Tan第五章目的基因的導(dǎo)入和重組子的篩選課件

本課程內(nèi)容第一章緒論第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的載體第四章目的基因的制備第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選第六章外源基因的表達第七章基因操作的基本技術(shù)第八章植物基因工程及應(yīng)用第九章動物基因工程及應(yīng)用第十章醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用12/13/20221歡迎同學(xué)們聽課！本課程內(nèi)容第一章緒論12/13/20221歡迎同學(xué)們聽課！第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選5.1DNA片段的連接重組5.2受體細胞選擇的基本原則5.3基因轉(zhuǎn)移5.4重組子的篩選12/13/20222歡迎同學(xué)們聽課！第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選5.1DNA片段的連接5.1DNA片段的連接重組5.1.1DNA連接類型5.1.2DNA片段之間連接的方式5.1.3DNA重組中需注意的問題12/13/20223歡迎同學(xué)們聽課！5.1DNA片段的連接重組5.1.1DNA連接類型12DNA分子連接

不同的DNA片段（目的基因和載體）經(jīng)適當酶切后，在連接酶的作用下，連接在一起構(gòu)建成重組DNA分子。12/13/20224歡迎同學(xué)們聽課！DNA分子連接不同的DNA片段（目的基5.1.1DNA重組（連接）的類型插入重組:載體上只有唯一的酶識別位點隨機（非定向）插入置換重組(1)載體上有兩個同樣的酶識別位點隨機（非定向）置換(2)載體上有兩個不同的酶識別位點定向置換12/13/20225歡迎同學(xué)們聽課！5.1.1DNA重組（連接）的類型插入重組:12/13/25.1.2DNA片段之間連接的方式具互補黏性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行的連接DNA片段加linkeroradaptor后的連接12/13/20226歡迎同學(xué)們聽課！5.1.2DNA片段之間連接的方式具互補黏性末端片段之間的5.1.3DNA重組中需注意的問題兩端具相同粘性末端的DNA分子會發(fā)生自身環(huán)化。對于置換重組，需將切割的DNA分子經(jīng)過凝膠電泳分離，回收目的片段。無論單酶切還是雙酶切，目的DNA分子均可能發(fā)生串聯(lián)，必需檢測重組DNA插入片段的分子大小。12/13/20227歡迎同學(xué)們聽課！5.1.3DNA重組中需注意的問題兩端具相同粘性末端的DN5.2受體細胞及其選擇的基本原則5.2.1受體細胞5.2.2受體細胞選擇的基本原則12/13/20228歡迎同學(xué)們聽課！5.2受體細胞及其選擇的基本原則5.2.1受體細胞125.2.1受體細胞受體細胞（receptorcell）：又稱為宿主細胞或寄主細胞（hostcell）從實驗技術(shù)上講：是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞。從實驗?zāi)康纳现v：是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細胞。12/13/20229歡迎同學(xué)們聽課！5.2.1受體細胞受體細胞（receptorcell）5.2.2受體細胞選擇的原則外源DNA分子能穩(wěn)定存在，限制酶缺陷型；重組基因缺陷型；易于轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)；易篩選遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)；安全性高；內(nèi)源蛋白酶基因缺失或缺陷；遺傳密碼無明顯偏好性；具有較好的轉(zhuǎn)譯加工機制；較高的理論和實踐應(yīng)用價值。12/13/202210歡迎同學(xué)們聽課！5.2.2受體細胞選擇的原則外源DNA分子能穩(wěn)定存在，限5.3基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）載體與目的基因連接后，體系中可能存在下列分子：

