w1.1《DNA重組技術(shù)的基本工具》(新人教選修3)課件

基因工程專(zhuān)題1每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。1979年，美國(guó)將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——據(jù)WTO調(diào)查：2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國(guó)約6000萬(wàn)。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達(dá)。這些性狀的表達(dá)與我們學(xué)過(guò)的基因的什么過(guò)程有關(guān)？密碼子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白質(zhì)(性狀)轉(zhuǎn)錄翻譯通用基因工程的產(chǎn)物基因工程的概念DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論達(dá)爾文提出生物進(jìn)化論基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論孟德?tīng)柼岢龌虻姆蛛x定律和自由組合定律基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路早期基礎(chǔ)理論

摩爾根證明基因在染色體上，并提出基因的連鎖互換定律?；A(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路后期基礎(chǔ)理論克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制基礎(chǔ)理論和技術(shù)發(fā)展催生了基因工程科技探索之路1)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)

2)工具酶的發(fā)現(xiàn)

3)DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明

4)DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)

5)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功

6)第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問(wèn)世

7)PCR技術(shù)的發(fā)明問(wèn)題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲(chóng)害的抗蟲(chóng)棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：在以上過(guò)程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲(chóng)基因通過(guò)運(yùn)載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因棉花含抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)基因棉花產(chǎn)生伴胞晶體轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲(chóng)特性基因工程培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與載體“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉花細(xì)胞解決培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與載體“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車(chē)”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體?DNA重組技術(shù)的基本工具尋根問(wèn)底?限制酶存在于原核生物中的作用是什么？原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。思考與探究P7（2）?為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開(kāi)。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。⒉種類(lèi)與命名：現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠSmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）大腸桿菌（EscherichiacoliR）Goback練習(xí)：流感嗜血桿菌的d菌株(Haemophilusinfluenzaed)中先后分離到3種限制酶，則分別命名為:HindⅠ、HindⅡ和HindⅢT磷酸二酯鍵1234512345A限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵打開(kāi)形成兩條單鏈Goback限制酶的識(shí)別序列：Goback能被限制性內(nèi)切酶特異性識(shí)別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ(chēng)、重復(fù)排列的。想一想限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？

EcoRⅠ黏性末端黏性末端

EcoRⅠ黏性末端黏性末端重復(fù)演示什么叫黏性末端？被限制酶切開(kāi)的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。SmaⅠ平末端平末端Goback要想獲得某個(gè)特定性狀的基因必須要用限制酶切幾個(gè)切口？可產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端？要切兩個(gè)切口，產(chǎn)生四個(gè)黏性末端。如果把兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，會(huì)怎樣呢？

會(huì)產(chǎn)生相同的黏性末端，然后讓兩者的黏性末端黏合起來(lái)，就似乎可以合成重組的DNA分子了。二、“分子縫合針”——DNA連接酶①作用:把切下來(lái)的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來(lái).②作用原理：催化磷酸二酯鍵形成可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來(lái)，但效率較低T4DNA連接酶③類(lèi)型：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來(lái)源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別尋根問(wèn)底DNA連接酶與DNA聚合酶的異同不同點(diǎn)：1.都形成磷酸二酯鍵1)DNA聚合酶：需要模板，連接單個(gè)核苷酸形成互補(bǔ)單鏈2)DNA連接酶：不需要模板，連接DNA片段形成雙鏈DNA2.化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)（但組成和性質(zhì)各不相同）相同點(diǎn)：三、“分子運(yùn)輸車(chē)”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體1、載體的作用將

轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。目的基因2、種類(lèi)質(zhì)粒（常用），最常用的質(zhì)粒是大腸桿菌的）λ噬菌體的衍生物動(dòng)植物病毒3、載體需要的條件：⑴有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。⑵對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害⑶能夠在受體細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定地保存⑷有某些標(biāo)記基因，便于篩選⑶假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制，轉(zhuǎn)基因生物能有預(yù)想的效果嗎？⑴作為分子運(yùn)輸車(chē)——載體，如果沒(méi)有切割位點(diǎn)將會(huì)怎樣？⑵霍亂菌的質(zhì)粒多個(gè)限制酶切點(diǎn)，你會(huì)用它來(lái)做分子運(yùn)輸車(chē)嗎？

⑷目的基因有沒(méi)有進(jìn)入受體細(xì)胞，如何去發(fā)現(xiàn)？

1）質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并且具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。4、質(zhì)粒是基因工程最常用的載體。

2）質(zhì)粒DNA上有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，供外源DNA片段（基因）插入其中。

3）攜帶外源DNA片段的質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，在細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA進(jìn)行同步復(fù)制。

4）質(zhì)粒DNA上有特殊的標(biāo)記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別5）真正被用作載體的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行人工改造的。27483615天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P71）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制的能力。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究P7什么是內(nèi)含子和外顯子？原核細(xì)胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的，真核細(xì)胞基因的編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的.真核生物基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：“編碼區(qū)是間隔的、不連續(xù)的?！币簿褪钦f(shuō)：能夠編碼蛋白質(zhì)的序列被不能編碼蛋白質(zhì)的序列分隔開(kāi)來(lái)，成為一種斷裂的形式。其中，能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫外顯子，不能編碼蛋白質(zhì)的序列叫內(nèi)含子。真核基因包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)，編碼區(qū)又分為外顯子和內(nèi)含子,內(nèi)含子不翻譯蛋白質(zhì)。知識(shí)拓展什么是內(nèi)含子和外顯子？在遺傳學(xué)上通常將能編碼蛋白質(zhì)的基因稱(chēng)為結(jié)構(gòu)基因。真核生物的結(jié)構(gòu)基因是斷裂的基因。一個(gè)斷裂基因能夠含有若干段編碼序列，這些可以編碼的序列稱(chēng)為外顯子。在兩個(gè)外顯子之間被一段不編碼的間隔序列隔開(kāi)，這些間隔序列稱(chēng)為內(nèi)含子。內(nèi)含子（Interveningregion）是一個(gè)基因中非編碼DNA片斷，它分開(kāi)相鄰的外顯子。更精確的定義是：內(nèi)含子是阻斷基因線性表達(dá)的序列。DNA上的內(nèi)含子會(huì)被轉(zhuǎn)錄到前體RNA中，但RNA上的內(nèi)含子會(huì)在RNA離開(kāi)細(xì)胞核進(jìn)行轉(zhuǎn)譯前被剪除。在成熟mRNA被保留下來(lái)的基因部分被稱(chēng)為外顯子。真核生物的基因含有外顯子和內(nèi)含子，是前者區(qū)別原核生物的特征之一。知識(shí)拓展知識(shí)拓展關(guān)于內(nèi)含子和外顯子的說(shuō)法正確的是（）A.內(nèi)含子和外顯子在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中都能夠轉(zhuǎn)錄成成熟的mRNA

B.只有外顯子能夠轉(zhuǎn)