DNA重組之目的基因的分離課件

ReviewReview1第三部分目的基因的分離目的序列已知：一般采用PCR技術(shù)或分子雜交技術(shù)分離克隆目的基因目的序列未知：差異表達(dá)序列無差異表達(dá)的目的序列，可采用文庫篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法第三部分目的基因的分離目的序列已知：目的序列未知：2一、目的基因的功能克隆根據(jù)蛋白質(zhì)的基本生化特性這一功能信息，在獲知基因的功能后克隆其具體作法是:在純化相應(yīng)的編碼蛋白后構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫，然后從文庫中篩選目的基因(1)將純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸測序，據(jù)此合成寡核苷酸探針從cDNA庫或基因組文庫中篩選編碼基因(2)將相應(yīng)的編碼蛋白制成相應(yīng)抗體探針，從cDNA表達(dá)文庫中篩選相應(yīng)克隆。一、目的基因的功能克隆根據(jù)蛋白質(zhì)的基本生化特性這一功能信息，3二、序列克隆法根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因采用核酸探針雜交篩選或用PCR技術(shù)進(jìn)行分離二、序列克隆法根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因4三、差別雜交法適用范圍：組織特異性表達(dá)或特定發(fā)育階段表達(dá)的基因受生長因子調(diào)節(jié)的基因經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因應(yīng)用前提：基因在兩種不同的細(xì)胞群體中的差異性表達(dá)（一個細(xì)胞群體中正常表達(dá)，另一個細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)）。三、差別雜交法適用范圍：應(yīng)用前提：基因在兩種不同的細(xì)胞群體中5基本過程制備兩種細(xì)胞群體的的mRNA提取物以兩種總mRNA或cDNA為探針以表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建cDNA文庫有目的基因表達(dá)的mRNA探針，重組體菌落陽性反應(yīng)目的基因不表達(dá)的mRNA探針，除目的基因之外，其余菌落都為陽性反應(yīng)比較底片，對照原板，可挑選出含選目的基因的菌落基本過程制備兩種細(xì)胞群體的的mRNA提取物6cDNA文庫母板目的基因有表達(dá)目的基因無表達(dá)無有無有說明含目的基因說明含目的基因cDNA文庫母板目的基因有表達(dá)目的基因無表達(dá)無有無有說明含目7四、減法雜交技術(shù)又稱差減雜交、扣除雜交、減數(shù)雜交、消減雜交本質(zhì)：盡量去除兩種樣品中普遍共同存在的基因序列，從而使目的基因序列得到有效的富集，從而提高基因篩選分離的敏感性兩種策略：mRNA減法雜交基因組減法雜交四、減法雜交技術(shù)又稱差減雜交、扣除雜交、減數(shù)雜交、消減雜交8mRNA減法雜交提取表達(dá)目的基因的細(xì)胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA提取不表達(dá)目的基因的細(xì)胞mRNA過量雜交兩種組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成cDNA/mRNA雜交分子特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段仍保持單鏈mRNA減法雜交提取表達(dá)目的基因的細(xì)胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cD9減數(shù)雜交技術(shù)分離差異表達(dá)基因DNA/RNA雜交分子可結(jié)合在羥基磷灰石柱上，而游離的單鏈cDNA則過柱流出?；厥盏腸DNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA后克隆倒適當(dāng)?shù)妮d體中，就成為一個減數(shù)文庫。減數(shù)雜交技術(shù)分離DNA/RNA雜交分子可結(jié)合在羥基磷灰石柱上10五、mRNA差別顯示技術(shù)又稱為差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR）目的序列未知，1992年由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)分校Dena-Farber研究所的兩位科學(xué)家Liang和Pardee首次提出的，并運(yùn)用這種方法來分離一對培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中差別表達(dá)的基因。至今，運(yùn)用mRNA差別顯示技術(shù)分離、鑒定的差別表達(dá)基因大約有300多個。五、mRNA差別顯示技術(shù)又稱為差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT113’端錨定引物錨定引物的通式是oligo(dT)12MN，其中M為A、C、G中的任意一種，N為A、C、G或T中的任意一種，所以共有12種oligo(dT)12MN引物，用這12種引物分別對同一總RNA樣品進(jìn)行cDNA合成，即進(jìn)行12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每一種3’端錨定引物，都能夠把總mRNA群體的1／12分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。這樣可以將整個mRNA群體在cDNA水平上，分成大致相等但序列結(jié)構(gòu)不同的12份亞群體。這一過程叫做差異顯示反轉(zhuǎn)錄，即DDRT。3’端錨定引物錨定引物的通式是oligo(dT)12MN，125’端隨機(jī)引物另外，還需要另外一種由10個核苷酸組成的5’端隨機(jī)引物。這種5’隨機(jī)引物可以同特定細(xì)胞類型的總mRNA群體中的一部分分子發(fā)生雜交作用，而且雜交部位是隨機(jī)地分布在距每條新合成的cDNA鏈3’端的不同位置上。用3’端錨定引物和5’隨機(jī)引物組成的引物對，以mRNA/cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后經(jīng)過2～3h的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以顯示出在100～500bp之間的DNA條帶5’端隨機(jī)引物另外，還需要另外一種由10個核苷酸組成的5’端1320種5’端隨機(jī)引物12種3’端錨定引物240組引物，進(jìn)行PCRPCR過程中加入放射性標(biāo)記變型聚丙烯酰氨凝膠電泳放射自顯影顯示差異表達(dá)條帶對差異表達(dá)條帶進(jìn)行割膠回收并制備成探針，從文庫中篩選20種5’端隨機(jī)引物14差別顯示分析基本流程差別顯示分析基本流程15基本程序提取兩種細(xì)胞的總mRNA,反轉(zhuǎn)錄后成為2種cDNA以一定的引物作隨機(jī)聚合酶鏈反應(yīng)通過擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析,分離出不同樣品間的差異條帶將差異DNA做成探針在cDNA文庫或基因組文庫中篩選基因并作功能分析

