A-發(fā)育生物學(xué)緒論

緒論(Introduction)一、發(fā)育生物學(xué)的任務(wù)和研究對(duì)象1.發(fā)育生物學(xué)（developmentalbiology)是應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)研究生物體發(fā)育的過(guò)程及其變化機(jī)制的科學(xué)。它是20世紀(jì)50年代在胚胎學(xué)（embryology)的基礎(chǔ)上，隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展以及它們與胚胎學(xué)的相互滲透而興起的一門(mén)新的前緣學(xué)科。2.發(fā)育生物學(xué)研究從生殖細(xì)胞發(fā)生、受精、胚胎發(fā)育、生長(zhǎng)、成熟、衰老和死亡，即個(gè)體發(fā)育中生命現(xiàn)象發(fā)展的機(jī)制，以及異常發(fā)育如腫瘤、畸形等。3.發(fā)育生物學(xué)研究的核心問(wèn)題是細(xì)胞分化(celldifferentiation).細(xì)胞分化是指由一種類(lèi)型的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞類(lèi)型的多樣性。4.發(fā)育生物學(xué)研究有機(jī)體細(xì)胞的每一個(gè)分子、每一個(gè)細(xì)胞、每一種組織、每一個(gè)器官和每一種有機(jī)體，因?yàn)樗鼈兊钠鹪春托纬啥茧x不開(kāi)發(fā)育。珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和青蛙鰓的形成對(duì)發(fā)育生物學(xué)家來(lái)說(shuō)是同樣正當(dāng)?shù)膯?wèn)題。發(fā)育生物學(xué)的研究并不局限于有機(jī)體的任一系統(tǒng)、組織或器官。這意味著發(fā)育生物學(xué)可能是生物學(xué)科的最廣泛的概括。發(fā)育的研究把所有的生物學(xué)領(lǐng)域連接在一起。二、發(fā)育的基本模式（一）發(fā)育的基本特點(diǎn):多細(xì)胞有機(jī)體的產(chǎn)生是一個(gè)相對(duì)緩慢和漸進(jìn)的變化過(guò)程，我們將其稱為發(fā)育（development)。其特征是具有嚴(yán)格的時(shí)間和空間的次序性，這種次序性是由發(fā)育的遺傳程序控制，發(fā)育是有機(jī)體的各種細(xì)胞協(xié)同作用的結(jié)果,也是一系列基因網(wǎng)絡(luò)性調(diào)控的結(jié)果.發(fā)育完成兩大功能：1.產(chǎn)生細(xì)胞的多樣性和在每一代中的條理性。從單個(gè)的受精卵產(chǎn)生不同類(lèi)型的細(xì)胞，如肌肉細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、神經(jīng)元、淋巴細(xì)胞、血細(xì)胞和所有其它類(lèi)型的細(xì)胞。我們把細(xì)胞多樣性的產(chǎn)生稱為分化（differentiation)，是一個(gè)質(zhì)變的過(guò)程。由已分化的細(xì)胞形成組織和器官的過(guò)程稱為形態(tài)發(fā)生（morphogenesis)。發(fā)育的過(guò)程還包括生長(zhǎng)（growth)，這是一個(gè)量變的過(guò)程。2.確保從一代到下一代生命的連續(xù)性,即增殖（reproduction).以保證該物種新個(gè)體的持續(xù)產(chǎn)生。（二）發(fā)育的基本過(guò)程：1.配子發(fā)生(gametogenesis)：產(chǎn)生成熟的精子（sperm)和卵子(ovum)的過(guò)程。2.受精(fertilization)：為精子和卵子相遇并結(jié)合的過(guò)程。3.卵裂(cleavage)和囊胚(blastula)：受精卵連續(xù)分裂，產(chǎn)生的細(xì)胞稱為卵裂球（blastomeres)，然后由它們形成多細(xì)胞的囊胚。4.原腸形成(gastrulation):囊胚的細(xì)胞經(jīng)過(guò)多種多樣的形態(tài)發(fā)生運(yùn)動(dòng)（morphogeneticmovement）產(chǎn)生由外胚層(ectoderm)、中胚層(mesoderm)和內(nèi)胚層(endoderm)組成的原腸胚（gastrula）。5.器官發(fā)生（organgenesis）：三胚層的細(xì)胞相互作用分化形成各種不同器官的原基。6.變態(tài)(metamorphosis)：有些動(dòng)物，如兩棲類(lèi)和昆蟲(chóng)，在發(fā)育過(guò)程中經(jīng)歷一個(gè)幼蟲(chóng)（larva）階段，然后經(jīng)過(guò)“脫胎換骨”的變化發(fā)育為成體的過(guò)程。三、發(fā)育生物學(xué)的發(fā)展簡(jiǎn)史發(fā)育生物學(xué)是由于細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)等其他生命學(xué)科的發(fā)展和與胚胎學(xué)的相互滲透，在胚胎學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展和形成的一門(mén)新興的生命科學(xué)。（一）先成論(preformation)和后成論(epigenesis)早在公元前,Aristotle

(384一322)認(rèn)為動(dòng)物胚胎和成體動(dòng)物各種結(jié)構(gòu)形成的原因只有兩種可能：一是卵子或精子中本來(lái)具有微小的結(jié)構(gòu)，在發(fā)育過(guò)程中逐漸長(zhǎng)大形成胚胎和成體的結(jié)構(gòu)；二是卵子或精子中本來(lái)并不具有這些結(jié)構(gòu)，而是在發(fā)育過(guò)程中逐漸形成的.在觀察雞和一些無(wú)脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的基礎(chǔ)上，他首先提出了胚胎是由簡(jiǎn)單到復(fù)雜逐漸發(fā)育形成的（后成論）。但到了公元17世紀(jì)后期和18世紀(jì)，以精源學(xué)說(shuō)和卵源學(xué)說(shuō)為代表的先成論占統(tǒng)治地位。精源學(xué)說(shuō)認(rèn)為胚胎預(yù)先存在于精子中，卵源學(xué)說(shuō)則認(rèn)為卵子中本來(lái)就存在微小的胚胎雛形。其共同點(diǎn)都認(rèn)為胚胎是成體的雛形，是配子中本來(lái)固有的結(jié)構(gòu),胚胎發(fā)育僅僅是原有結(jié)構(gòu)的增大。1759年德國(guó)Wollf(TheoriaGenerationis和FormationeIntestinorum)再次提出了后成論觀點(diǎn)。Wollf根椐對(duì)雞胚發(fā)育的觀察，認(rèn)為卵子中本來(lái)并不存在胚胎結(jié)構(gòu)，胚胎與成體也并不相同，胚胎發(fā)育是逐漸變化的過(guò)程。后成論直到19世紀(jì)才為人們所接受。（二）胚胎學(xué)(embryology)1.描述胚胎學(xué)(descriptiveembryology)2.比較胚胎學(xué)(comparativeembryology):

重演學(xué)說(shuō)(recapitulationtheory)或生物發(fā)生律(biogeneticlaw)和進(jìn)化論(evolutiontheory)。3.實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)(experimentalembryology):

鑲嵌型發(fā)育(mosaicdevelopment;Weismann,

determinant;

