大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細胞-何久香課件

威斯騰生物技術(shù)中心大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細胞威斯騰生物技術(shù)中心大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染1（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)（二）腺病毒感染細胞（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)2（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)1、實驗前期準備2、脊髓星形膠質(zhì)細胞的分離3、脊髓星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)3實驗前期準備：實驗器械的高壓滅菌新生鼠的購買培養(yǎng)瓶的包被

（細胞培養(yǎng)前1-2h，培養(yǎng)瓶用0.1％多聚賴氨酸包被，置5％C02培養(yǎng)箱中，使用前用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗干凈，吸盡所有多余的DMEM/F12培養(yǎng)基后備用于種板）實驗前期準備：4脊髓星形膠質(zhì)細胞的分離1、取新生乳鼠6只，75％乙醇皮膚消毒。無菌條件下剪刀斷頭，打開脊椎后取出脊髓組織并置于盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗，盡可能洗掉可能附著的表面血細胞。2、使用眼科鑷細致的剝離皮層表面蛛網(wǎng)膜，并取出脊髓，在該過程中可適當撕開軟脊膜組織一并去掉脊髓組織深面的血管，隨后使用冰預(yù)冷DMEM/F12反復(fù)沖洗。脊髓星形膠質(zhì)細胞的分離53．在玻璃培養(yǎng)皿中用眼科剪將脊髓組織剪碎致直徑0.3mm左右小塊，在剪碎過程中避免擠壓脊髓組織，加入無菌3ml0.25％胰酶，置37℃細胞培養(yǎng)箱中消化30min至渾濁狀。4．加入2-3ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，靜置3min后先用吸管吸去多余液體，再用吸管輕輕地吹打3次，收集細胞懸液，經(jīng)200目的不銹鋼網(wǎng)濾過除去雜質(zhì)，過濾后的細胞懸液移入10ml無菌離心管中，然后800rpm離心7min。3．在玻璃培養(yǎng)皿中用眼科剪將脊髓組織剪碎致直徑0.3mm左65．棄去上清液，然后每管加入2-3ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60min，進行差速粘附貼壁處理，以去除成纖維細胞。6．輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出細胞懸液，種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶；繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接種2-3d后更換新的無菌培養(yǎng)基，隔2-3d換新培養(yǎng)液1次。生長8-10d待細胞融和后，置于37℃恒溫搖床機中，180rpm，14-16h。7．丟棄上清液，收集經(jīng)過搖床震蕩后的貼壁細胞，加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，即可得純度較高的星形膠質(zhì)細胞。5．棄去上清液，然后每管加入2-3ml含10％胎牛血清的D7大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細胞——何久香課件8脊髓星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)細胞換液對于貼壁細胞，首先應(yīng)先吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗2~3次，補加入新培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?。細胞傳代對于貼壁細胞，首先應(yīng)先吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗2~3次，50ml培養(yǎng)瓶加入胰酶消化液約1ml，晃動使消化液鋪均勻，置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見細胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，收集細胞至離心管，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，加培養(yǎng)液，輕輕吹打成細胞懸液，按照1：2或1：3的比例傳代至無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒灐＜顾栊切文z質(zhì)細胞的培養(yǎng)9（二）腺病毒感染細胞確定腺病毒的最佳感染滴度腺病毒感染細胞（二）腺病毒感染細胞10確定腺病毒的最佳病毒滴度（96孔板）準備細胞：8000～10000個細胞/孔接種于96孔板病毒稀釋：在離心管中用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1到10-7病毒感染：將稀釋好的病毒接種到96孔培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100ul；設(shè)正常細胞對照(兩縱排),只加維持液100ul。細胞培養(yǎng)：將培養(yǎng)板放置于CO2培養(yǎng)箱（37℃5%CO2），培養(yǎng)5-7天測定結(jié)果：取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細胞病變，并用Reed-Muench法計算病毒的最佳滴度確定腺病毒的最佳病毒滴度（96孔板）11大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細胞——何久香課件12腺病毒感染細胞準備細胞準備病毒感染細胞腺病毒感染細胞13謝謝！謝謝！14威斯騰生物技術(shù)中心大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細胞威斯騰生物技術(shù)中心大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染15（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)（二）腺病毒感染細胞（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)16（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)1、實驗前期準備2、脊髓星形膠質(zhì)細胞的分離3、脊髓星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)（一）大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)17實驗前期準備：實驗器械的高壓滅菌新生鼠的購買培養(yǎng)瓶的包被