基本程序提取兩種細(xì)胞的總mRNA,反轉(zhuǎn)錄后成為2種cDNA16優(yōu)點(diǎn)：幾乎可檢測細(xì)胞表達(dá)的所有基因可同時比較多種細(xì)胞類型可同時展現(xiàn)所有差異用量少，操作簡單，快速高效優(yōu)點(diǎn)：幾乎可檢測細(xì)胞表達(dá)的所有基因17缺點(diǎn)：12種錨定引物和20種隨機(jī)引物，240次PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳分離片段小于500bp有些差別條帶成簇出現(xiàn)，造成假陽性缺乏定量分析手段，判斷差異條帶有難度缺點(diǎn)：12種錨定引物和20種隨機(jī)引物，240次PCR18第六章DNA重組的操作第六章DNA重組的操作19第一節(jié)受體細(xì)胞易于重組DNA分子的導(dǎo)入能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中便于重組體的篩選遺傳穩(wěn)定性高安全性高有利于外源基因的高效分泌表達(dá)在遺傳密碼的應(yīng)用上無偏倚性具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制有較高的應(yīng)用價(jià)值第一節(jié)受體細(xì)胞易于重組DNA分子的導(dǎo)入201、原核生物細(xì)胞是較為理想的受體細(xì)胞

大多原核生物沒有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁沒有核膜，有利于外源片斷重組基因組簡單，便于對外源基因進(jìn)行遺傳分析多為單細(xì)胞生物，繁殖迅速，過程簡單1、原核生物細(xì)胞是較為理想的受體細(xì)胞大多原核生物沒有堅(jiān)硬的21缺陷：以原核生物表達(dá)真核生物基因存在問題，很多真核生物基因不能在E.coli中表達(dá)具生物活性的功能蛋白。

缺乏真核生物蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)缺乏蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)原核生物內(nèi)源蛋白易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定缺陷：以原核生物表達(dá)真核生物基因存在問題，很多真核生物基因不22常用受體菌：大腸桿菌人胰島素、生長素、干擾素等枯草桿菌人β干擾素、白細(xì)胞介素乙肝病毒核心抗原等藍(lán)藻易于表達(dá)植物基因常用受體菌：大腸桿菌人胰島素、生長素、232、真菌細(xì)胞低等真核生物酵母菌：以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核微生物，易于表達(dá)外源真核基因

基因結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素培養(yǎng)簡單可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外2、真菌細(xì)胞低等真核生物酵母菌：以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖243、植物細(xì)胞

堅(jiān)硬的細(xì)胞壁纖維素酶處理－原生質(zhì)體攝取外源片斷全能性：在合適的培養(yǎng)條件下，一個分離的活細(xì)胞可分化成植株。水稻，棉花，玉米，馬鈴薯，煙草等3、植物細(xì)胞堅(jiān)硬的細(xì)胞壁全能性：在合適的培養(yǎng)條件下，一個分254、動物細(xì)胞早期：生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞現(xiàn)在：體細(xì)胞培養(yǎng)動物：豬、羊、牛、魚、鼠、猴等生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)動物疫苗動物品種的遺傳改良人類疾病的基因治療4、動物細(xì)胞早期：生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞動物：26第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞272.1重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌

轉(zhuǎn)化（transformation）定義轉(zhuǎn)化微生物的種類感受態(tài)細(xì)胞P139轉(zhuǎn)化過程供體（donor）：提供DNA的生物受體（recipientorhost）：獲得DNA的生物2.1重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化（trans281.定義轉(zhuǎn)化：受體菌直接吸收供體菌的DNA片斷而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子（transformant）：通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代。2.轉(zhuǎn)化微生物的種類

首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象肺炎鏈球菌（Griffith,1928）

嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、根瘤菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬等。1.定義293.感受態(tài)（competence）感受態(tài)：指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片斷并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。感受態(tài)是細(xì)菌的一種遺傳特性，而且也受生長階段、培養(yǎng)條件的影響。肺炎鏈球菌對數(shù)生長后期芽孢桿菌屬指數(shù)期末和穩(wěn)定期大腸桿菌剛進(jìn)入對數(shù)期DH5α菌株的OD600為0.5時,細(xì)胞密度在5×107個/ml左右3.感受態(tài)（competence）DH5α菌株的OD60030大腸桿菌革蘭氏陰性菌細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)和組成與革蘭氏陽性菌不同轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難人工制備感受態(tài)細(xì)胞4.轉(zhuǎn)化過程大腸桿菌4.轉(zhuǎn)化過程31大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法：Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法電穿孔轉(zhuǎn)化法三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法：321、Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)生命活動旺盛的菌體菌種分純活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期沉淀菌體冰水浴中預(yù)冷10分鐘，4℃離心

化合物處理含CaCl2無菌預(yù)冷緩沖液處理DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞1、Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)生命活動旺盛的菌體33制備感受態(tài)細(xì)胞的注意事項(xiàng)1.細(xì)胞生長狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或－20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時,細(xì)胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。制備感受態(tài)細(xì)胞的注意事項(xiàng)1.細(xì)胞生長狀態(tài)和密度:342.質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。

2.質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:353.試劑的質(zhì)量:

所用的試劑,如CaCl2等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。3.試劑的質(zhì)量:364.防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。

4.防止雜菌和雜DNA的污染：37感受態(tài)細(xì)胞的制備1、挑取平板上的大腸桿菌單菌落接種于2mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜2、按1％的接種量接種于3mL新鮮LB培養(yǎng)液，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6(可見霧狀)3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4℃下12,000rpm離心1min，倒出培養(yǎng)液，用無菌濾紙盡量吸干4、加入1mL預(yù)冷的無菌0.1mol·L-1CaCl2溶液渦旋，4℃下12,000rpm離心30秒,盡量去除上清5、沉淀以50-100μL預(yù)冷的0.1mol·L-1CaCl2重懸，4℃保存?zhèn)溆茫?d內(nèi)可用。感受態(tài)細(xì)胞的制備1、挑取平板上的大腸桿菌單菌落接種于2mL38細(xì)胞的轉(zhuǎn)化2ul重組DNA50ul感受態(tài)細(xì)胞混勻＋↓冰浴30min42℃熱激90～120S↓↓冰浴2min復(fù)蘇：加入450ul液態(tài)LB培養(yǎng)基，37℃輕緩振蕩培養(yǎng)（150rpm），1.5～2h↓→取30～50ul，涂布在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上，平板培養(yǎng)挑取單菌落，于含相應(yīng)抗生素的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取一定量提取質(zhì)粒，進(jìn)行鑒定（酶切、雜交、測序等）↑細(xì)胞的轉(zhuǎn)化2ul重組DNA50ul感受態(tài)細(xì)胞混勻＋↓冰浴3039CaCl2的誘導(dǎo)原因：在0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，Ca2＋使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中部分核酸酶解離，誘導(dǎo)形成感受態(tài)Ca2＋能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物，黏附在胞膜的外表面；42℃熱激處理，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生擾動，出現(xiàn)間隙。CaCl2的誘導(dǎo)原因：在0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)40提高轉(zhuǎn)化效率的因素：MgCl2與CaCl2共同處理二甲基亞楓（DMSO）、二硫蘇糖醇（DTT）