Roux)和調(diào)整型發(fā)育(regulativedevelopment;Driesch)胚胎是由一個(gè)單細(xì)胞的合子經(jīng)過(guò)一系列的分裂和分化產(chǎn)生的。19世紀(jì)80年代,Weismann就提出了關(guān)于細(xì)胞、染色體和基因與胚胎發(fā)育關(guān)系的理論。他認(rèn)為合子的細(xì)胞核含有大量特殊的信息物質(zhì)——決定子(determinants),在卵裂的過(guò)程中被平均分配到子細(xì)胞中去控制子細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)。細(xì)胞的命運(yùn)實(shí)際上是由卵裂時(shí)所獲得的合子核信息早已預(yù)定的。這一類(lèi)型發(fā)育稱為嵌合型發(fā)育。Weismann理論的核心強(qiáng)調(diào)早期卵裂必須是不對(duì)稱分裂。由于合子成分的不均勻分布，其卵裂的結(jié)果產(chǎn)生的子細(xì)胞彼此之間是完全不同的。胚胎學(xué)家Roux(1887)用燒熱的針破壞兩細(xì)胞期蛙胚的一個(gè)分裂球，結(jié)果存活的另一個(gè)分裂球只發(fā)育為半個(gè)胚胎。由此他認(rèn)為蛙的胚胎發(fā)育存在嵌合型發(fā)育機(jī)制，細(xì)胞的特征和命運(yùn)是在卵裂的過(guò)程中決定的。但是Driesch(1891)用海膽為實(shí)驗(yàn)材料重復(fù)Roux的實(shí)驗(yàn)卻得到了完全不同的結(jié)果。他在海膽兩細(xì)胞時(shí)期將兩個(gè)分裂球分開(kāi),得到了兩個(gè)發(fā)育正常的、個(gè)體較小的海膽幼體。Driesch的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一次證明發(fā)育過(guò)程中存在調(diào)整型發(fā)育機(jī)制。4.胚胎誘導(dǎo)作用(embryonicinduction)和組織者(organizer;

Spemann和Mangold,1924)Driesch(1876-1941)提出的調(diào)整型發(fā)育機(jī)制已經(jīng)涉及細(xì)胞之間的相互作用，但是一直到誘導(dǎo)現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)之后，人們才真正認(rèn)識(shí)到，細(xì)胞之間的相互作用是胚胎發(fā)育最重要的核心問(wèn)題.誘導(dǎo)是指一類(lèi)組織與另一類(lèi)組織的相互作用，前者稱為誘導(dǎo)者(inductor),后者稱反應(yīng)組織，誘導(dǎo)者可指令鄰近反應(yīng)組織的發(fā)育.1924年Spemann進(jìn)行了著名的胚孔背唇移植實(shí)驗(yàn)。將蠑螈原腸胚早期的胚孔背唇組織移植到另一同期受體胚胎的胚孔側(cè)唇表面，隨著受體胚胎發(fā)育的進(jìn)程，大部分移植組織也內(nèi)陷進(jìn)入胚胎內(nèi)，發(fā)現(xiàn)到原腸胚后期誘導(dǎo)產(chǎn)生了另一個(gè)次生胚。由于胚孔背唇組織具有調(diào)控和組織一個(gè)幾乎完整的胚胎產(chǎn)生的特殊能力,故稱組織者。發(fā)育中的誘導(dǎo)和細(xì)胞之間相互作用的重要性才因此得到充分的重視。由此重大發(fā)現(xiàn),Spemann在1935年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng).（三）細(xì)胞學(xué)理論和胚胎學(xué)1839年德國(guó)植物學(xué)家Schleiden和生理學(xué)家Schwann指出，所有生物有機(jī)體都由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞是生命的基本單位；通過(guò)細(xì)胞的有絲分裂產(chǎn)生其他細(xì)胞。因此發(fā)育也必然是逐漸變化的過(guò)程.在胚胎發(fā)育中,通過(guò)受精卵的分裂產(chǎn)生許多新細(xì)胞和新的細(xì)胞類(lèi)型.到19世紀(jì)40年代，對(duì)卵子的特性開(kāi)始有所認(rèn)識(shí)，認(rèn)識(shí)到卵子也是一個(gè)細(xì)胞（一個(gè)特殊細(xì)胞）。Weismann進(jìn)一步提出后代所具有的雙親遺傳特性來(lái)自于生殖細(xì)胞，來(lái)自于兩性配子所攜帶的遺傳特性。之后對(duì)海膽等的研究進(jìn)一步顯示，在受精初期受精卵中包含兩個(gè)細(xì)胞核，其中一個(gè)來(lái)源于卵子，另一個(gè)來(lái)源于精子，在受精過(guò)程中兩個(gè)細(xì)胞核融合。到19世紀(jì)后期，人們通過(guò)一系列研究認(rèn)識(shí)到，合子細(xì)胞核的染色體中各有一半分別來(lái)源于兩個(gè)親代，而合子的遺傳信息在卵裂過(guò)程中平均分配到子細(xì)胞中去，這就為遺傳特性的傳遞提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。（四）胚胎學(xué)和遺傳學(xué)的結(jié)合Boveri

(1902)對(duì)海膽的研究發(fā)現(xiàn)，正常的胚胎發(fā)育決定于正常的染色體組型.之后的研究進(jìn)一步提出基因型(genotype)與表型(phenotype)的概念?；蛐褪怯袡C(jī)體從雙親獲得的遺傳信息所賦有的特性.有機(jī)體在不同發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出來(lái)的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生化等特征稱為表型。由基因型控制發(fā)育，同時(shí)有機(jī)體的表型又受到環(huán)境因子與基因型的共同影響。如孿生兄弟。所以發(fā)育實(shí)際上看作是基因型與表型的結(jié)合.發(fā)育受遺傳信息的控制，在發(fā)育過(guò)程中合子從雙親獲得的遺傳信息是如何表達(dá)的，一個(gè)單細(xì)胞的合子又是如何發(fā)育成為具有功能的有機(jī)體的，要回答這些難題，需要將遺傳學(xué)和胚胎學(xué)的研究結(jié)合起來(lái)。隨著基因編碼蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，不少問(wèn)題迎刃而解.細(xì)胞的性質(zhì)是由細(xì)胞中所包含的蛋白質(zhì)決定的，而這些蛋白質(zhì)由基因編碼?；蛲ㄟ^(guò)其編碼產(chǎn)物—蛋白質(zhì)的變化控制發(fā)育分化中細(xì)胞的性質(zhì)和習(xí)性.遺傳和發(fā)育是個(gè)體發(fā)生過(guò)程的兩個(gè)方面。對(duì)于發(fā)育性狀的研究，既可以從遺傳現(xiàn)象出現(xiàn)的角度進(jìn)行研究，又可以從發(fā)育過(guò)程進(jìn)行研究。發(fā)育受遺傳程序的控制，遺傳特性通過(guò)發(fā)育展現(xiàn)出來(lái).（五）分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)發(fā)育生物學(xué)是個(gè)新興學(xué)科。自從Watson和Crick