a.未連接的載體分子

b.未連接的DNA片段

c.載體的自連

d.含有錯誤插入片段的重組DNA分子

e.重組DNA分子

轉(zhuǎn)化過程中，這些分子同時被轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)。未連接的分子即使被細菌攝取，只有在特殊的條件下才能復(fù)制，寄主的酶可降解這些DNA片段。自連的載體和錯誤插入的重組質(zhì)?？梢赃M入12/13/202211歡迎同學(xué)們聽課！5.3基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）載體與目的基因宿主細胞進行正常的復(fù)制。因此，需要將重組克隆鑒定出來。把重組DNA導(dǎo)入受體細胞進行擴增根據(jù)所用載體的特性選擇適宜的受體細胞及選擇適宜的重組DNA導(dǎo)入的方式：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)。12/13/202212歡迎同學(xué)們聽課！宿主細胞進行正常的復(fù)制。因此，需要將重組克隆鑒定出來。125.3基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）5.3.1重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌5.3.2重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌5.3.3重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細胞12/13/202213歡迎同學(xué)們聽課！5.3基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）5.3.1重5.3.1重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌5.3.1.1細菌轉(zhuǎn)化的機制5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）5.3.1.3電激法（電穿孔轉(zhuǎn)化法）5.3.1.4轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素12/13/202214歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌5.3.1.1細5.3.1.1細菌轉(zhuǎn)化的機制轉(zhuǎn)化(transformation)：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化。

自然界中，轉(zhuǎn)化并不是細菌或的遺傳信息的主要方式，實驗室中只有小部分的細菌可以很容易的轉(zhuǎn)化，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這類細菌含有DNA結(jié)合和吸收的代謝機制。正常條件下，大部分細菌包括大腸桿菌，只能吸收有限的DNA，為了提高轉(zhuǎn)化效率，建立了一系列的轉(zhuǎn)化方法：a.熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞b.PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

12/13/202215歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.1細菌轉(zhuǎn)化的機制轉(zhuǎn)化(transformatic.高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化d.顯微注射法轉(zhuǎn)化e.接合轉(zhuǎn)化f.噬菌體轉(zhuǎn)染12/13/202216歡迎同學(xué)們聽課！c.高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化12/13/202216歡迎同學(xué)們表4—1大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率Ca誘導(dǎo)107-8原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-6噬菌體轉(zhuǎn)化107-8電穿孔法106-9（<100Kb）結(jié)合轉(zhuǎn)化104-512/13/202217歡迎同學(xué)們聽課！表4—1大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）

原理：0oC、低濃度（50～100mM）CaCl2，Ca2+改變細胞膜的磷脂層結(jié)構(gòu)，提高膜的通透性，而且增強進入細胞的DNA分子抗DNase的能力。

特點：操作簡便，不需特殊儀器，一般實驗室均可進行。轉(zhuǎn)化率在5106～2107個轉(zhuǎn)化子/g質(zhì)粒DNA范圍內(nèi)，完全可滿足常規(guī)克隆的需要。12/13/202218歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）感受態(tài)細胞制備：

感受態(tài)細胞：指處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細胞。菌種活化、培養(yǎng)、收菌和進行CaCl2處理。DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞：冰浴、42oC熱激、37oC恢復(fù)、涂板培養(yǎng)。12/13/202219歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）感5.3.1.3電激法（電穿孔轉(zhuǎn)化法）原理：利用高壓電脈沖作用，在細菌細胞膜上進行電穿孔（electroporation），形成可逆的瞬間通道，促進外源DNA的有效吸收。

