臨床檢驗(yàn)技士-臨床免疫學(xué)和免疫檢驗(yàn)講義20

第二十章免疫檢驗(yàn)自動(dòng)化儀器分析第一節(jié)自動(dòng)化免疫濁度分析系統(tǒng)合物（V19S）,在增濁劑（如PEGZaF等）的作用下，迅速形成免疫復(fù)合物微粒（＞19S）,使反應(yīng)液岀現(xiàn)濁度。在抗體稍微過(guò)量且固左的情況下，形成的免疫復(fù)合物量隨抗原量的增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增大，即待測(cè)抗原量與反應(yīng)溶液的濁度呈正相關(guān)。一、免疫透射比濁法（-）原理可溶性抗原抗體反應(yīng)后形成的免疫復(fù)合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變，光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí),被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收，在保持抗體過(guò)量的情況下，吸光度（A值）與免疫復(fù)合物量呈正相關(guān)。與已知濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品相比較，可確定標(biāo)本中抗原的含雖:。儀器工作過(guò)程將待檢標(biāo)本和抗原參考品作適當(dāng)稀釋。將待測(cè)標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)抗原溶液個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品）340nm3?按方程進(jìn)行曲線擬合，制備劑量-反應(yīng)曲線，由計(jì)算機(jī)處理，計(jì)算岀抗原濃度。（二）方法評(píng)價(jià)1?2.不足：①抗體用量較大：②溶液中IC分子若過(guò)小則阻擋不了光線的通過(guò)：若數(shù)量太少則對(duì)光通量影響不大；靈敏度較散射比濁法低：③透射比濁測(cè)定在抗原-抗體反應(yīng)的第二階段，檢測(cè)需在抗原-抗體反應(yīng)達(dá)到平衡后進(jìn)行，耗時(shí)較長(zhǎng)。二、免疫膠乳比濁法（一）原理用抗體致敏膠乳顆粒，在遇到相應(yīng)抗原時(shí)，形成IC,引起膠乳顆粒凝聚?？乖?抗體反應(yīng)后溶液的吸光度或散射光強(qiáng)度與待測(cè)抗原濃度呈正相關(guān)。采用透射比濁法或散射比濁法測(cè)泄。（二）方法評(píng)價(jià)本法敏感度髙于普通比濁法，可達(dá)關(guān)/L水平,操作簡(jiǎn)便，易自動(dòng)化：血淸中的類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）可與IgGFc段結(jié)合，使IgGF（ab‘）:片IgGIgG三、免疫散射比濁法（一）原理溶液中的微粒受到光線照射后，微粒對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。散射光強(qiáng)度與顆粒的分子量、數(shù)目、大小及入射光強(qiáng)度成正比，與微粒至檢測(cè)器的距離、入射光波長(zhǎng)成反比，因此使用髙強(qiáng)度光源如激光、較短波長(zhǎng)的入射光，可提高檢測(cè)靈敏度。當(dāng)顆粒直徑小于入射光波長(zhǎng)的1/10時(shí)，散射光強(qiáng)度在各個(gè)方向的分布均勻一致，稱(chēng)為Rayleigh散射;當(dāng)顆粒直徑大于入射光波長(zhǎng)的1/10到接近入射光波長(zhǎng)時(shí)，隨著顆粒直徑增大，向前散射光強(qiáng)于向后散射光，稱(chēng)為Debye散射；當(dāng)顆粒直徑等于或大于入射光波長(zhǎng)時(shí)，向前散射光遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于向后散射光，稱(chēng)為Mile散射。在免疫濁度測(cè)立中，可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)，生成的免疫復(fù)合物顆粒由小變大，而且免疫復(fù)合物顆粒的大小隨抗原抗體的比例、濃度和分子大小而變化，相應(yīng)地也會(huì)出現(xiàn)散射光強(qiáng)度隨角度而變化的情況,因此，很難用固立的公式來(lái)計(jì)算散射光的強(qiáng)度，而是采取適當(dāng)?shù)慕嵌葴y(cè)疑散射光強(qiáng)度。（二） 泄時(shí)散射比濁法在保證抗體過(guò)量的情況下,加入待測(cè)抗原。