(1953)根據(jù)X衍射和化學(xué)分析提出DNA分子的雙螺旋模型以后，特別是60年代Nirenberg對(duì)DNA遺傳密碼的破譯，Jacob和Monocl(1960)提出并證明蛋白質(zhì)合成調(diào)控機(jī)制的操縱子學(xué)說(shuō)等研究成果，使分子生物學(xué)迅速發(fā)展.分子生物學(xué)與遺傳學(xué)的結(jié)合，人們逐漸認(rèn)識(shí)到遺傳信息主要是編碼在細(xì)胞核內(nèi)基因組DNA的一級(jí)序列，發(fā)育受遺傳的控制。為回答發(fā)育的遺傳程序是以何種方式編碼在基因組DNA上，編碼在DNA上的遺傳信息又如何控制生物體的發(fā)育等問(wèn)題，人們開(kāi)始采用分子生物學(xué)方法和各種新興的生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行發(fā)育機(jī)制的研究.目前對(duì)于果蠅和線蟲(chóng)發(fā)育的分子控制機(jī)制已基本闡明。在此基礎(chǔ)上，利用發(fā)育調(diào)控基因在進(jìn)化上的保守性，開(kāi)展了對(duì)脊椎動(dòng)物發(fā)育分子機(jī)制的深入研究，對(duì)于斑馬魚(yú)、非洲爪瞻、小鼠、雞和文昌魚(yú)等模式動(dòng)物的研究已取得一系列重大的突破.由于發(fā)育生物學(xué)的迅速發(fā)展，發(fā)育生物學(xué)已成為當(dāng)代生命科學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)領(lǐng)域之一.四、發(fā)育生物學(xué)模式生物現(xiàn)代發(fā)育生物學(xué)研究主要集中于幾種模式生物，包括果蠅、線蟲(chóng)、非洲瓜瞻、斑馬魚(yú)、雞和小鼠等。對(duì)于發(fā)育分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)也主要來(lái)源于對(duì)這些模式生物的研究。模式動(dòng)物各有優(yōu)缺點(diǎn),但都具備一些共同特征：①取材方便。在實(shí)驗(yàn)室條件下，這些動(dòng)物常年可產(chǎn)卵，隨時(shí)可獲得胚胎材料，飼養(yǎng)管理簡(jiǎn)單，維持費(fèi)用低。②胚胎具有較強(qiáng)的可操作性。胚胎一般較大，相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)如顯微注射等比較完善。③可進(jìn)行遺傳學(xué)研究。上述物種中果蠅、線蟲(chóng)和斑馬魚(yú)均可用于大規(guī)模遺傳突變研究，小鼠的基因敲除技術(shù)已相當(dāng)完善，非洲爪瞻的轉(zhuǎn)基因技術(shù)較有優(yōu)勢(shì)。此外,棘皮動(dòng)物海膽和尾索動(dòng)物海鞘也都是較為常用的模式動(dòng)物,文昌魚(yú)是研究動(dòng)物進(jìn)化的模式生物,水螅渦蟲(chóng)常被用予再生機(jī)制的研究（一）脊椎動(dòng)物模式生物

1.兩棲類(lèi)：非洲爪蟾(Xenopuslaevis)兩棲類(lèi)動(dòng)物是早期胚胎學(xué)研究的經(jīng)典動(dòng)物模型。在20世紀(jì)早期，常用的動(dòng)物是蠑螈和蜥蜴，50年代以后，非洲爪瞻逐漸成為主要兩棲類(lèi)動(dòng)物模型。非洲爪瞻的優(yōu)勢(shì)是:取卵方便.在實(shí)驗(yàn)室條件下，非洲爪蟾可常年產(chǎn)卵，不受季節(jié)限制。只需要注射激素，雌體第2天就可產(chǎn)卵產(chǎn)卵量大,卵可通過(guò)人工授精獲得受精卵。卵子和胚胎個(gè)體較大,直徑可達(dá)1.4mm,很方便進(jìn)行實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)研究，如顯微注射、胚胎切割和移植等。早期胚胎發(fā)育很快，在24oC下受精后2天左右就可以孵化為可自由游動(dòng)的幼蟲(chóng).非洲瓜蟾的研究為我們認(rèn)識(shí)脊椎動(dòng)物的發(fā)育機(jī)制做出了重要貢獻(xiàn)。

非洲爪蟾的生命周期如圖緒.1。非洲爪瞻的成熟卵子具有明確的動(dòng)物極和植物極之分。動(dòng)物極含有大量色素顆粒而卵黃較少，植物極則含有豐富的卵黃而色素顆粒較少。受精時(shí)精子于動(dòng)物半球的任意位點(diǎn)人卵。受精作用引起皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)(corticalrotation)，質(zhì)膜下的皮質(zhì)胞質(zhì)相對(duì)于內(nèi)部的胞質(zhì)部分旋轉(zhuǎn)約30o。在這一過(guò)程中原來(lái)位于植物半球的背部決定因子被轉(zhuǎn)運(yùn)至精子人卵處的對(duì)側(cè)，即未來(lái)胚胎的背側(cè)爪蟾胚胎經(jīng)過(guò)卵裂、囊胚（3.5h）、原腸胚(11h)、神經(jīng)胚(18h)及尾芽期(25h)等階段孵化成為幼蟲(chóng)(66h)。蝌蚪在5天左右后肢開(kāi)始發(fā)育并逐漸進(jìn)入變態(tài)期，到2個(gè)月時(shí)完成變態(tài)。幼體要生長(zhǎng)1-2年才能達(dá)到性成熟。雖然X.laevis作為動(dòng)物模型有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在著重要缺陷，即很難進(jìn)行遺傳學(xué)研究。主要是由于其生命周期過(guò)長(zhǎng)，同時(shí)，X.laevis是異源四倍體，多數(shù)基因都存在4個(gè)拷貝，很難進(jìn)行遺傳突變實(shí)驗(yàn)。近年來(lái)，另一個(gè)X.laevis的近緣品種一X.tropicalis開(kāi)始進(jìn)入人們的視野。與X.laevis相比，X.tropicalis個(gè)體較小，世代周期短(約4個(gè)月)，是二倍體品種，因而比較適于進(jìn)行遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)。它同時(shí)也具備X.laevis所具有的實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)研究?jī)?yōu)勢(shì)，如激素誘導(dǎo)產(chǎn)卵，產(chǎn)卵量大等。X.tropicalis的卵直徑0.6-0.7mm，足以進(jìn)行顯微操作實(shí)驗(yàn)。在X.laevis中建立的實(shí)驗(yàn)方法均可直接應(yīng)用于X.tropicalis中。目前X.tropicalis的基因組測(cè)序已接近完成。X.tropicalis有望成為重要的發(fā)育遺傳學(xué)研究模型。2.魚(yú)類(lèi)：斑馬魚(yú)(Daniorerio)

20世紀(jì)60年代，美國(guó)Oregon大學(xué)Streisinger

G就開(kāi)始了對(duì)斑馬魚(yú)的研究。90年代，由NilssleinVolhardC和DrieverW分別領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了斑馬魚(yú)的大規(guī)模突變篩選，得到了大約4000個(gè)突變品系。此次篩選成為斑馬魚(yú)研究領(lǐng)域的里程碑。此后斑馬魚(yú)的研究得到了迅速發(fā)展。斑馬魚(yú)作為發(fā)育生物學(xué)模式生物有兩個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)：一是世代周期短(約3個(gè)月)，二是胚胎透明，易于觀察，同時(shí)飼養(yǎng)管理較為簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。斑馬魚(yú)是目前唯一可以進(jìn)行大規(guī)模遺傳突變篩選的脊椎動(dòng)物.斑馬魚(yú)的基因組測(cè)序已接近完成，相關(guān)的遺傳學(xué)和形態(tài)學(xué)研究技術(shù)也比較完善，斑馬魚(yú)已成為最好的脊椎動(dòng)物發(fā)育遺傳學(xué)研究體系之一.

斑馬魚(yú)的卵屬于端黃卵，胚盤(pán)位于卵黃之上。早期的卵裂為盤(pán)狀不完全卵裂，囊胚期胚胎形成一個(gè)細(xì)胞球位于卵黃上，而囊胚腔并不明顯。位于囊胚邊緣的細(xì)胞與卵黃并不完全分隔。到囊胚期，這些細(xì)胞與卵黃細(xì)胞融合，形成一個(gè)合胞體層，稱為卵黃合胞體層(yolklsyncytiallayer，YSL)。到囊胚晚期，卵黃合胞體層與胚盤(pán)開(kāi)始向下包被。到原腸作用結(jié)束時(shí),卵黃細(xì)胞被完全包被在胚胎內(nèi)部。原腸作用后，體節(jié)、神經(jīng)管和其他器官原基開(kāi)始出現(xiàn)。斑馬魚(yú)胚胎在受精后48h左右開(kāi)始孵化為自由游動(dòng)的幼體。