特點：1.感受態(tài)細胞制備簡單；2.轉(zhuǎn)化率高達109～1010個轉(zhuǎn)化子/g質(zhì)粒DNA；3.用途廣泛，但需特殊儀器電激儀。除感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化與化學(xué)法不同之外，其余步驟包括所設(shè)轉(zhuǎn)化對照與化學(xué)法相均相同。12/13/202220歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.3電激法（電穿孔轉(zhuǎn)化法）原理：利用高壓電脈沖作5.3.1.4轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素轉(zhuǎn)化率：是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率。轉(zhuǎn)化率計算：＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)/DNA分子總數(shù)或質(zhì)量或＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)/受體細胞數(shù)實際中按轉(zhuǎn)化子總數(shù)/DNA分子質(zhì)量(g)計算12/13/202221歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.4轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素轉(zhuǎn)化率：12/13/影響轉(zhuǎn)化效率的因素受體細胞的感受態(tài)，它決定轉(zhuǎn)化因子能否被吸收進入受體細胞；受體細胞的限制酶系統(tǒng)和其他核酸酶，它們決定轉(zhuǎn)化因子在整合前是否被分解；受體和供體染色體的同源性，它決定轉(zhuǎn)化因子的整合；重組DNA分子大小重組DNA純度、濃度12/13/202222歡迎同學(xué)們聽課！影響轉(zhuǎn)化效率的因素受體細胞的感受態(tài)，它決定轉(zhuǎn)化因子能否被吸收5.3.2重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)染(transfection)：采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細胞相似的方法，將重組噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細胞中的過程，稱為轉(zhuǎn)染。效率較低，103～104個噬菌斑/gDNA，較難滿足一般實驗要求，實踐中少用。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：是指通過噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)的過程。效率高，可達103～104個噬菌斑/gDNA，需進行體外包裝。12/13/202223歡迎同學(xué)們聽課！5.3.2重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)染(tran體外裝配（invitropackaging）：λDNA的轉(zhuǎn)染效率不高，如果將重組的λ分子裝配成頭-尾結(jié)構(gòu)的病毒粒子，將極大的提高效率。12/13/202224歡迎同學(xué)們聽課！體外裝配（invitropackaging）：λDNA噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法12/13/202225歡迎同學(xué)們聽課！噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法12/13/202225歡迎同學(xué)們聽噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法12/13/202226歡迎同學(xué)們聽課！噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法12/13/202226歡迎同學(xué)們聽λ噬菌體的體外裝配有兩種不同的系統(tǒng)可以應(yīng)用：

一種是cos位點突變的噬菌體的單品系系統(tǒng)。

另一種系統(tǒng)需要兩種不同的缺陷品系一個是基因D的突變體，另一個品系是基因E的突變體，由于蛋白質(zhì)合成的缺陷。體外的裝配過程可以利用兩種不同培養(yǎng)物的混合物，含有完整的外殼蛋白，完成裝配過程。將裝配的噬菌體接入細菌就可以完成正常的侵染過程。12/13/202227歡迎同學(xué)們聽課！λ噬菌體的體外裝配有兩種不同的系統(tǒng)可以應(yīng)用：

一種是λ噬菌體體外裝配的兩種系統(tǒng)12/13/202228歡迎同學(xué)們聽課！λ噬菌體體外裝配的兩種系統(tǒng)12/13/202228歡迎同學(xué)們噬菌斑λ和M13噬菌體都能形成噬菌斑，λ形成的是真正的噬菌斑(透明)，是由于細胞的裂解引起的；而M13的噬菌斑是渾濁的，因為細胞并未裂解，它引起的是細菌生長的減慢，而使細菌的濃度低于周圍細胞。12/13/202229歡迎同學(xué)們聽課！噬菌斑λ和M13噬菌體都能形成噬菌斑，λ形成的是真正的噬重組噬菌體的鑒定（一）利用插入失活鑒定

M13噬菌體，多種λ噬菌體載體都含有l(wèi)acZ’基因，可以通過插入失活鑒定重組噬菌體。

（二）λ噬菌體的cI基因的插入失活

λ噬菌體載體在cI基因位點上含有單一的酶切位點，該位點上插入外源基因可以導(dǎo)致該基因的失活，引起表現(xiàn)型的變化。正常的噬菌斑是渾濁的，但重組的噬菌斑是清亮的。

（三）利用Spi(sensitivetoP2inhibition)表型選擇

一般來講，λ噬菌體不能侵染已被P2噬菌體侵染的大腸桿菌細胞，因此λ噬菌體被稱為Spi+（對P2前噬菌體抑制敏感），插入新的DNA后，能變成spi-，可以侵染含有P2噬菌體的細菌，只有重組子是Spi-可以形成噬菌斑，因此可以很方便的選擇出來。12/13/202230歡迎同學(xué)們聽課！重組噬菌體的鑒定（一）利用插入失活鑒定