提高100～1000倍，易污染RbCl、MnCl2、LiCl和KCl等與CaCl2多鹽處理提高轉(zhuǎn)化效率的因素：41對照處理：

DNA對照處理：無菌水代替感受態(tài)細(xì)胞，檢驗(yàn)DNA溶液感受態(tài)細(xì)胞對照處理：NTE緩沖液代替DNA溶液，檢驗(yàn)感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞有效性對照處理：加入已知的容易轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA原因：轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽性對照處理：原因：轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，422、電穿孔轉(zhuǎn)化法（P140）基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，促進(jìn)外源DNA的有效吸收。影響因素：電場強(qiáng)度，電脈沖時間，外源DNA濃度

菌體制備冷卻，離心，洗滌（降低離子強(qiáng)度）10％甘油重懸細(xì)胞，-70℃貯存低溫下（0－4℃）進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化2、電穿孔轉(zhuǎn)化法（P140）基本原理：利用高壓電脈沖作用，在433、三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)非接合質(zhì)粒的遷移作用而建立，目前常用的載體多是在非接合型質(zhì)?；蛉鄙倭私雍限D(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上而構(gòu)建的。

待轉(zhuǎn)化的受體菌含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒的供體菌含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌（如：輔助菌株E.coli(pRK2013)）3、三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)非接合質(zhì)粒的遷移作用而建立444、轉(zhuǎn)化率：DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率

以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的比率表示以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)的比率表示P1504、轉(zhuǎn)化率：以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的45影響轉(zhuǎn)化率的因素：

重組DNA分子質(zhì)量較小，親和性強(qiáng)，雙螺旋閉合結(jié)構(gòu)受體細(xì)胞受體細(xì)胞的選擇非常重要轉(zhuǎn)化手段電穿孔法>Ca誘導(dǎo)法>三親本雜交法影響轉(zhuǎn)化率的因素：重組DNA462.2重組λDNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)染：將重組λDNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過λ噬菌體顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。P142轉(zhuǎn)化:1392.2重組λDNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)染：472.3重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞(P144)（1）農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法

革蘭氏陰性菌作用機(jī)制：將待轉(zhuǎn)移的目的基因組入農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒載體農(nóng)桿菌識別敏感植物，將Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)部2.3重組DNA分子導(dǎo)入植物細(xì)胞(P144)（1）48

選擇合適的外植體

根據(jù)受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力來決定

農(nóng)桿菌的接種操作（接種到損傷切面，使農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)）

洗菌并篩選培養(yǎng)（無菌水清洗共培養(yǎng)后的外植體，無菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，殺死或抑制附著于表面的農(nóng)桿菌）農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化植物的基本程序：選擇合適的外植體農(nóng)桿菌介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)化植物的基本程序：49創(chuàng)傷植株感染法（植株接種共轉(zhuǎn)化法）共培養(yǎng)感染法葉盤轉(zhuǎn)化法植物愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法植物懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法常用方法：創(chuàng)傷植株感染法（植株接種共轉(zhuǎn)化法）常用方法：50創(chuàng)傷植株感染法

（植株接種共轉(zhuǎn)化法）在整體植株上造成創(chuàng)傷農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面或針頭注射農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌以天然的感染過程在植株體內(nèi)感染獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織創(chuàng)傷植株感染法

（植株接種共轉(zhuǎn)化法）在整體植株上造成創(chuàng)傷51DNA重組之目的基因的分離課件52共培養(yǎng)感染法葉盤轉(zhuǎn)化法植物愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法植物懸浮細(xì)胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法共培養(yǎng)感染法葉盤轉(zhuǎn)化法53葉盤轉(zhuǎn)化法葉子表面進(jìn)行消毒，再用消毒過的不銹鋼打孔器從葉子上取下圓形小片

接種處理，放在農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中浸泡數(shù)秒鐘

濾紙吸干，看護(hù)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)培養(yǎng)兩天后，濾紙連同葉盤轉(zhuǎn)移到含有選擇藥物的“長芽”培養(yǎng)基中，篩選與再生培養(yǎng)轉(zhuǎn)移到“生根”培養(yǎng)基上誘導(dǎo)幼芽生根葉盤轉(zhuǎn)化法葉子表面進(jìn)行消毒，再用消毒過的不銹鋼打孔器從葉54DNA重組之目的基因的分離課件55植物愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)抗生素篩選培養(yǎng)誘導(dǎo)分化植株再生植物愈傷組織共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法愈傷組織與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)56（2）DNA的直接轉(zhuǎn)移法多聚物介導(dǎo)法電穿孔轉(zhuǎn)化法激光微束穿孔轉(zhuǎn)化法顯微注射法超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