在反應(yīng)的第一階段，溶液中產(chǎn)生的散射光信號(hào)波動(dòng)較大，所獲取的信號(hào)計(jì)算出的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。1?反應(yīng)階段加入全量標(biāo)本，在4分鐘內(nèi)測(cè)量散射光信號(hào)。2.使所有未知抗原全部與抗體結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，故需要：抗體過(guò)量：對(duì)抗原過(guò)量進(jìn)行閾值限定。（三） 速率散射比濁法oIC（不是免疫復(fù)合物累積的量）。每項(xiàng)檢測(cè)僅］2分鐘即— 為所謂的速率嫦。四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應(yīng)用（-）免疫比濁分析的影響因素抗原抗體比例抗體的質(zhì)量：R增濁劑的使用入射光光源和波長(zhǎng)結(jié)果報(bào)告中的計(jì)量單位偽濁度：非抗原抗體特異性結(jié)合形成的濁度，稱(chēng)為偽濁度,可導(dǎo)致抗原檢測(cè)結(jié)果假性升高。偽濁度形成的原因包括：①混濁標(biāo)本、髙血脂標(biāo)本、反復(fù)凍融標(biāo)本；②抗體效價(jià)低（Vl：20）、抗血淸火活處理、抗血淸PEG埃污染等：⑥緩沖液的離子強(qiáng)度太高，pH56點(diǎn)左標(biāo)。每更換一批試劑，應(yīng)重新制備劑量-反應(yīng)曲線。為保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，選取合適的質(zhì)控血淸。（二）臨床應(yīng)用主要用于檢測(cè)血漿、體液中的特定蛋白系列,如IgG、IgA.IgM：免疫球蛋白亞類(lèi)：補(bǔ)體C3、C4：血漿蛋白如前白蛋白（PAB）、白蛋白（ALB）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（TRF）、銅藍(lán)蛋白（CER〉、結(jié)合珠蛋白（HP）、C白（CRP）、脂蛋白（a）、類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。第二節(jié)自動(dòng)化發(fā)光免疫分析系統(tǒng)自動(dòng)化發(fā)光免疫分析儀主要由樣本盤(pán)、試劑盤(pán)（盒）、溫育反應(yīng)系統(tǒng)、固相載體分離淸洗系統(tǒng)、信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理、控制系統(tǒng)組成。一、口丫噪酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析儀該儀器利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)，以葉嚨酯為化學(xué)發(fā)光劑，以細(xì)小的順磁性微粒為固相載體。其測(cè)定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法等相同。二、酶聯(lián)發(fā)光免疫分析儀（-）辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀：以HRP標(biāo)記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑,還利用增強(qiáng)劑使化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增加、時(shí)間延長(zhǎng)。（二） 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析儀：以ALP標(biāo)記抗原或抗體以順磁性微粒子為固相載體,用AMPPD作為化學(xué)發(fā)光劑這種化學(xué)發(fā)光劑發(fā)光穩(wěn)定,持續(xù)時(shí)間可達(dá)幾十分鐘 —（三） 堿性磷酸酶標(biāo)記的微粒子熒光免疫分析儀：以ALP標(biāo)記抗原或抗體以塑料微粒為固相載體,以甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）作為酶促反應(yīng)的熒光基質(zhì)（底物）。三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（ECLIA）以順磁性微粒為固相載體，用三聯(lián)毗噪釘標(biāo)記抗原或抗體，三丙胺（TPA）為電子供體。