相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件

蛋白質(zhì)相互作用研究方法、酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)三、細(xì)胞共定位技術(shù)四、GSTPull-dow技術(shù)五、FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù))六、BiFC(雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù))七、TAP(串聯(lián)親和純化技術(shù))八、Far-Westernblot(親和印跡技術(shù))蛋白質(zhì)相互作用研究方法1、酵母雙雜交技術(shù)1.基本概述2.基本過程3.應(yīng)用與優(yōu)缺點(diǎn)、酵母雙雜交技術(shù)2基本概述酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白質(zhì)該系統(tǒng)利用了酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4,含有的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,DNA結(jié)合域①dNAbindingdomain,BD)及轉(zhuǎn)錄激活域(activationdomain,AD),將已知基因(誘餌基因)和靶基因分別構(gòu)建在含BD及AD質(zhì)粒載體上,將兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞,若BD結(jié)合的誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合的靶蛋白或文庫中的某些cDNA編碼的蛋白相互作用、彼此間結(jié)合時(shí),則會(huì)導(dǎo)致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近,呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的完全活性,激活下游的報(bào)告基因表達(dá),從而在特定的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)BaittranscriptionDNA-BDGALUASminimalpromoter基本概述3原理示意圖靶蛋白結(jié)合對(duì)象DNA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域蛋白把分別編碼“誘餌”和“獵物”的重組基因引入酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞捕獲獵物1誘餌轉(zhuǎn)錄激活子↓報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)報(bào)告基因表達(dá)的蛋白原理示意圖4MCSSV40NLSpGBKT778A0M)TLmppGADT7AD7.3kbHATag7988bpHLEUZ△c-MycepitopetagMCS5AH109ConstructsGALIUASGALITATAHIS3GALZUASGAL2TATAADEZMELTUASMELITATAMELlUASMEL1TATAMEL1His3是編碼組氨酸合成的基因,3-AT是它的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑;ADE2是編碼腺苷酸合成酶的基因。lacZ是編碼β-半乳糖苷酶的基因,可以用β半乳糖實(shí)驗(yàn)測(cè)定活性。MEL1編碼α-半乳糖苷酶,可以降解X-α-Gal,產(chǎn)生藍(lán)色。GAL1,GAL2和MEL1的上游激活序列(UAS)應(yīng)答于GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子。AH09衍生于PJ69-2A菌株,包括ADE2,HS3營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記和一個(gè)內(nèi)源的MEL基因,lacZ報(bào)告基因被引入PJ69-2A而得到AH109菌株AH109Constructs6基本過程構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體醋酸鋰轉(zhuǎn)化法PGBKT7-BaitPGADT7-Prey轉(zhuǎn)化酵母AH109(或直接提質(zhì)粒)菌株感受態(tài)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母AH109拿測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Pey菌株自激活菌株感受態(tài)BLAST找出相應(yīng)基因驗(yàn)證Bai菌株自激活對(duì)陽性克隆進(jìn)行將BD-Bait與AD-Pre驗(yàn)證ColonyPCr后測(cè)序用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株感受態(tài),涂到含BDB酵母與文庫中冷缺陷培養(yǎng)基檢測(cè)三缺培養(yǎng)基上驗(yàn)證酵母混合培養(yǎng)形成二相互作用也可用其他方法驗(yàn)證「倍體在三缺培養(yǎng)基篩選基本過程7ncbi.nlm.nihgov/ATGGCGTCTTACCAGAACCGTCCAGGAGGTCAGGCCACTGACGAGTACGGAAACCCGATCCAGCAGCAGTATGACGAGTACGGAAATCCGATGGGAGGAGGAGGATACGGAACTGGTGGTGGTGGAGGAGCTACAGGTGGCCAAGGATACGGAACAGGTGGCCAAGGGTACGGATCAGGTGGCCAAGGGTACGGAACCGGTGGCCAAGGATACGGAACCGGGACCGGGACTGAAGGCTTTGGAACTGGCGGGCTTGGGAGGAATGCTTCACCGCTCCGGATCTGGATCCAGCTCTAGCTCTCAAGGAGAAGTTGCCAGGTCATCATGATCAGTCTGGTCAAGCTCAAGCGATGGGCGGCATGGGATCCGGATATGATGCTGGTGGCTACGGTGGTGAGCACCACGAGAAGAAGGGGATGATGGACAAGATCAAGGAAAAGCTTCCCGGTGGTGGCCGTTAAncbi.nlm.nihgov/8應(yīng)用·發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用建立基因組蛋白連鎖圖應(yīng)用9優(yōu)點(diǎn)1.快速獲得相互作用蛋白質(zhì)的基因;2.檢測(cè)在真核活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況3.作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后,在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟;4.檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng),因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用;優(yōu)點(diǎn)10相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件11相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件12相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件13相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件14相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件15相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件16相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件17相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件18相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件19相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件20相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件21相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件22相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件23相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件24相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件25相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件26相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件27相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件28相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件29相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件30相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件31相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件32相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件33相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件34相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件35相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