基因槍法脂質(zhì)體介導(dǎo)法花粉管通道法（2）DNA的直接轉(zhuǎn)移法多聚物介導(dǎo)法超聲波介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法57基因槍法P146將DNA吸附在由鎢制作的微型子彈(直徑約為1.2um)表面通過特制的手槍，將子彈高速射入完整的細(xì)胞和組織內(nèi)轉(zhuǎn)化效率與射擊距離、真空度、子彈速度、子彈數(shù)目以及CaCl2和亞精胺(使子彈吸附在DNA上)的濃度等因素有關(guān)

避開原生質(zhì)體再生植株的難關(guān)，單子葉植物基因轉(zhuǎn)移的有效途徑?；驑尫≒146將DNA吸附在由鎢制作的微型子彈(直徑58DNA重組之目的基因的分離課件59DNA重組之目的基因的分離課件602.4重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞P148磷酸鈣轉(zhuǎn)染法DEAE－葡聚糖轉(zhuǎn)染法聚陽離子－DMSO轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導(dǎo)法病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染生化轉(zhuǎn)染物理轉(zhuǎn)染

病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法顯微注射法電穿孔法2.4重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞P148磷酸61要點(diǎn)轉(zhuǎn)化？轉(zhuǎn)染？轉(zhuǎn)導(dǎo)？感受態(tài)細(xì)胞？大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞如何制備？Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化和電擊轉(zhuǎn)化？植物基因工程中的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法？植物基因工程中外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的方法？動物基因工程中外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的方法？要點(diǎn)轉(zhuǎn)化？轉(zhuǎn)染？轉(zhuǎn)導(dǎo)？62演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！63ReviewReview64第三部分目的基因的分離目的序列已知：一般采用PCR技術(shù)或分子雜交技術(shù)分離克隆目的基因目的序列未知：差異表達(dá)序列無差異表達(dá)的目的序列，可采用文庫篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法第三部分目的基因的分離目的序列已知：目的序列未知：65一、目的基因的功能克隆根據(jù)蛋白質(zhì)的基本生化特性這一功能信息，在獲知基因的功能后克隆其具體作法是:在純化相應(yīng)的編碼蛋白后構(gòu)建cDNA文庫或基因組文庫，然后從文庫中篩選目的基因(1)將純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行氨基酸測序，據(jù)此合成寡核苷酸探針從cDNA庫或基因組文庫中篩選編碼基因(2)將相應(yīng)的編碼蛋白制成相應(yīng)抗體探針，從cDNA表達(dá)文庫中篩選相應(yīng)克隆。一、目的基因的功能克隆根據(jù)蛋白質(zhì)的基本生化特性這一功能信息，66二、序列克隆法根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因采用核酸探針雜交篩選或用PCR技術(shù)進(jìn)行分離二、序列克隆法根據(jù)已知基因序列或同源基因序列分離目的基因67三、差別雜交法適用范圍：組織特異性表達(dá)或特定發(fā)育階段表達(dá)的基因受生長因子調(diào)節(jié)的基因經(jīng)特殊處理誘導(dǎo)表達(dá)的基因應(yīng)用前提：基因在兩種不同的細(xì)胞群體中的差異性表達(dá)（一個細(xì)胞群體中正常表達(dá)，另一個細(xì)胞群體中目的基因不表達(dá)）。三、差別雜交法適用范圍：應(yīng)用前提：基因在兩種不同的細(xì)胞群體中68基本過程制備兩種細(xì)胞群體的的mRNA提取物以兩種總mRNA或cDNA為探針以表達(dá)目的基因的細(xì)胞群體構(gòu)建cDNA文庫有目的基因表達(dá)的mRNA探針，重組體菌落陽性反應(yīng)目的基因不表達(dá)的mRNA探針，除目的基因之外，其余菌落都為陽性反應(yīng)比較底片，對照原板，可挑選出含選目的基因的菌落基本過程制備兩種細(xì)胞群體的的mRNA提取物69cDNA文庫母板目的基因有表達(dá)目的基因無表達(dá)無有無有說明含目的基因說明含目的基因cDNA文庫母板目的基因有表達(dá)目的基因無表達(dá)無有無有說明含目70四、減法雜交技術(shù)又稱差減雜交、扣除雜交、減數(shù)雜交、消減雜交本質(zhì)：盡量去除兩種樣品中普遍共同存在的基因序列，從而使目的基因序列得到有效的富集，從而提高基因篩選分離的敏感性兩種策略：mRNA減法雜交基因組減法雜交四、減法雜交技術(shù)又稱差減雜交、扣除雜交、減數(shù)雜交、消減雜交71mRNA減法雜交提取表達(dá)目的基因的細(xì)胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA提取不表達(dá)目的基因的細(xì)胞mRNA過量雜交兩種組織中均表達(dá)的基因產(chǎn)物形成cDNA/mRNA雜交分子特異mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA片段仍保持單鏈mRNA減法雜交提取表達(dá)目的基因的細(xì)胞mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cD72減數(shù)雜交技術(shù)分離差異表達(dá)基因DNA/RNA雜交分子可結(jié)合在羥基磷灰石柱上，而游離的單鏈cDNA則過柱流出?