電化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，易于控制。四、在臨床免疫檢測(cè)中的應(yīng)用自動(dòng)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)智能化程度高，敏感度髙、特異性強(qiáng)、精密度和準(zhǔn)確性均可高于RIA,特別是檢測(cè)靈活性高，快速，檢測(cè)試劑穩(wěn)定并易于進(jìn)行質(zhì)量控制?？捎糜趦?nèi)分泌激素類(lèi)、腫瘤標(biāo)志物類(lèi)、心肌標(biāo)志物類(lèi)、病毒標(biāo)志物類(lèi)、治療性藥物濃度、It代謝指標(biāo)和貧血類(lèi)等方面的檢測(cè)。第三節(jié)自動(dòng)化熒光免疫分析系統(tǒng)一、時(shí)間分辨熒光免疫分析儀（一） 原理屬于非均相熒光免疫測(cè)泄，斕系元素屬于三價(jià)稀上離子，包括鉗（Eu'J,鑼?zhuān)⊿mJ,鍬（Tb”），敘（Nd”）和錨（DQ等，它們的熒光壽命較長(zhǎng),尤其是Eu跌和Tb”的熒光壽命特別長(zhǎng)且熒光強(qiáng)。因此,時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定中多用Eu"和Tb‘?為標(biāo)志物。以領(lǐng)|系元素（尤其是鮪（Eu”））標(biāo)記抗原或抗體作為示蹤塹，它的激發(fā)光譜帶較寬，發(fā)射光譜帶窄，來(lái)自生物樣品的熒光干擾少。激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的位移大，能有效地分開(kāi)激發(fā)光和發(fā)射的熒光。（二）分析物解離增強(qiáng)原理被瀾系元素標(biāo)記的抗體或抗原形成IC在弱堿性反應(yīng)液中經(jīng)激發(fā)后的熒光信號(hào)較弱,必須再加入增強(qiáng)液,使IC的pH降低至23,以利于Eu『從復(fù)合物上解離，游離的Eu”與另一種螯合劑結(jié)合，形成髙強(qiáng)度熒光的穩(wěn)左螯合物，又將該技術(shù)稱(chēng)為解離增強(qiáng)闕系元素?zé)晒饷庖撸―ELFIA）,這是目前在時(shí)間分辨熒光免疫分析中應(yīng)用最多的一種分析系統(tǒng)。（三） 注意事項(xiàng)TRFIA應(yīng)盡量防塵。載體最常用的96二、熒光偏振免疫分析儀熒光偏振免疫測(cè)左（FPIA）為一種均相熒光免疫測(cè)定方法，熒光強(qiáng)度與熒光標(biāo)志物質(zhì)在溶液中旋轉(zhuǎn)的速度與分子大小成反比，分子大，轉(zhuǎn)動(dòng)速度慢，熒光強(qiáng)度大:分子小，轉(zhuǎn)動(dòng)速度快,熒光強(qiáng)度小。常采用抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測(cè)。第四節(jié)自動(dòng)化酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)ELISA能夠測(cè)怎傳染病標(biāo)志物、腫瘤標(biāo)志物、竹代謝標(biāo)志物和內(nèi)分泌激素等許多項(xiàng)目。全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀中的連體機(jī)工作速度快，自動(dòng)化程度高，適合大批量樣本的處理，如血站系統(tǒng)。分體機(jī)，加樣速度快，適合試驗(yàn)項(xiàng)目變化多、樣本批量不等的臨床實(shí)驗(yàn)室。不屬于熒光免疫自動(dòng)化分析的是時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)泄熒光偏振免疫測(cè)左熒光爾免疫分析熒光免疫組化分析流式細(xì)胞術(shù)『正確答案」DI■（或抗原細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原（或抗體），（或抗體）的所在位置及其性質(zhì)。關(guān)于免疫透射比濁試驗(yàn)描述不正確的是溶液中的抗原-抗體復(fù)合物應(yīng)足夠大溶液中的抗原-抗體復(fù)合物應(yīng)足夠多檢測(cè)需要溫冇時(shí)間選擇高親和力抗體檢測(cè)中保證抗原過(guò)量『正確答案」E『答案解析」免疫透射比濁指的是可溶性抗原抗體反應(yīng)后形成的免疫復(fù)合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變，光線通過(guò)抗原抗體反應(yīng)后的溶液時(shí)，被其中的免疫復(fù)合物微粒吸收，在保持抗體過(guò)量的情況下