3.鳥(niǎo)類(lèi)：雞

雞的胚胎發(fā)育過(guò)程與哺乳動(dòng)物更為接近.由于雞胚在體外發(fā)育，相對(duì)于哺乳動(dòng)物更容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，相應(yīng)的研究手段已比較成熟。雞胚是研究附肢、體節(jié)等器官發(fā)育機(jī)制的重要模型。雞的基因組測(cè)序也已完成。雞卵在輸卵管內(nèi)完成受精，在排卵過(guò)程中逐漸包被上卵清、殼膜和蛋殼。卵細(xì)胞質(zhì)和核位于卵黃上方2-3mm的狹小區(qū)域。受精卵經(jīng)卵裂形成胚盤(pán)，胚盤(pán)中央逐漸與卵黃分離，形成胚下腔。隨后一部分細(xì)胞遷移至胚下腔內(nèi)卵黃上方，形成下胚層，位于表面的胚層為上胚層，兩者之間為囊胚腔。上胚層后部細(xì)胞向中間遷移，使中央部分加厚形成原條，原條逐漸向前延伸，其最前端細(xì)胞變得更密集，稱為亨氏結(jié)(Hensen‘snode)。預(yù)定中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞通過(guò)原條中央的原溝遷入囊胚腔內(nèi)部--即原腸作用。隨后原條開(kāi)始逐漸回縮，胚胎開(kāi)始出現(xiàn)脊索、體節(jié)、神經(jīng)板等結(jié)構(gòu)。伴隨其發(fā)育，胚胎還形成復(fù)雜的胚外膜系統(tǒng)，包括卵黃囊、尿囊等。卵黃囊為胚胎的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，而尿囊是胚胎的呼吸器官并貯存代謝廢物。

雞胚在孵育21天后孵化成為小雞4.哺乳動(dòng)物：小鼠

胚胎發(fā)育過(guò)程與人類(lèi)比較接近，作為很多人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型小鼠的世代周期約2個(gè)月，這在哺乳動(dòng)物中是相當(dāng)短的。其基因組測(cè)序已經(jīng)完成，遺傳學(xué)背景較為清楚，相應(yīng)的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)手段如轉(zhuǎn)基因、基因敲除等也比較完善。小鼠是目前唯一可以進(jìn)行基因敲除實(shí)驗(yàn)的脊椎動(dòng)物。最大缺點(diǎn)是其胚胎在母體內(nèi)發(fā)育，胚胎個(gè)體很小，很難實(shí)驗(yàn)操作.小鼠成熟卵外包被透明帶(zonapellucida)，受精和卵裂均在輸卵管內(nèi)進(jìn)行.在8細(xì)胞時(shí)胚胎發(fā)生緊密化(compaction)形成實(shí)心球體，至32細(xì)胞時(shí)稱桑椹胚(morula).此后出現(xiàn)囊胚腔.胚胎分化為滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm)和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercelllPass)—胚泡(blastocyst)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)將發(fā)育成為胚胎本身，而滋養(yǎng)外胚層發(fā)育為胚外組織。E4.5天時(shí)胚泡到達(dá)子宮從透明帶中孵出并植入子宮壁。此后小鼠胚胎的發(fā)育過(guò)程與雞胚類(lèi)似.內(nèi)細(xì)胞團(tuán)逐漸發(fā)育為一個(gè)中空的柱狀結(jié)構(gòu)，稱為卵柱(eggcylinder).卵柱中位于囊胚腔表面的細(xì)胞分化為臟壁內(nèi)胚層(visceralendoderm),與雞胚的下胚層相當(dāng)，將來(lái)分化為胚外組織;而位于內(nèi)部的內(nèi)胚團(tuán)細(xì)胞與雞胚的上胚層相當(dāng).卵柱中央的腔將來(lái)成為羊膜腔.在E6.5天時(shí)，在上胚層一側(cè)出現(xiàn)原條,原條向前延伸，其前端出現(xiàn)原節(jié)(node.)。胚胎的預(yù)定中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞通過(guò)原條遷入胚胎內(nèi)部。隨后原條回縮,胚胎開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)板、脊索、體節(jié)等。到E8.5天，胚胎的頭褶(headfold)已相當(dāng)清楚.胚胎開(kāi)始沿它的長(zhǎng)軸扭轉(zhuǎn)，經(jīng)扭轉(zhuǎn)過(guò)程，胚胎被羊膜和羊膜液完全包圍.

小鼠幼仔在受孕后19-20天出生(二)無(wú)脊椎動(dòng)物模式生物

1.果蠅(Drosophilamelanogaster)果蠅是遺傳學(xué)的經(jīng)典模式生物，已有100多年的研究歷史。但作為發(fā)育生物學(xué)研究模型，在早期并未受到重視。1980年初，德國(guó)科學(xué)家Nesslein-Volhard

C和美國(guó)學(xué)者WeichausE以果蠅作為材料，研究發(fā)育調(diào)控的遺傳基礎(chǔ)，他們和另一位美國(guó)遺傳學(xué)家LewisEB分享了1995年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。果蠅為雙翅目昆蟲(chóng)，個(gè)體小，生命周期短，繁殖容易，操作簡(jiǎn)便，成本低廉，其胚胎和成體都具有豐富的表型特征。果蠅是目前遺傳學(xué)背景最清楚的物種，其基因組序列測(cè)序已全部完成(約包含13600個(gè)基因)，相關(guān)遺傳學(xué)研究手段非常完備，在長(zhǎng)期的遺傳學(xué)研究過(guò)程中積累了大量遺傳突變品系，為果蠅的發(fā)育遺傳學(xué)研究提供了有利條件。

果蠅在250C下由卵至成蟲(chóng)約需11天，經(jīng)過(guò)卵、幼蟲(chóng)、蛹和成蟲(chóng)4個(gè)階段。果蠅卵呈長(zhǎng)橢圓形，精子通過(guò)卵殼前部的卵孔入卵.其胚胎發(fā)育很快，受精卵在24h內(nèi)就可以孵化為幼蟲(chóng).卵裂為表面卵裂。在早期階段，合子核進(jìn)行一系列快速分裂，而胞質(zhì)不分裂，形成合胞體(syncytium).核第8次分裂后,在胚胎最后部的核最先被細(xì)胞膜分隔形成極細(xì)胞，將形成生殖細(xì)胞。核第9次分裂后，大部分核開(kāi)始遷移到卵的邊緣，稱為合胞體胚盤(pán)(syncytialblastoderm).受精約3個(gè)小時(shí)后，卵周邊的核被新形成的胞膜包圍，形成細(xì)胞化胚盤(pán)(celluarblastoderm).原腸作用過(guò)程(圖緒.8)中，先是胚胎腹側(cè)的預(yù)定中胚層細(xì)胞沿腹中線內(nèi)陷，形成腹溝(ventralfurrow)。隨后這部分細(xì)胞與表層組織分離，形成中胚層管。這些細(xì)胞將遷移至外胚層下，發(fā)育成為肌肉和其他結(jié)締組織。隨著中胚層組織的內(nèi)陷，原來(lái)位于胚胎背側(cè)的細(xì)胞也逐漸向腹側(cè)遷移集中。仍停留在背側(cè)的少量細(xì)胞不再繼續(xù)分裂，也不參與胚胎本身的構(gòu)成，而是形成胚外組織，稱為羊漿膜(amnioserosa)。而集中于胚胎腹側(cè)的細(xì)胞帶稱為胚帶(germband)。胚帶包含了外胚層和位于其下方的中胚層組織，將來(lái)形成胚胎的主體結(jié)構(gòu)，也是將要分節(jié)的部分。位于外胚層最腹側(cè)的預(yù)定神經(jīng)母細(xì)胞逐漸陷入胚胎內(nèi)部，發(fā)育為神經(jīng)組織。位于腹溝前后兩端的內(nèi)胚層細(xì)胞也分別內(nèi)陷，分別形成中腸的前部和后部，兩者隨后融合形成完整的中腸。在中腸細(xì)胞內(nèi)陷時(shí)，在其前后部同時(shí)帶人一部分外胚層細(xì)胞內(nèi)陷，分別形成前腸和后腸。隨著原腸作用的進(jìn)行，胚帶開(kāi)始延伸，胚帶后端不斷向背側(cè)延伸并折向前方。到胚帶延伸完成時(shí)，胚帶開(kāi)始出現(xiàn)分節(jié)。胚胎的表皮出現(xiàn)一系列均勻分布的小溝，將胚胎分為14個(gè)區(qū)域，此時(shí)出現(xiàn)的分節(jié)是副體節(jié)。副體節(jié)與后來(lái)的體節(jié)在位置上并不對(duì)應(yīng)，每一體節(jié)包含前一副體節(jié)的后2/3與后一副體節(jié)的前1/3。副體節(jié)在胚胎發(fā)育中的出現(xiàn)是短暫的，但它奠定了胚胎軀體結(jié)構(gòu)劃分的基礎(chǔ)，也是許多分節(jié)基因表達(dá)區(qū)域的基本單位。大約在7.5h胚帶開(kāi)始回縮，在這一過(guò)程中胚胎開(kāi)始出現(xiàn)明確的體節(jié)，包括3個(gè)頭部體節(jié)，3個(gè)胸部體節(jié)，8個(gè)腹部體節(jié)和1個(gè)尾節(jié).果蠅胚胎大約在受精后24h孵出成為幼蟲(chóng)。幼蟲(chóng)要經(jīng)過(guò)兩次蛻皮，因此分為1、2、3齡幼蟲(chóng)。幼蟲(chóng)表皮具有規(guī)則分布的齒狀突起帶(denticlebelt)，這些突起帶的形狀和大小具有體節(jié)特異性，這些是研究果蠅胚胎前一后軸和背-腹軸發(fā)育的重要表型依據(jù)。果蠅的3齡幼蟲(chóng)化成蛹，在激素刺激下發(fā)生變態(tài)，由幼蟲(chóng)變?yōu)槌上x(chóng)。在變態(tài)過(guò)程中大部分幼蟲(chóng)組織被吸收而被成體結(jié)構(gòu)所代替。果蠅成體的許多結(jié)構(gòu)都是由成蟲(chóng)盤(pán)(imaginaldisc)發(fā)育而來(lái)的，包括腿、翅膀、眼睛、觸角及生殖腺等。成蟲(chóng)盤(pán)是在胚胎發(fā)育階段由特定區(qū)域的表皮細(xì)胞群內(nèi)陷形成的囊狀結(jié)構(gòu)。