；厥盏腸DNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA后克隆倒適當(dāng)?shù)妮d體中，就成為一個減數(shù)文庫。減數(shù)雜交技術(shù)分離DNA/RNA雜交分子可結(jié)合在羥基磷灰石柱上73五、mRNA差別顯示技術(shù)又稱為差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR）目的序列未知，1992年由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)分校Dena-Farber研究所的兩位科學(xué)家Liang和Pardee首次提出的，并運(yùn)用這種方法來分離一對培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中差別表達(dá)的基因。至今，運(yùn)用mRNA差別顯示技術(shù)分離、鑒定的差別表達(dá)基因大約有300多個。五、mRNA差別顯示技術(shù)又稱為差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT743’端錨定引物錨定引物的通式是oligo(dT)12MN，其中M為A、C、G中的任意一種，N為A、C、G或T中的任意一種，所以共有12種oligo(dT)12MN引物，用這12種引物分別對同一總RNA樣品進(jìn)行cDNA合成，即進(jìn)行12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每一種3’端錨定引物，都能夠把總mRNA群體的1／12分子反轉(zhuǎn)錄成mRNA-cDNA雜交分子。這樣可以將整個mRNA群體在cDNA水平上，分成大致相等但序列結(jié)構(gòu)不同的12份亞群體。這一過程叫做差異顯示反轉(zhuǎn)錄，即DDRT。3’端錨定引物錨定引物的通式是oligo(dT)12MN，755’端隨機(jī)引物另外，還需要另外一種由10個核苷酸組成的5’端隨機(jī)引物。這種5’隨機(jī)引物可以同特定細(xì)胞類型的總mRNA群體中的一部分分子發(fā)生雜交作用，而且雜交部位是隨機(jī)地分布在距每條新合成的cDNA鏈3’端的不同位置上。用3’端錨定引物和5’隨機(jī)引物組成的引物對，以mRNA/cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后經(jīng)過2～3h的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以顯示出在100～500bp之間的DNA條帶5’端隨機(jī)引物另外，還需要另外一種由10個核苷酸組成的5’端7620種5’端隨機(jī)引物12種3’端錨定引物240組引物，進(jìn)行PCRPCR過程中加入放射性標(biāo)記變型聚丙烯酰氨凝膠電泳放射自顯影顯示差異表達(dá)條帶對差異表達(dá)條帶進(jìn)行割膠回收并制備成探針，從文庫中篩選20種5’端隨機(jī)引物77差別顯示分析基本流程差別顯示分析基本流程78基本程序提取兩種細(xì)胞的總mRNA,反轉(zhuǎn)錄后成為2種cDNA以一定的引物作隨機(jī)聚合酶鏈反應(yīng)通過擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析,分離出不同樣品間的差異條帶將差異DNA做成探針在cDNA文庫或基因組文庫中篩選基因并作功能分析

基本程序提取兩種細(xì)胞的總mRNA,反轉(zhuǎn)錄后成為2種cDNA79優(yōu)點(diǎn)：幾乎可檢測細(xì)胞表達(dá)的所有基因可同時比較多種細(xì)胞類型可同時展現(xiàn)所有差異用量少，操作簡單，快速高效優(yōu)點(diǎn)：幾乎可檢測細(xì)胞表達(dá)的所有基因80缺點(diǎn)：12種錨定引物和20種隨機(jī)引物，240次PCR聚丙烯酰胺凝膠電泳分離片段小于500bp有些差別條帶成簇出現(xiàn)，造成假陽性缺乏定量分析手段，判斷差異條帶有難度缺點(diǎn)：12種錨定引物和20種隨機(jī)引物，240次PCR81第六章DNA重組的操作第六章DNA重組的操作82第一節(jié)受體細(xì)胞易于重組DNA分子的導(dǎo)入能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中便于重組體的篩選遺傳穩(wěn)定性高安全性高有利于外源基因的高效分泌表達(dá)在遺傳密碼的應(yīng)用上無偏倚性具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制有較高的應(yīng)用價(jià)值第一節(jié)受體細(xì)胞易于重組DNA分子的導(dǎo)入831、原核生物細(xì)胞是較為理想的受體細(xì)胞