件36相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件37相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件38相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件39相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件40相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件41相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件42相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件43相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件44蛋白質(zhì)相互作用研究方法、酵母雙雜交技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)三、細(xì)胞共定位技術(shù)四、GSTPull-dow技術(shù)五、FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù))六、BiFC(雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù))七、TAP(串聯(lián)親和純化技術(shù))八、Far-Westernblot(親和印跡技術(shù))蛋白質(zhì)相互作用研究方法45、酵母雙雜交技術(shù)1.基本概述2.基本過程3.應(yīng)用與優(yōu)缺點(diǎn)、酵母雙雜交技術(shù)46基本概述酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeasttwo-hybridsystem,Y2H是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白質(zhì)該系統(tǒng)利用了酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4,含有的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域,DNA結(jié)合域①dNAbindingdomain,BD)及轉(zhuǎn)錄激活域(activationdomain,AD),將已知基因(誘餌基因)和靶基因分別構(gòu)建在含BD及AD質(zhì)粒載體上,將兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞,若BD結(jié)合的誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合的靶蛋白或文庫中的某些cDNA編碼的蛋白相互作用、彼此間結(jié)合時(shí),則會(huì)導(dǎo)致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近,呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的完全活性,激活下游的報(bào)告基因表達(dá),從而在特定的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)BaittranscriptionDNA-BDGALUASminimalpromoter基本概述47原理示意圖靶蛋白結(jié)合對(duì)象DNA結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域蛋白把分別編碼“誘餌”和“獵物”的重組基因引入酵母細(xì)胞酵母細(xì)胞捕獲獵物1誘餌轉(zhuǎn)錄激活子↓報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)報(bào)告基因表達(dá)的蛋白原理示意圖48MCSSV40NLSpGBKT778A0M)TLmppGADT7AD7.3kbHATag7988bpHLEUZ△c-MycepitopetagMCS49AH109ConstructsGALIUASGALITATAHIS3GALZUASGAL2TATAADEZMELTUASMELITATAMELlUASMEL1TATAMEL1His3是編碼組氨酸合成的基因,3-AT是它的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑;ADE2是編碼腺苷酸合成酶的基因。lacZ是編碼β-半乳糖苷酶的基因,可以用β半乳糖實(shí)驗(yàn)測(cè)定活性。MEL1編碼α-半乳糖苷酶,可以降解X-α-Gal,產(chǎn)生藍(lán)色。GAL1,GAL2和MEL1的上游激活序列(UAS)應(yīng)答于GAL4轉(zhuǎn)錄激活因子。AH09衍生于PJ69-2A菌株,包括ADE2,HS3營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記和一個(gè)內(nèi)源的MEL基因,lacZ報(bào)告基因被引入PJ69-2A而得到AH109菌株AH109Constructs50基本過程構(gòu)建表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體醋酸鋰轉(zhuǎn)化法PGBKT7-BaitPGADT7-Prey轉(zhuǎn)化酵母AH109(或直接提質(zhì)粒)菌株感受態(tài)醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母AH109拿測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Pey菌株自激活菌株感受態(tài)BLAST找出相應(yīng)基因驗(yàn)證Bai菌株自激活對(duì)陽性克隆進(jìn)行將BD-Bait與AD-Pre驗(yàn)證ColonyPCr后測(cè)序用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化酵母AH109菌株感受態(tài),涂到含BDB酵母與文庫中冷缺陷培養(yǎng)基檢測(cè)三缺培養(yǎng)基上驗(yàn)證酵母混合培養(yǎng)形成二相互作用也可用其他方法驗(yàn)證「倍體在三缺培養(yǎng)基篩選基本過程51ncbi.nlm.nihgov/ATGGCGTCTTACCAGAACCGTCCAGGAGGTCAGGCCACTGACGAGTACGGAAACCCGATCCAGCAGCAGTATGACGAGTACGGAAATCCGATGGGAGGAGGAGGATACGGAACTGGTGGTGGTGGAGGAGCTACAGGTGGCCAAGGATACGGAACAGGTGGCCAAGGGTACGGATCAGGTGGCCAAGGGTACGGAACCGGTGGCCAAGGATACGGAACCGGGACCGGGACTGAAGGCTTTGGAACTGGCGGGCTTGGGAGGAATGCTTCACCGCTCCGGATCTGGATCCAGCTCTAGCTCTCAAGGAGAAGTTGCCAGGTCATCATGATCAGTCTGGTCAAGCTCAAGCGATGGGCGGCATGGGATCCGGATATGATGCTGGTGGCTACGGTGGTGAGCACCACGAGAAGAAGGGGATGATGGACAAGATCAAGGAAAAGCTTCCCGGTGGTGGCCGTTAAncbi.nlm.nihgov/52應(yīng)用·發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白質(zhì)鑒定和分析已有的蛋白質(zhì)間的相互作用建立基因組蛋白連鎖圖應(yīng)用53優(yōu)點(diǎn)1.快速獲得相互作用蛋白質(zhì)的基因;2.檢測(cè)在真核活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況3.作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后,在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的,省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟;4.檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的累積效應(yīng),因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用;優(yōu)點(diǎn)54相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件55相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件56相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件57相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件58相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件59相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件60相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件61相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件62相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件63相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件64相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件65相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件66相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件67相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件68相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件69相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)課件70