2.線蟲(chóng)：秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)英國(guó)科學(xué)家SydneyBrenner在20世紀(jì)60年代開(kāi)始選擇線蟲(chóng)作為發(fā)育生物學(xué)模式動(dòng)物，他與其合作者HRobertHorvitz和JohnESulston獲得了2002年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。線蟲(chóng)成蟲(chóng)僅約1mm長(zhǎng)，構(gòu)造簡(jiǎn)單，全身透明，細(xì)胞數(shù)目少，發(fā)育中的細(xì)胞譜系(celllineage)幾乎固定，易于追蹤。線蟲(chóng)生命周期短，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，便于遺傳突變篩選，并可用液氮長(zhǎng)期保存。線蟲(chóng)的基因組測(cè)序已在1998年完成(共含19099個(gè)基因)，是第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的多細(xì)胞動(dòng)物.線蟲(chóng)分雌雄同體和雄性兩性別，雌雄同體為主要形式.雌雄同體個(gè)體的性染色體為xx型，而雄性個(gè)體為xo型，只一條性染色體.雄體是減數(shù)分裂過(guò)程中由于染色體丟失造成的。雌雄同體個(gè)體可通過(guò)自體受精產(chǎn)生后代，也可與雄性個(gè)體交配異體受精。成熟的雌雄同體個(gè)體具有959個(gè)體細(xì)胞，約2000個(gè)生殖細(xì)胞。雄蟲(chóng)則有1031個(gè)體細(xì)胞和約1000個(gè)生殖細(xì)胞.線蟲(chóng)大致呈圓柱形，外表覆有角質(zhì)化層，下方為下皮層(hypodermis)，然后是肌肉。消化系統(tǒng)包括咽和腸道。其體腔為假體腔，體腔周?chē)鷽](méi)有中胚層細(xì)胞包被。雌雄同體性腺為雙臂狀，開(kāi)口至腹側(cè)中部的陰門(mén)。在性腺中，距陰門(mén)最近的細(xì)胞分化為精子貯存于體內(nèi)。卵子細(xì)胞核產(chǎn)生于性腺遠(yuǎn)端，通過(guò)減數(shù)分裂形成，它們最初以合胞體狀態(tài)存在，直到受精前才形成完整的細(xì)胞膜。卵子在產(chǎn)出的過(guò)程中受精，在排出母體時(shí)通常處于卵裂階段(約40個(gè)細(xì)胞)。雄體性腺為單臂狀，只能產(chǎn)生精子。在250C條件下，線蟲(chóng)完成一個(gè)生命周期約需2.5天(圖緒.9)。胚胎的前后軸是由精子人卵處決定的，精子入卵的部分成為胚胎的后端。精子入卵引起卵質(zhì)的重組，受精卵中間部分出現(xiàn)一個(gè)“分裂溝”，但此時(shí)并不真正分裂，稱為“假卵裂”(pseudocleavage).合子卵裂為不對(duì)稱卵裂(圖緒.10)

第一次卵裂后前部的細(xì)胞為AB細(xì)胞，而后段的細(xì)胞稱為P細(xì)胞。AB細(xì)胞繼續(xù)分裂為ABa和ABp細(xì)胞。而P細(xì)胞后幾次的分裂方式則類(lèi)似干細(xì)胞，即每次分裂后都保持其中一個(gè)細(xì)胞為P細(xì)胞,另外一個(gè)細(xì)胞分別為EMS,C和D細(xì)胞(圖緒.10)。P4細(xì)胞是生殖細(xì)胞前體。EMS細(xì)胞繼續(xù)分裂為一個(gè)E細(xì)胞和一個(gè)MS細(xì)胞.E細(xì)胞將發(fā)育為內(nèi)胚層細(xì)胞。線蟲(chóng)胚胎的“原腸作用”持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。在28細(xì)胞時(shí)期，兩個(gè)E細(xì)胞開(kāi)始向內(nèi)部遷移，此時(shí)可以算作是原腸作用的開(kāi)始。隨后由C和D細(xì)胞產(chǎn)生的肌細(xì)胞和由ABa細(xì)胞產(chǎn)生的咽細(xì)胞也依次由腹裂(ventralcleft)卷入胚胎內(nèi)部。胚胎的腹裂相當(dāng)于胚孔。腹裂在290細(xì)胞時(shí)期合。胚胎在受精后約14h孵化成為幼蟲(chóng)。線蟲(chóng)胚胎發(fā)育過(guò)程中的細(xì)胞分裂方式一成不變，其細(xì)胞譜系已被完全確定(圖緒.11).幼蟲(chóng)經(jīng)4次蛻皮成為成體，然后在3天內(nèi)產(chǎn)下300多個(gè)卵，并在2周后死亡.五、發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)

(一)常用發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù)1.顯微鏡技術(shù)由于胚胎個(gè)體通常很小，顯微鏡和解剖鏡仍是發(fā)育生物學(xué)研究的必備工具。除了常規(guī)的光學(xué)顯微鏡外，一些特殊的顯微鏡也廣泛用于發(fā)育生物學(xué)研究。例如，相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)和微分干涉差顯微鏡(differentialinterference.contrastmicroscope)適用于觀察活的或未染色的樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu).A.光鏡技術(shù)取材、固定、脫水、包埋、制片、染色、觀察B.電鏡技術(shù)