M13噬菌體，多（四）根據(jù)λ基因組的大小篩選

λ裝配系統(tǒng)，只有37kb-52kb的DNA分子可以進入頭部結(jié)構(gòu)，小于37kb的不能裝配。許多構(gòu)建的λ載體切除了部分DNA，因而小于37kb，只有插入外源DNA分子后才能被裝配到頭部結(jié)構(gòu)中，使載體的長度等于或大于37kb。對于這樣的λ噬菌體載體，只有重組的噬菌體才能進行正常的復(fù)制。12/13/202231歡迎同學(xué)們聽課！（四）根據(jù)λ基因組的大小篩選

λ裝配系統(tǒng)，只有37kb-利用lacZ'基因的插入失活篩選重組噬菌斑12/13/202232歡迎同學(xué)們聽課！利用lacZ'基因的插入失活篩選重組噬菌斑12/13/205.3.3重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細胞重組DNA分子導(dǎo)入植物細胞－植物基因工程(見后面第八章)重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細胞－動物基因工程(見后面第九章)12/13/202233歡迎同學(xué)們聽課！5.3.3重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細胞重組DNA分子導(dǎo)入植物5.4重組子篩選的方法5.4.1遺傳表型直接檢測法5.4.2依賴重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法5.4.3基因表達產(chǎn)物分析法5.4.4DNA序列測定法12/13/202234歡迎同學(xué)們聽課！5.4重組子篩選的方法5.4.1遺傳表型直接檢測法125.4.1遺傳表型直接檢測法根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選根據(jù)插入序列的表型特征篩選重組子12/13/202235歡迎同學(xué)們聽課！5.4.1遺傳表型直接檢測法根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選通過插入失活可以初步篩選重組子，但篩選到的克隆是否插入了正確的片段，還需要進一步的鑒定，鑒定的方法主要有如下幾種情況：

1限制性內(nèi)切酶法：外源片段通過特定的酶切位點插入到載體上，因此，可以通過這些限制性酶酶切重組質(zhì)粒，電泳分析插入片段長度是否正確。

2PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通過PCR的方法進行鑒定

3菌落原位雜交法：將在后面的章節(jié)中提到。

4基因產(chǎn)物檢測法：如果使用的是表達載體，那么就可以通過鑒定基因產(chǎn)物的方法鑒定正確的克隆。12/13/202236歡迎同學(xué)們聽課！通過插入失活可以初步篩選重組子，但篩選到的克隆是否插入了正確抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法pBR322有許多單一切點的限制性位點，可以用來切開分子插入新的DNA片段。如BamHI可以從四環(huán)素位點切開，使該基因不能表達，但仍能表達氨芐抗性基因，對四環(huán)素是敏感的。篩選重組pBR322按照以下方法進行，將轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)于氨芐培養(yǎng)基中，只有轉(zhuǎn)化細胞可以生長形成克隆，影印到四環(huán)素培養(yǎng)基上，不能在該培養(yǎng)基上生長的菌落可能就是目的克隆。這屬于負向選擇

12/13/202237歡迎同學(xué)們聽課！抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法pBR322有許多單一根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法（－互補篩選）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞利用遺傳選擇標記篩選哺乳底物轉(zhuǎn)基因細胞12/13/202238歡迎同學(xué)們聽課！根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選抗藥性選擇標記插入失活/插入表達12/13/202239歡迎同學(xué)們聽課！12/13/202239歡迎同學(xué)們聽課！利用tetR的插入失活篩選重組克隆12/13/202240歡迎同學(xué)們聽課！利用tetR的插入失活篩選重組克隆12/13/202240歡抗藥性選擇標記插入表達篩選法正向選擇重組子在培養(yǎng)基上能生長，而非重組子不能生長。12/13/202241歡迎同學(xué)們聽課！抗藥性選擇標記插入表達篩選法正向選擇12/13/202241-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法（－互補篩選）載體：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控序列和頭146個aa的編碼序列

宿主：缺失了lacZ基因，可編碼β-半乳糖苷酶C端序列

α-互補：lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體可以與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶隱性突變體之間實現(xiàn)互補。