大多原核生物沒有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁沒有核膜，有利于外源片斷重組基因組簡單，便于對外源基因進(jìn)行遺傳分析多為單細(xì)胞生物，繁殖迅速，過程簡單1、原核生物細(xì)胞是較為理想的受體細(xì)胞大多原核生物沒有堅(jiān)硬的84缺陷：以原核生物表達(dá)真核生物基因存在問題，很多真核生物基因不能在E.coli中表達(dá)具生物活性的功能蛋白。

缺乏真核生物蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)缺乏蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)原核生物內(nèi)源蛋白易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定缺陷：以原核生物表達(dá)真核生物基因存在問題，很多真核生物基因不85常用受體菌：大腸桿菌人胰島素、生長素、干擾素等枯草桿菌人β干擾素、白細(xì)胞介素乙肝病毒核心抗原等藍(lán)藻易于表達(dá)植物基因常用受體菌：大腸桿菌人胰島素、生長素、862、真菌細(xì)胞低等真核生物酵母菌：以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核微生物，易于表達(dá)外源真核基因

基因結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素培養(yǎng)簡單可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外2、真菌細(xì)胞低等真核生物酵母菌：以芽殖或裂殖方式進(jìn)行無性繁殖873、植物細(xì)胞

堅(jiān)硬的細(xì)胞壁纖維素酶處理－原生質(zhì)體攝取外源片斷全能性：在合適的培養(yǎng)條件下，一個分離的活細(xì)胞可分化成植株。水稻，棉花，玉米，馬鈴薯，煙草等3、植物細(xì)胞堅(jiān)硬的細(xì)胞壁全能性：在合適的培養(yǎng)條件下，一個分884、動物細(xì)胞早期：生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞現(xiàn)在：體細(xì)胞培養(yǎng)動物：豬、羊、牛、魚、鼠、猴等生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)動物疫苗動物品種的遺傳改良人類疾病的基因治療4、動物細(xì)胞早期：生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞動物：89第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞902.1重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌

轉(zhuǎn)化（transformation）定義轉(zhuǎn)化微生物的種類感受態(tài)細(xì)胞P139轉(zhuǎn)化過程供體（donor）：提供DNA的生物受體（recipientorhost）：獲得DNA的生物2.1重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化（trans911.定義轉(zhuǎn)化：受體菌直接吸收供體菌的DNA片斷而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子（transformant）：通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代。2.轉(zhuǎn)化微生物的種類

首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象肺炎鏈球菌（Griffith,1928）

嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、根瘤菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬等。1.定義923.感受態(tài)（competence）感受態(tài)：指受體細(xì)胞最易接受外源DNA片斷并能實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。感受態(tài)是細(xì)菌的一種遺傳特性，而且也受生長階段、培養(yǎng)條件的影響。肺炎鏈球菌對數(shù)生長后期芽孢桿菌屬指數(shù)期末和穩(wěn)定期大腸桿菌剛進(jìn)入對數(shù)期DH5α菌株的OD600為0.5時,細(xì)胞密度在5×107個/ml左右3.感受態(tài)（competence）DH5α菌株的OD60093大腸桿菌革蘭氏陰性菌細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)和組成與革蘭氏陽性菌不同轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難人工制備感受態(tài)細(xì)胞4.轉(zhuǎn)化過程大腸桿菌4.轉(zhuǎn)化過程94大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法：Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法電穿孔轉(zhuǎn)化法三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法：951、Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)生命活動旺盛的菌體菌種分純活化，擴(kuò)大培養(yǎng)，處于對數(shù)生長期沉淀菌體冰水浴中預(yù)冷10分鐘，4℃離心

化合物處理含CaCl2無菌預(yù)冷緩沖液處理DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞1、Ca2＋誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法培養(yǎng)生命活動旺盛的菌體96制備感受態(tài)細(xì)胞的注意事項(xiàng)1.細(xì)胞生長狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或－20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600來控制。DH5α菌株的OD600為0.5時,細(xì)胞密度在5×107個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。制備感受態(tài)細(xì)胞的注意事項(xiàng)1.細(xì)胞生長狀態(tài)和密度:972.質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:

用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當(dāng)加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。

2.質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:983.試劑的質(zhì)量:

所用的試劑,如CaCl2等均需是最高純度的(GR.或AR.)，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。3.試劑的質(zhì)量:994.防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。

4.防止雜菌和雜DNA的污染：100感受態(tài)細(xì)胞的制備1、挑取平板上的大腸桿菌單菌落接種于2mLLB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜2、按1％的接種量接種于3mL新鮮LB培養(yǎng)液，37℃劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6(可見霧狀)3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4℃下12,000rpm離心1min，倒出培養(yǎng)液，用無菌濾紙盡量吸干4、加入1mL預(yù)冷的無菌0.1mol·L-1CaCl2溶液渦旋，4℃下12,000rpm離心30秒,盡量去除上清5、沉淀以50-100μL預(yù)冷的0.1mol·L-1CaCl2重懸，4℃保存?zhèn)溆茫?d內(nèi)可用。感受態(tài)細(xì)胞的制備1、挑取平板上的大腸桿菌單菌落接種于2mL101細(xì)胞的轉(zhuǎn)化2ul重組DNA50ul感受態(tài)細(xì)胞混勻＋↓冰浴30min42℃熱激90～120S↓↓冰浴2min復(fù)蘇：加入450ul液態(tài)LB培養(yǎng)基，37℃輕緩振蕩培養(yǎng)（150rpm），1.5～2h↓→取30～50ul，涂布在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上，平板培養(yǎng)挑取單菌落，于含相應(yīng)抗生素的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，取一定量提取質(zhì)粒，進(jìn)行鑒定（酶切、雜交、測序等）↑細(xì)胞的轉(zhuǎn)化2ul重組DNA50ul感受態(tài)細(xì)胞混勻＋↓冰浴30102CaCl2的誘導(dǎo)原因：在0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，Ca2＋使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中部分核酸酶解離，誘導(dǎo)形成感受態(tài)Ca2＋能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物，黏附在胞膜的外表面；42℃熱激處理，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生擾動，出現(xiàn)間隙。CaCl2的誘導(dǎo)原因：在0℃的CaCl2低滲溶液中，細(xì)103提高轉(zhuǎn)化效率的因素：MgCl2與CaCl2共同處理二甲基亞楓（DMSO）、二硫蘇糖醇（DTT）

提高100～1000倍，易污染RbCl、MnCl2、LiCl和KCl等與CaCl2多鹽處理提高轉(zhuǎn)化效率的因素：104對照處理：

DNA對照處理：無菌水代替感受態(tài)細(xì)胞，檢驗(yàn)DNA溶液感受態(tài)細(xì)胞對照處理：NTE緩沖液代替DNA溶液，檢驗(yàn)感受態(tài)細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞有效性對照處理：加入已知的容易轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA原因：轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽性對照處理：原因：轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，1052、電穿孔轉(zhuǎn)化法（P140）基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道，促進(jìn)外源DNA的有效吸收。影響因素：電場強(qiáng)度，電脈沖時間，外源DNA濃度

菌體制備冷卻，離心，洗滌（降低離子強(qiáng)度）10％甘油重懸細(xì)胞，-70℃貯存低溫下（0－4℃）進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化2、電穿孔轉(zhuǎn)化法（P140）基本原理：利用高壓電脈沖作用，在1063、三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)非接合質(zhì)粒的遷移作用而建立，目前常用的載體多是在非接合型質(zhì)粒或缺少了接合轉(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上而構(gòu)建的。

待轉(zhuǎn)化的受體菌含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒的供體菌含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌（如：輔助菌株E.coli(pRK2013)）3、三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)非接合質(zhì)粒的遷移作用而建立1074、轉(zhuǎn)化率：DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率

以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的比率表示以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)的比率表示P1504、轉(zhuǎn)化率：以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的108影響轉(zhuǎn)化率的因素：

重組DNA分子質(zhì)量較小，親和性強(qiáng)，雙螺旋閉合結(jié)構(gòu)受體細(xì)胞受體細(xì)胞的選擇非常重要轉(zhuǎn)化手段電穿孔法>Ca誘導(dǎo)法>三親本雜交法影響轉(zhuǎn)化率的因素：重組DNA1092.2