透射電鏡術(shù):取材、固定、脫水、包埋、制片、染色、觀察組織塊(lmm3)用戊二醛與餓酸兩次固定，脫水后樹(shù)脂包埋，用超薄切片機(jī)切片，再經(jīng)醋酸鈾和擰橡酸鉛染色。電子束射落到切片時(shí)，隨細(xì)胞構(gòu)成成分的密度以及吸附重金屬鈾、鉛、餓的程度不同,而發(fā)生相應(yīng)的電子散射。當(dāng)電子束技射到密度大、吸附重金屬多的結(jié)構(gòu)(如溶酶體)時(shí)，電子被散射得多，因此，射落到熒光屏上的電子少而呈暗像，電鏡照片上呈黑或深灰色，習(xí)慣稱該結(jié)構(gòu)為高電子密度；反之呈淺灰色，稱低電子密度。

掃描電鏡術(shù)：不需要制備切片，組織塊(約0.3cm大小)用戊二醛和餓酸固定，經(jīng)脫水干燥，表面噴鍍薄層碳與金屬膜，觀察.激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope)是20世紀(jì)80年代初研制成功的一種高光敏度、高分辨率的新型儀器，近年來(lái)在發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用.共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。某些熒光物質(zhì)(如熒光標(biāo)記染料或熒光蛋白)在一定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射下會(huì)發(fā)出熒光。利用熒光染料標(biāo)記的特異性抗體或探針，可對(duì)胚胎或細(xì)胞中的特定蛋白或mRNA的分布進(jìn)行定性和定量研究。傳統(tǒng)的熒光顯微鏡的最大缺點(diǎn)是成像質(zhì)量差。共聚焦顯微鏡技術(shù)很好地解決了這一問(wèn)題。2.組織切片技術(shù)要觀察到胚胎的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，通常要進(jìn)行組織切片。最常用的技術(shù)是石蠟切片技術(shù)。石蠟切片術(shù)(paraffinsectioning)：取材、固定、脫水、包埋、切片(5～10μm厚)(連續(xù)切片）、貼片、脫蠟、染色、觀察蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosinstaining，

HE染色法)：蘇木精為堿性染料，使染色質(zhì)和核糖體著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料使胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)著紅色

冷凍切片是利用特殊的低溫包埋劑對(duì)樣品進(jìn)行包埋，在低溫條件下進(jìn)行切片的技術(shù)。通常冷凍切片的質(zhì)量比石蠟切片要差，也很難進(jìn)行連續(xù)切片，但方便快捷,對(duì)樣品中蛋白質(zhì)和核酸的保存也較好。特殊染色用硝酸銀將神經(jīng)細(xì)胞染為黑色(鍍銀染色法)用醛復(fù)紅將彈性纖維和肥大細(xì)胞的分泌顆粒染為紫色.活體染色將無(wú)毒或毒性小的染料經(jīng)靜脈注入后，再取材制成切片觀察.如注入的臺(tái)盼藍(lán)(trypanblue)可被肝、脾器官內(nèi)的巨噬細(xì)胞吞噬.在組織化學(xué)術(shù),常使用熒光染料染色或作為標(biāo)記物,用熒光顯微鏡觀察3.免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）根據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合原理，檢測(cè)組織切片中的肽和蛋白質(zhì)用標(biāo)記的抗體與組織中的抗原結(jié)合，標(biāo)記物可于顯微鏡下觀察。肽和蛋白質(zhì)均具有抗原性。當(dāng)把人或動(dòng)物的某種肽或蛋白質(zhì)作為抗原注入另一種動(dòng)物，其體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生針對(duì)該抗原的特異性抗體(免疫球蛋白)。將抗體從動(dòng)物血清中提出后，與標(biāo)記物相結(jié)合，即成為標(biāo)記抗體。用后者與組織切片孵育，抗體則與組織中相應(yīng)抗原特異性結(jié)合，在顯微鏡下通過(guò)觀察標(biāo)記物而獲知該肽或蛋白質(zhì)的分布部位。標(biāo)記物有熒光素（熒光顯微鏡觀察）、辣根過(guò)氧化物酶（光鏡或電鏡觀察）、膠體金（多用于電鏡觀察）免疫組織化學(xué)(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記)胰島B細(xì)胞呈胰島素陽(yáng)性免疫組織化學(xué)(熒光素標(biāo)記)毛血管內(nèi)皮細(xì)胞呈vWF陽(yáng)性

4.分子生物學(xué)技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)，反轉(zhuǎn)錄PCR(RT：-PCR)，

Northern印跡雜交，Western印跡雜交，免疫共沉淀技術(shù)等都常用于發(fā)育生物學(xué)研究，如用于檢測(cè)目的基因或蛋白質(zhì)在某一發(fā)育時(shí)期或特定組織中的表達(dá)。5.原位雜交技術(shù)核酸分子雜交組織化學(xué)術(shù)，檢測(cè)基因（DNA片段）的有無(wú)、基因的表達(dá)活性（mRNA）。原理：用帶標(biāo)記物的已知堿基順序的核酸探針與細(xì)胞內(nèi)待測(cè)核酸按堿基配對(duì)原則進(jìn)行特異性原位結(jié)合（雜交），并通過(guò)對(duì)標(biāo)記物的顯示和檢測(cè)，而獲知待測(cè)核酸的有無(wú)及相對(duì)量。常用標(biāo)記物有放射性核素35S、32P、3H和地高辛6.顯微注射顯微注射技術(shù)可將外源DNA、RNA或標(biāo)記物等導(dǎo)人早期胚胎細(xì)胞中。在非洲爪瞻和斑馬魚(yú)中,用于對(duì)基因功能的研究和細(xì)胞譜系的標(biāo)記研究。在果蠅和小鼠中，常用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建.由于不同動(dòng)物胚胎大小差異很大，顯微注射所需顯微操作系統(tǒng)也有所差異。非洲瓜蟾和斑馬魚(yú)胚胎可在解剖鏡下操作，而小鼠和果蠅胚胎需在顯微鏡下操作。

原位雜交臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞呈心房鈉尿肽陽(yáng)性7.報(bào)道基因技術(shù)常用于啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的分析研究。采用一些產(chǎn)物易于檢測(cè)的基因(即報(bào)道基因，reportergene)與待研究的表達(dá)調(diào)控序列串聯(lián),然后通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入胚胎體內(nèi)，通過(guò)分析報(bào)道基因產(chǎn)物的表達(dá)來(lái)研究目的片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性。常用的報(bào)道基因有綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)和lacZ基因。GFP的分布可在熒光顯微鏡下直接觀察；lacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，可以用特異底物進(jìn)行顯色而研究其產(chǎn)物分布。熒光素酶(luciferase)報(bào)道基因以往常用于體外條件下基因表達(dá)活性的定量分析，特別是作為報(bào)道基因用于信號(hào)傳遞途徑的研究，近年來(lái)，隨著高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)能夠?qū)ε咛ド踔脸审w小鼠體內(nèi)的熒光分布進(jìn)行成像，熒光素酶報(bào)道基因也開(kāi)始被用于體內(nèi)研究。8.細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)研究胚胎早期卵裂球分化命運(yùn).在胚胎移植實(shí)驗(yàn)中標(biāo)記供體或受體組織，在顯微注射實(shí)驗(yàn)中追蹤被注射卵裂球的命運(yùn)與表型等.早期常用的標(biāo)記物包括活體染料尼羅藍(lán)和中性紅，使用方便，價(jià)格便宜，但很難標(biāo)記胚胎內(nèi)部組織，隨胚胎發(fā)育染料會(huì)有擴(kuò)散和衰退現(xiàn)象.現(xiàn)在細(xì)胞外標(biāo)記染料常用親脂性熒光染料DiI和DiO.它會(huì)溶于標(biāo)記細(xì)胞的細(xì)胞膜中并很好地保存于子代細(xì)胞中。在紫外線照射下，DiI會(huì)發(fā)出紅色熒光，而DiO會(huì)發(fā)出綠色熒光。其缺點(diǎn)是會(huì)溶于有機(jī)溶劑，不適于需進(jìn)行組織切片的實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物常用熒光標(biāo)記葡聚糖和辣根過(guò)氧化物酶，這些標(biāo)記物不會(huì)在細(xì)胞間擴(kuò)散，示蹤比較準(zhǔn)確。細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記物需通過(guò)顯微注射導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)熒光顯微鏡或組織化學(xué)方法進(jìn)行定位。在顯微注射實(shí)驗(yàn)中，較常用的示蹤基因是GFP和lacZ基因，即將GFP或lacZmRNA與要研究的活性物質(zhì)共同注射入胚胎卵裂球中，通過(guò)觀察胚胎中GFP或β-半乳糖苷酶的分布來(lái)確定獲得注射物質(zhì)的組織。