在這樣的系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細菌獲得了amp抗性，自連質(zhì)?？梢院铣烧５拿?，而重組質(zhì)粒的細菌不能合成正常的酶。在培養(yǎng)基中添加酶的誘導(dǎo)物IPTG，乳糖的類似物X-gal乳糖酶作用下顯示藍色，藍斑是載體自連產(chǎn)物，而白色克隆是重組質(zhì)粒。這一系統(tǒng)稱為lacselection。12/13/202242歡迎同學(xué)們聽課！-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法（－互補篩選）載體：含有β-半X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達。

12/13/202243歡迎同學(xué)們聽課！X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-b利用lacZ'基因的插入失活篩選重組子12/13/202244歡迎同學(xué)們聽課！利用lacZ'基因的插入失活篩選重組子12/13/20224植物轉(zhuǎn)基因載體的選擇標記/報告基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinphosphotransferaser-II,NPTII)基因:抗新霉素（neomycin）或卡那霉素（kanamycin）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycinphosphotransferase,HPT)基因:抗卡那霉素或潮霉素（hygromycin）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloraphenicolacetyltransferase,CAT)基因:抗氯霉素-葡萄糖酸苷酶(-Glucuronidase,GUS)基因:

熒光檢測或組織化學(xué)檢測，非正向選擇抗除草劑bar基因：抗PPT（L-谷氨酸的類似物）12/13/202245歡迎同學(xué)們聽課！植物轉(zhuǎn)基因載體的選擇標記/報告基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neom動物轉(zhuǎn)基因載體的選擇標記基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloraphenicolacetyltransferase,CAT)基因:抗氯霉素新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinphosphotransferaser-II,NPTII)基因:抗新霉素（neomycin）或卡那霉素（kanamycin）胸苷激酶基因（thymidinekinase,TK）二氫葉酸還原酶(dihydrofolatereductase,DHFR)基因黃嘌呤－鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(XGPRT)12/13/202246歡迎同學(xué)們聽課！動物轉(zhuǎn)基因載體的選擇標記基因氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chlorap5.4.2依賴重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法5.4.2.1菌落裂解瓊脂糖凝膠電泳快速檢測法5.4.2.2限制性內(nèi)切酶酶切分析檢測5.4.2.3PCR法檢測5.4.2.4核酸分子雜交檢測法12/13/202247歡迎同學(xué)們聽課！5.4.2依賴重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法5.4.2.15.4.2.1瓊脂糖凝膠電泳檢測原理：根據(jù)外源DNA片段插入的重組質(zhì)粒與載體DNA之間大小的差異來區(qū)分重組子和非重組子。特點：操作簡單、快捷，成本低，適合大規(guī)模篩選。特別適用于插入片段較大的重組子的篩選。12/13/202248歡迎同學(xué)們聽課！5.4.2.1瓊脂糖凝膠電泳檢測原理：12/13/2025.4.2.2限制性內(nèi)切酶酶切分析檢測原理：小量抽提質(zhì)粒DNA，利用限制性內(nèi)切酶酶切，通過電泳分析確定是否含有插入片段及其大小、插入方向。