（細胞培養(yǎng)前1-2h，培養(yǎng)瓶用0.1％多聚賴氨酸包被，置5％C02培養(yǎng)箱中，使用前用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗干凈，吸盡所有多余的DMEM/F12培養(yǎng)基后備用于種板）實驗前期準備：18脊髓星形膠質(zhì)細胞的分離1、取新生乳鼠6只，75％乙醇皮膚消毒。無菌條件下剪刀斷頭，打開脊椎后取出脊髓組織并置于盛有DMEM/F12培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中反復(fù)沖洗，盡可能洗掉可能附著的表面血細胞。2、使用眼科鑷細致的剝離皮層表面蛛網(wǎng)膜，并取出脊髓，在該過程中可適當撕開軟脊膜組織一并去掉脊髓組織深面的血管，隨后使用冰預(yù)冷DMEM/F12反復(fù)沖洗。脊髓星形膠質(zhì)細胞的分離193．在玻璃培養(yǎng)皿中用眼科剪將脊髓組織剪碎致直徑0.3mm左右小塊，在剪碎過程中避免擠壓脊髓組織，加入無菌3ml0.25％胰酶，置37℃細胞培養(yǎng)箱中消化30min至渾濁狀。4．加入2-3ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，靜置3min后先用吸管吸去多余液體，再用吸管輕輕地吹打3次，收集細胞懸液，經(jīng)200目的不銹鋼網(wǎng)濾過除去雜質(zhì)，過濾后的細胞懸液移入10ml無菌離心管中，然后800rpm離心7min。3．在玻璃培養(yǎng)皿中用眼科剪將脊髓組織剪碎致直徑0.3mm左205．棄去上清液，然后每管加入2-3ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，接種于培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育60min，進行差速粘附貼壁處理，以去除成纖維細胞。6．輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出細胞懸液，種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶；繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接種2-3d后更換新的無菌培養(yǎng)基，隔2-3d換新培養(yǎng)液1次。生長8-10d待細胞融和后，置于37℃恒溫搖床機中，180rpm，14-16h。7．丟棄上清液，收集經(jīng)過搖床震蕩后的貼壁細胞，加新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，即可得純度較高的星形膠質(zhì)細胞。5．棄去上清液，然后每管加入2-3ml含10％胎牛血清的D21大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)及腺病毒感染細胞——何久香課件22脊髓星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng)細胞換液對于貼壁細胞，首先應(yīng)先吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗2~3次，補加入新培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?。細胞傳代對于貼壁細胞，首先應(yīng)先吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗2~3次，50ml培養(yǎng)瓶加入胰酶消化液約1ml，晃動使消化液鋪均勻，置37度培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見細胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，收集細胞至離心管，1000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，加培養(yǎng)液，輕輕吹打成細胞懸液，按照1：2或1：3的比例傳代至無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒灐＜顾栊切文z質(zhì)細胞的培養(yǎng)23（二）腺病毒感染細胞確定腺病毒的最佳感染滴度腺病毒感染細胞（二）腺病毒感染細胞24確定腺病毒的最佳病毒滴度（96孔板）準備細胞：8000～10000個細胞/孔接種于96孔板病毒稀釋：在離心管中用維持液將病毒液作連續(xù)10倍的稀釋，從10-1到10-7病毒感染：將稀釋好的病毒接種到96孔培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種100ul；設(shè)正常細胞對照(兩縱排),只加維持液100ul。細胞培養(yǎng)：將培養(yǎng)