(二)發(fā)育遺傳學(xué)技術(shù)發(fā)育生物學(xué)的基本任務(wù)之一是研究基因在胚胎發(fā)育中的作用。這一問(wèn)題可以從兩個(gè)方向研究。一是正向遺傳學(xué)手段,即大規(guī)模隨機(jī)誘變，產(chǎn)生發(fā)育異常的突變個(gè)體，然后再尋找突變的基因。二是反向遺傳學(xué)方法，即通過(guò)功能喪失(lossoffunction)或功能獲得(gainoffunction)方法對(duì)已知基因進(jìn)行功能研究。

1.正向遺傳學(xué)技術(shù)A.大規(guī)模誘變篩選誘變篩選通常是通過(guò)射線或化學(xué)誘變劑處理父本個(gè)體,在其生殖系細(xì)胞中產(chǎn)生隨機(jī)突變，然后與野生型母本個(gè)體雜交，子一代(Fl)個(gè)體中就有可能攜帶基因突變,而每一個(gè)體攜帶的基因突變可能都不同于其他個(gè)體.Fl中的每一個(gè)體再與野生型個(gè)體雜交，所產(chǎn)生的每一子二代(F2)群體再進(jìn)行群體內(nèi)的雜交.如果Fl個(gè)體攜帶有基因突變，F(xiàn)2個(gè)體中就會(huì)有一半個(gè)體是雜合突變體，在F3代中有1/4的交配組合的后代中就有可能出現(xiàn)純合突變個(gè)體而表現(xiàn)出某種發(fā)育異常.突變發(fā)生后出現(xiàn)的表型改變是多種多樣的，有的可能十分微弱，需要精細(xì)的生化技術(shù)才能檢測(cè)出與野生型的差別，有的突變可能是致死的。最常見(jiàn)的基因突變類(lèi)型是功能喪失，即突變后的蛋白質(zhì)比野生型蛋白質(zhì)活性差。導(dǎo)致某一蛋白質(zhì)完全失活的突變稱為無(wú)效突變(nullmutation)。有時(shí)同一基因會(huì)出現(xiàn)一系列不同程度的功能喪失性突變。在有些情況下突變也可能是獲得功能性的，如某些受體或轉(zhuǎn)錄因子可能會(huì)由于突變而持續(xù)活化。對(duì)果蠅常染色體隱性突變篩選,引入了平衡染色體(halanGerchromosome).平衡染色體有3個(gè)特點(diǎn)：一是含有大規(guī)模的染色體易位，具有正常功能但不會(huì)與相應(yīng)染色體間進(jìn)行同源重組，保證了突變的遺傳穩(wěn)定性。二是該染色體上含有一個(gè)顯性標(biāo)記基因，便于鑒別含有該染色體的個(gè)體。三是在純合狀態(tài)下是致死的。用于進(jìn)行化學(xué)誘變的果蠅品系相應(yīng)染色體中帶有一個(gè)隱性標(biāo)記基因.經(jīng)過(guò)化學(xué)誘變的雄性個(gè)體與攜帶平衡染色體的雌性個(gè)體雜交，通過(guò)表型檢測(cè)挑選Fl代個(gè)體中帶有平衡染色體的雄性個(gè)體進(jìn)行下一步的雜交。與Fl個(gè)體雜交的雌性個(gè)體中相應(yīng)染色體上帶有一個(gè)溫度敏感型的致死基因。在290C培養(yǎng)時(shí)攜帶這一基因的胚胎會(huì)死亡.這樣，在F2代中，存活個(gè)體都有帶有一條平衡染色體和一條可能帶有突變基因的染色體.F2代雌雄個(gè)體間交配產(chǎn)生F3代個(gè)體.如果Fl代中的果蠅個(gè)體相應(yīng)染色體上帶有基因突變，在F3代個(gè)體中就會(huì)產(chǎn)生該基因的純合突變體。如果該突變不致死，相應(yīng)個(gè)體就會(huì)出現(xiàn)父本個(gè)體所攜帶的隱性表型；如果是致死的就要檢查死亡胚胎所出現(xiàn)的表型。而F3代中存活但不表現(xiàn)出父本表型的個(gè)體為攜帶有平衡染色體的雜合突變體,可用于該品系的保存.B.插入誘變篩選(insertionalmutagenesisscreen)利用轉(zhuǎn)座子(transposon)或病毒載體作為誘變劑。在果蠅中最常用的轉(zhuǎn)座子是p-因子(P-element).p-因子存在于某些果蠅類(lèi)群中，可隨機(jī)插入基因組中，并可在基因組中移動(dòng)。一個(gè)完整的p-因子包括轉(zhuǎn)座所需的特殊序列(包括末端重復(fù)序列等)和一個(gè)轉(zhuǎn)座酶編碼基因。在插入突變篩選中采用的P-因子是缺陷型的，缺乏有功能的轉(zhuǎn)座酶基因。p-因子介導(dǎo)的插入突變篩選通過(guò)不同品系果蠅的雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)。其中一個(gè)品系攜帶有缺陷型的p-因子，而另一個(gè)品系攜帶有轉(zhuǎn)座酶，在其后代個(gè)體生殖細(xì)胞中，轉(zhuǎn)座酶就會(huì)誘導(dǎo)p-因子在基因組中的隨機(jī)轉(zhuǎn)座并有可能造成某些基因的突變。這些個(gè)體再與野生型個(gè)體雜交，其后代中就會(huì)含有雜合突變個(gè)體，同時(shí)p-因子與轉(zhuǎn)座酶基因通常會(huì)分離，從而保證其后代突變的穩(wěn)定性。這些雜合突變體再通過(guò)近交就可以獲得純合突變體并加以研究。該方法的不足處是p-因子的插入位點(diǎn)并不是完全隨機(jī)的，它不能覆蓋基因組中的全部基因。反轉(zhuǎn)錄病毒是一類(lèi)RNA病毒，它們進(jìn)入宿主細(xì)胞中后所攜帶的RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA并隨機(jī)整合入宿主基因組中.利用這一特性人們構(gòu)建了缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒載體用于轉(zhuǎn)基因研究。這類(lèi)載體具有隨機(jī)整合入宿主基因組的能力，也可用于隨機(jī)插入誘變篩選。這一方法在小鼠和斑馬魚(yú)中應(yīng)用較多。