特點：可以區(qū)別假陽性重組子，結(jié)果判斷較準確，但操作比較復(fù)雜，不適用于大規(guī)模的篩選。12/13/202249歡迎同學(xué)們聽課！5.4.2.2限制性內(nèi)切酶酶切分析檢測原理：12/13/5.4.2.3PCR法檢測原理：利用載體上已知序列設(shè)計的引物進行PCR反應(yīng)，通過電泳分析確定是否含有插入片段及其大小。特點：操作簡單，便于大規(guī)模篩選，但Taq酶成本要考慮。12/13/202250歡迎同學(xué)們聽課！5.4.2.3PCR法檢測原理：12/13/2022505.4.2.4核酸分子雜交檢測法菌落/噬菌斑原位雜交：直接把菌落或噬菌斑印跡轉(zhuǎn)移到雜交膜上，不必進行核酸分離純化、限制酶酶切及凝膠電泳分離等操作，而是經(jīng)溶菌和變性處理后使DNA暴露出來并與雜交膜結(jié)合，再與特異性標記探針雜交，篩選出含有插入序列的菌落或噬菌斑。培養(yǎng)基上的菌落/噬菌斑按原來的位置不變地轉(zhuǎn)移到雜交膜上，并在原位上發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用。12/13/202251歡迎同學(xué)們聽課！5.4.2.4核酸分子雜交檢測法菌落/噬菌斑原位雜交：1菌落/噬菌斑原位雜交特點需標記探針，操作復(fù)雜。適合大規(guī)模文庫篩選，不適于小量的篩選。12/13/202252歡迎同學(xué)們聽課！菌落/噬菌斑原位雜交特點需標記探針，操作復(fù)雜。12/13/25.4.3基因表達產(chǎn)物分析法免疫化學(xué)檢測法：與菌落/噬菌斑原位雜交類似，不同的是使用抗體探針。DNA-蛋白質(zhì)篩選法：與菌落/噬菌斑原位雜交類似，但使用DNA作探針，檢測外源基因編碼的DNA結(jié)合蛋白。專一性強、靈敏度高。前提條件：克隆基因可在宿主細胞內(nèi)表達，并且有目的蛋白的抗體。12/13/202253歡迎同學(xué)們聽課！5.4.3基因表達產(chǎn)物分析法免疫化學(xué)檢測法：與菌落/噬菌5.4.4DNA序列測定法對克隆DNA片段進行序列測定及分析，鑒定出重組DNA分子中是否含有目的基因?？梢垣@得目的基因的編碼序列和基因調(diào)控序列。12/13/202254歡迎同學(xué)們聽課！5.4.4DNA序列測定法對克隆DNA片段進行序列測定及復(fù)習(xí)思考題名詞解釋：受體細胞；感受態(tài)細胞；轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)換子；重組子；轉(zhuǎn)化率；負篩選；正篩選；－互補篩選2.試述幾種常用的轉(zhuǎn)化方法。3.試述根據(jù)載體的選擇標記進行重組子篩選的方法和原理。4.試述根據(jù)插入序列的表型特征進行重組子篩選的方法和原理。12/13/202255歡迎同學(xué)們聽課！復(fù)習(xí)思考題名詞解釋：12/13/202255歡迎同學(xué)們聽課！演講完畢，謝謝觀看！演講完畢，謝謝觀看！本課程內(nèi)容第一章緒論第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的載體第四章目的基因的制備第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選第六章外源基因的表達第七章基因操作的基本技術(shù)第八章植物基因工程及應(yīng)用第九章動物基因工程及應(yīng)用第十章醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用12/13/202257歡迎同學(xué)們聽課！本課程內(nèi)容第一章緒論12/13/20221歡迎同學(xué)們聽課！第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選5.1DNA片段的連接重組5.2受體細胞選擇的基本原則5.3基因轉(zhuǎn)移5.4重組子的篩選12/13/202258歡迎同學(xué)們聽課！第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選5.1DNA片段的連接5.1DNA片段的連接重組5.1.1DNA連接類型5.1.2DNA片段之間連接的方式5.1.3DNA重組中需注意的問題12/13/202259歡迎同學(xué)們聽課！5.1DNA片段的連接重組5.1.1DNA連接類型12DNA分子連接

不同的DNA片段（目的基因和載體）經(jīng)適當酶切后，在連接酶的作用下，連接在一起構(gòu)建成重組DNA分子。12/13/202260歡迎同學(xué)們聽課！DNA分子連接不同的DNA片段（目的基5.1.1DNA重組（連接）的類型插入重組:載體上只有唯一的酶識別位點隨機（非定向）插入置換重組(1)載體上有兩個同樣的酶識別位點隨機（非定向）置換(2)載體上有兩個不同的酶識別位點定向置換12/13/202261歡迎同學(xué)們聽課！5.1.1DNA重組（連接）的類型插入重組:12/13/25.1.2DNA片段之間連接的方式具互補黏性末端片段之間的連接具平末端DNA片段之間的連接DNA片段末端修飾后進行的連接DNA片段加linkeroradaptor后的連接12/13/202262歡迎同學(xué)們聽課！5.1.2DNA片段之間連接的方式具互補黏性末端片段之間的5.1.3DNA重組中需注意的問題兩端具相同粘性末端的DNA分子會發(fā)生自身環(huán)化。對于置換重組，需將切割的DNA分子經(jīng)過凝膠電泳分離，回收目的片段。無論單酶切還是雙酶切，目的DNA分子均可能發(fā)生串聯(lián)，必需檢測重組DNA插入片段的分子大小。12/13/202263歡迎同學(xué)們聽課！5.1.3DNA重組中需注意的問題兩端具相同粘性末端的DN5.2受體細胞及其選擇的基本原則5.2.1受體細胞5.2.2受體細胞選擇的基本原則12/13/202264歡迎同學(xué)們聽課！5.2受體細胞及其選擇的基本原則5.2.1受體細胞125.2.1受體細胞受體細胞（receptorcell）：又稱為宿主細胞或寄主細胞（hostcell）從實驗技術(shù)上講：是能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細胞。從實驗?zāi)康纳现v：是有應(yīng)用價值和理論研究價值的細胞。12/13/202265歡迎同學(xué)們聽課！5.2.1受體細胞受體細胞（receptorcell）5.2.2受體細胞選擇的原則外源DNA分子能穩(wěn)定存在，限制酶缺陷型；重組基因缺陷型；易于轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)；易篩選遺傳穩(wěn)定性高，易于擴大培養(yǎng)；安全性高；內(nèi)源蛋白酶基因缺失或缺陷；遺傳密碼無明顯偏好性；具有較好的轉(zhuǎn)譯加工機制；較高的理論和實踐應(yīng)用價值。12/13/202266歡迎同學(xué)們聽課！5.2.2受體細胞選擇的原則外源DNA分子能穩(wěn)定存在，限5.3基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）載體與目的基因連接后，體系中可能存在下列分子：

a.未連接的載體分子

b.未連接的DNA片段

c.載體的自連

d.含有錯誤插入片段的重組DNA分子

e.重組DNA分子

轉(zhuǎn)化過程中，這些分子同時被轉(zhuǎn)移到宿主細胞內(nèi)。未連接的分子即使被細菌攝取，只有在特殊的條件下才能復(fù)制，寄主的酶可降解這些DNA片段。自連的載體和錯誤插入的重組質(zhì)粒可以進入12/13/202267歡迎同學(xué)們聽課！5.3基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）載體與目的基因宿主細胞進行正常的復(fù)制。因此，需要將重組克隆鑒定出來。把重組DNA導(dǎo)入受體細胞進行擴增根據(jù)所用載體的特性選擇適宜的受體細胞及選擇適宜的重組DNA導(dǎo)入的方式：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)。12/13/202268歡迎同學(xué)們聽課！宿主細胞進行正常的復(fù)制。因此，需要將重組克隆鑒定出來。125.3基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）5.3.1重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌5.3.2重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌5.3.3重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細胞12/13/202269歡迎同學(xué)們聽課！5.3基因轉(zhuǎn)移（genetransfer）5.3.1重5.3.1重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌5.3.1.1細菌轉(zhuǎn)化的機制5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）5.3.1.3電激法（電穿孔轉(zhuǎn)化法）5.3.1.4轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素12/13/202270歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌5.3.1.1細5.3.1.1細菌轉(zhuǎn)化的機制轉(zhuǎn)化(transformation)：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進入受體細胞，并在受體細胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達的過程稱為轉(zhuǎn)化。

自然界中，轉(zhuǎn)化并不是細菌或的遺傳信息的主要方式，實驗室中只有小部分的細菌可以很容易的轉(zhuǎn)化，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，這類細菌含有DNA結(jié)合和吸收的代謝機制。正常條件下，大部分細菌包括大腸桿菌，只能吸收有限的DNA，為了提高轉(zhuǎn)化效率，建立了一系列的轉(zhuǎn)化方法：a.熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞b.PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化

12/13/202271歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.1細菌轉(zhuǎn)化的機制轉(zhuǎn)化(transformatic.高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化d.顯微注射法轉(zhuǎn)化e.接合轉(zhuǎn)化f.噬菌體轉(zhuǎn)染12/13/202272歡迎同學(xué)們聽課！c.高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化12/13/202216歡迎同學(xué)們表4—1大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效率Ca誘導(dǎo)107-8原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-6噬菌體轉(zhuǎn)化107-8電穿孔法106-9（<100Kb）結(jié)合轉(zhuǎn)化104-512/13/202273歡迎同學(xué)們聽課！表4—1大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化效5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）

原理：0oC、低濃度（50～100mM）CaCl2，Ca2+改變細胞膜的磷脂層結(jié)構(gòu)，提高膜的通透性，而且增強進入細胞的DNA分子抗DNase的能力。

特點：操作簡便，不需特殊儀器，一般實驗室均可進行。轉(zhuǎn)化率在5106～2107個轉(zhuǎn)化子/g質(zhì)粒DNA范圍內(nèi)，完全可滿足常規(guī)克隆的需要。12/13/202274歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）感受態(tài)細胞制備：

感受態(tài)細胞：指處于能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)的細胞。菌種活化、培養(yǎng)、收菌和進行CaCl2處理。DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞：冰浴、42oC熱激、37oC恢復(fù)、涂板培養(yǎng)。12/13/202275歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.2化學(xué)轉(zhuǎn)化法（CaCl2誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法）感5.3.1.3電激法（電穿孔轉(zhuǎn)化法）原理：利用高壓電脈沖作用，在細菌細胞膜上進行電穿孔（electroporation），形成可逆的瞬間通道，促進外源DNA的有效吸收。

特點：1.感受態(tài)細胞制備簡單；2.轉(zhuǎn)化率高達109～1010個轉(zhuǎn)化子/g質(zhì)粒DNA；3.用途廣泛，但需特殊儀器電激儀。除感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化與化學(xué)法不同之外，其余步驟包括所設(shè)轉(zhuǎn)化對照與化學(xué)法相均相同。12/13/202276歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.3電激法（電穿孔轉(zhuǎn)化法）原理：利用高壓電脈沖作5.3.1.4轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素轉(zhuǎn)化率：是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率。轉(zhuǎn)化率計算：＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)/DNA分子總數(shù)或質(zhì)量或＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)/受體細胞數(shù)實際中按轉(zhuǎn)化子總數(shù)/DNA分子質(zhì)量(g)計算12/13/202277歡迎同學(xué)們聽課！5.3.1.4轉(zhuǎn)化率的計算及其影響因素轉(zhuǎn)化率：12/13/影響轉(zhuǎn)化效率的因素受體細胞的感受態(tài)，它決定轉(zhuǎn)化因子能否被吸收進入受體細胞；受體細胞的限制酶系統(tǒng)和其他核酸酶，它們決定轉(zhuǎn)化因子在整合前是否被分解；受體和供體染色體的同源性，它決定轉(zhuǎn)化因子的整合；重組DNA分子大小重組DNA純度、濃度12/13/202278歡迎同學(xué)們聽課！影響轉(zhuǎn)化效率的因素受體細胞的感受態(tài)，它決定轉(zhuǎn)化因子能否被吸收5.3.2重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)染(transfection)：采用與質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化受體細胞相似的方法，將重組噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細胞中的過程，稱為轉(zhuǎn)染。效率較低，103～104個噬菌斑/gDNA，較難滿足一般實驗要求，實踐中少用。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：是指通過噬菌體（病毒）顆粒感染宿主細胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細胞內(nèi)的過程。效率高，可達103～104個噬菌斑/gDNA，需進行體外包裝。12/13/202279歡迎同學(xué)們聽課！5.3.2重組噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)染(tran體外裝配（invitropackaging）：λDNA的轉(zhuