在238nm的吸光度值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下蛋白質(zhì)溶液的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系可以測(cè)定蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便、靈敏、快速,不消耗樣品,測(cè)定后能回收缺點(diǎn):準(zhǔn)確度較差、專(zhuān)一性差、干擾物質(zhì)多,若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì),會(huì)出現(xiàn)較大的干擾紫外吸收法8凱氏定氮法理論基礎(chǔ)1.各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近,通常占其總重量的16%左右2.蛋白質(zhì)樣品用濃硫酸消化后,可以轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@,硫酸銨中的NH4+與NaOH反應(yīng)叉可轉(zhuǎn)變?yōu)镹H3,用硼酸液吸收后,可由標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定并定量。凱氏定氮法由于蛋白質(zhì)是體內(nèi)的主要含氪物,因此,通過(guò)測(cè)定生物樣品的含氮量便可估算岀樣品中的總蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量=含氮量Ⅹ6.25此方法的測(cè)定范圍為0.2~1.0mg氮。√優(yōu)點(diǎn):應(yīng)用范圍廣,重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高缺點(diǎn):局限于樣品中總蛋臼的檢測(cè),破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),易受到被測(cè)樣品中其它有機(jī)含氮化合物的干擾凱氏定氮法9比色法-雙縮脲法原理:蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵,故有雙縮脲(NHCO-NH-CO-NH2)反應(yīng)。在堿性條件下,肽鍵的質(zhì)子被解離,Cu2+和失去質(zhì)子的多肽鏈的氮相結(jié)合產(chǎn)生穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物在540~560nm的光吸收值與蛋白質(zhì)的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。由于與雙縮脲試劑與不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色差別極小,使得該方法比較適合總蛋白質(zhì)的檢測(cè)?！虄?yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單、測(cè)量速度快√缺點(diǎn):靈敏度較差,精度不高比色法-雙縮脲法10蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件11蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件12蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件13蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件14蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件15蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件16蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件17蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件18蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件19蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件20蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件21蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件22蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件23蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件24蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件25蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件26蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件27蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件28蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件29蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件30蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件31蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件32蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件33蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件34蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件35蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件36蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件37蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件38蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件39蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件40蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件41蛋白質(zhì)檢測(cè)研究進(jìn)展蛋白質(zhì)檢測(cè)研究進(jìn)展42Contents、蛋白質(zhì)簡(jiǎn)介2、蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法3、蛋白質(zhì)與疾病的關(guān)系Contents43蛋白質(zhì)簡(jiǎn)介蛋白質(zhì)是由氨基酸脫水縮合形成的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子有機(jī)物,其主要化學(xué)元素為C(約50%)、O(約23%)、N(約16%)、H(約7%)、S(約0~3%)。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位,蛋白質(zhì)既具有氨基酸的部分理化特性,也具有其它有機(jī)物的一些共性以及眾多的自身獨(dú)有特點(diǎn)與性質(zhì):高分子、兩性解離及等電點(diǎn)、水合作用、變性作用、顯色反應(yīng)(雙縮脲反應(yīng)、Folin-酚反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、米倫反應(yīng)、黃蛋白反應(yīng)、乙醛酸反應(yīng)、坂口反應(yīng)、偶氮反應(yīng)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)、氨基酸的α氦基及α-羧基反應(yīng)、)蛋白質(zhì)的異常表達(dá)與體內(nèi)多種疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)蛋白質(zhì)簡(jiǎn)介44蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法√傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測(cè)方法:免疫印跡法;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)常規(guī)方法:物理法:紫外吸收法化學(xué)法:凱氏定氮法;比色法√高效液相色譜法毛細(xì)管凝膠電泳法√近紅外光譜法質(zhì)譜法熒光法蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法45免疫印跡法(Westernblot)√原理:蛋白樣品經(jīng)過(guò)電泳分離后,轉(zhuǎn)移并固定于膜上,然后應(yīng)用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。Wester雜交是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測(cè)定相結(jié)合的特異性蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法√免疫印跡法是檢測(cè)蛋白質(zhì)混合溶液中某種特定目的蛋白的定性方法,也可以作為確定同一種蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或同種細(xì)胞在不同條件下的相對(duì)含量的半定量方法免疫印跡法(Westernblot)46樣品的凝膠電泳蛋白印跡封閉反應(yīng)免疫印跡法檢測(cè)樣品中特異與特異性抗體(一抗)孵育蛋白質(zhì)的基本流程與酶耦聯(lián)的二抗孵育顯色或化學(xué)發(fā)光顯影觀察和記錄結(jié)果樣品的凝膠電泳47酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbantsay,ELISA)是一種固相免疫測(cè)定技術(shù),先將已知的抗原或抗體包被到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí),將待檢樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗原或抗體發(fā)生特異性反應(yīng)。最后加入酶反應(yīng)底物根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其光密度(OD)值的大小進(jìn)行定性或定量分析。優(yōu)點(diǎn):靈敏度高;特異性好;簡(jiǎn)便;重復(fù)性好√LISA和Wester雜交都利用抗原抗體間的分子識(shí)別作用,借助不同的抗體分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的檢測(cè)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)48紫外吸收法√理論基礎(chǔ):蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氦酸殘基使其在280n處具有紫外吸收,其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比。此外,蛋白質(zhì)溶液在238nm的吸光度值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下蛋白質(zhì)溶液的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系可以測(cè)定蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便、靈敏、快速,不消耗樣品,測(cè)定后能回收缺點(diǎn):準(zhǔn)確度較差、專(zhuān)一性差、干擾物質(zhì)多,若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì),會(huì)出現(xiàn)較大的干擾紫外吸收法49凱氏定氮法理論基礎(chǔ)1.各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近,通常占其總重量的16%左右2.蛋白質(zhì)樣品用濃硫酸消化后,可以轉(zhuǎn)變?yōu)榱蛩徜@,硫酸銨中的NH4+與NaOH反應(yīng)叉可轉(zhuǎn)變?yōu)镹H3,用硼酸液吸收后,可由標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定并定量。凱氏定氮法由于蛋白質(zhì)是體內(nèi)的主要含氪物,因此,通過(guò)測(cè)定生物樣品的含氮量便可估算岀樣品中的總蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量=含氮量Ⅹ6.25此方法的測(cè)定范圍為0.2~1.0mg氮?！虄?yōu)點(diǎn):應(yīng)用范圍廣,重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高缺點(diǎn):局限于樣品中總蛋臼的檢測(cè),破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),易受到被測(cè)樣品中其它有機(jī)含氮化合物的干擾凱氏定氮法50比色法-雙縮脲法原理:蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵,故有雙縮脲(NHCO-NH-CO-NH2)反應(yīng)。在堿性條件下,肽鍵的質(zhì)子被解離,Cu2+和失去質(zhì)子的多肽鏈的氮相結(jié)合產(chǎn)生穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物在540~560nm的光吸收值與蛋白質(zhì)的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。由于與雙縮脲試劑與不同種類(lèi)的蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色差別極小,使得該方法比較適合總蛋白質(zhì)的檢測(cè)?！虄?yōu)點(diǎn):操作簡(jiǎn)單、測(cè)量速度快√缺點(diǎn):靈敏度較差,精度不高比色法-雙縮脲法51蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件52蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件53蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件54蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件55蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件56蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件57蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件58蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件59蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件60蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件61蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件62蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件63蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件64蛋白質(zhì)檢測(cè)方法課件65蛋白質(zhì)