C.突變基因的克隆獲得感興趣的突變體后,就要克隆引起該突變的基因?qū)τ趐-因子或病毒載體引起的插人突變，基因的克隆可利用p-因子序列作為探針，從該突變體的基因組文庫(kù)中篩選出含有P一因子的克隆，從而確定p-因子的插人位點(diǎn)及被阻斷的基因。也可通過(guò)PCR方法確定其插入位點(diǎn)。對(duì)于化學(xué)誘變劑或射線照射引起的突變，基因的克隆就困難得多,多數(shù)情況下要采用定位克隆(positionalcloning)的辦法。定位克隆是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行基因分離。通過(guò)分析突變位點(diǎn)與已知分子標(biāo)記的連鎖關(guān)系來(lái)確定突變基因的染色體位置。目的基因染色體定位的精確程度是定位克隆成功的關(guān)鍵，它取決于巳知染色體分子標(biāo)記的精細(xì)程度并需要足夠大的突變體類(lèi)群。較常用的分子標(biāo)記檢測(cè)手段包括簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性(simplesequencelengthpolymorphisms,SSLPs)、限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLPs)和單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisnSNPs)分析。通過(guò)這些手段通?？梢詫⑼蛔兓蚨ㄎ坏綆装偾A基的范圍內(nèi).下一步的任務(wù)是獲取該染色體片段的基因組序列.獲取相應(yīng)序列后，再通過(guò)生物信息學(xué)等手段確定該片段可能含有的基因，并根據(jù)這些基因的可能功能及該突變體的表型等初步判斷導(dǎo)致該突變的候選基因，最后通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段予以確認(rèn)。要確定所得基因就是所要尋找的目的基因，要滿足以下條件：首先在該突變體中要檢測(cè)到相應(yīng)的基因突變，并且該突變足以引起該基因的失活或功能異常；其次，該基因的野生型能夠使該突變體表型恢復(fù)(如通過(guò)mRNA注射或轉(zhuǎn)基因等手段)；第三，在野生型個(gè)體中，通過(guò)技術(shù)手段阻斷該基因的功能(如通過(guò)RNAi或反義技術(shù))，該個(gè)體應(yīng)表現(xiàn)出與突變體一致的表型。

2.反向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)多數(shù)物種來(lái)講，由于其世代周期長(zhǎng)、飼養(yǎng)管理困難等原因，進(jìn)行大規(guī)模誘變篩選是很困難的。因此，反向遺傳學(xué)手段就顯得重要了。反向遺傳學(xué)通過(guò)對(duì)已知基因進(jìn)行功能缺失或過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，研究胚胎個(gè)體所產(chǎn)生的表型而分析目的基因的功能。常用的方法包括基因敲除或通過(guò)抑制性因子抑制目的基因的功能，或通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)異位表達(dá)目的基因等。隨著許多模式生物基因組測(cè)序的完成，反向遺傳學(xué)技術(shù)將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

A.基因敲除技術(shù)基因敲除(geneknock-out)是獲得攜帶有特定基因突變個(gè)體的技術(shù),研究基因在發(fā)育中的功能.20世紀(jì)80年代初,胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES細(xì)胞)分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。小鼠胚胎干細(xì)胞取自小鼠胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，可在體外連續(xù)培養(yǎng)而保持其分化全能性。當(dāng)ES細(xì)胞被注入受體胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)時(shí)，它可參與形成小鼠胚胎的各種組織，形成嵌合體小鼠。通過(guò)同源重組技術(shù)可對(duì)胚胎干細(xì)胞的基因組進(jìn)行修飾，使其攜帶某一特定基因突變。進(jìn)行基因敲除第一步是構(gòu)建用于基因重組的突變基因結(jié)構(gòu)。用抗藥性基因[常用的是新霉素(neomycin)抗性基因]取代目的基因中含有起始密碼子的外顯子部分，使目的基因完全失活。在基因突變片段兩側(cè)應(yīng)帶有足夠長(zhǎng)的與內(nèi)源基因相同位置同源的序列以利于同源重組的發(fā)生?；蛑亟M載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化等手段導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞中。通過(guò)抗藥性篩選可以獲得攜帶有重組基因的胚胎干細(xì)胞品系。經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)手段確定這些細(xì)胞攜帶有正確重組的基因后，就可以將這些干細(xì)胞注射入胚胎中以獲得嵌合體小鼠.B.條件基因敲除技術(shù)(conditionknockout)許多重要調(diào)控基因同時(shí)參與胚胎發(fā)育的許多過(guò)程，在傳統(tǒng)的完全基因敲除小鼠胚胎中是早期致死的，而無(wú)法研究該基因在晚期胚胎發(fā)育或特定組織中的功能。條件基因敲除小鼠是指僅使靶基因在特定的組織或發(fā)育時(shí)期失活.常采用Cre-lox系統(tǒng)。cre編碼一種重組酶，可以識(shí)別并結(jié)合loxP位點(diǎn)并切除位于兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的序列。進(jìn)行條件基因敲除需構(gòu)建兩個(gè)小鼠品系，在其中一個(gè)品系中在靶基因兩側(cè)都插入loxP位點(diǎn)，在另一個(gè)品系中需要轉(zhuǎn)入由組織特異性啟動(dòng)子控制的cre基因。將兩個(gè)小鼠品系進(jìn)行雜交，在其后代中,cre會(huì)在特定組織中表達(dá)，且靶基因會(huì)被Cre切除而失活，實(shí)現(xiàn)組織特異性的基因敲除(圖緒.16).由于Cre的作用效率并不能達(dá)到100%，在實(shí)際操作中l(wèi)oxP品系小鼠通常采用雜合體，即把基因中的一個(gè)拷貝帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)，另一拷貝是失活的，以保證條件基因敲除的效率.Cre-lox系統(tǒng)也可用于基因的組織特異性激活實(shí)驗(yàn)。在這種情況下，可將一段兩邊分別帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)并含有終止子的序列插入到目的基因內(nèi)部并構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠。當(dāng)這一品系的小鼠與特異的cre小鼠品系雜交時(shí)，在特定組織中目的基因內(nèi)部的插入序列就會(huì)被切除從而使目的基因被活化。C.RNA干擾技術(shù)抑制某一特定基因的表達(dá),是研究基因功能的重要方法.RNA干擾是近年來(lái)發(fā)展的一種特異性抑制基因表達(dá)的新方法。1998年，F(xiàn)ireA等發(fā)現(xiàn)將雙鏈RNA(dsRNA)注入線蟲(chóng)，可以誘導(dǎo)特異性的基因表達(dá)沉默(genesilencing)。他們將這種現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNAinterference，RNAi)。隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于從植物、真菌、線蟲(chóng)及昆蟲(chóng)直到哺乳動(dòng)物的幾乎所有真核生物中。近年來(lái)，RNA干擾的研究已成為熱點(diǎn)，并被Science評(píng)選為2002年度最重要科技突破的首位。RNAi的作用機(jī)制如圖緒.17所示在RNAi過(guò)程中，長(zhǎng)的dsRNA首先被二種RNA酶Ⅲ(Dicer)裂解為21-23個(gè)核苷酸的小干擾dsRNA(smallinterferingRNA，siRNA)，這些siRNA帶有5’端磷酸基團(tuán)和3’端的羥基，3’末端帶有2-3個(gè)突出的核苷酸。siRNA進(jìn)而結(jié)合到一種蛋白復(fù)合體中，形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNAinducedsilencingcomplex，

RISC)。雙鏈siRNA解旋，RISC利用其反義鏈識(shí)別同源mRNA并在配對(duì)區(qū)的中間將目標(biāo)mRNA水解,從而導(dǎo)致特異性的基因表達(dá)抑制.此外，微小RNA(microRNA，miRNA,與siRNA非常相似，只是產(chǎn)生機(jī)制不同)還可抑制目標(biāo)mRNA的翻譯.

人們已利用RNAi技術(shù)對(duì)線蟲(chóng)進(jìn)行了全基因組范圍的基因功能研究在線蟲(chóng)中，導(dǎo)入dsRNA可采用如下3種方法之一：①直接注入線蟲(chóng)的性腺。②將線蟲(chóng)浸泡在含dsRNA的溶液中。③用攜帶RNAi表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌喂食線蟲(chóng)。但在脊椎動(dòng)物中，RNAi的作用效果還不理想，特別是作用的特異性似乎不夠高，阻礙了這一技術(shù)的應(yīng)用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,dsRNA的長(zhǎng)度超過(guò)30個(gè)堿基對(duì)時(shí)會(huì)引起非特異性的抗病毒反應(yīng)(如非特異性翻譯抑制和細(xì)胞凋亡，刺激干擾素表達(dá)等)。人們采用了多種方法來(lái)避免這一問(wèn)題。一是采用化學(xué)合成的21-23個(gè)核苷酸的siRN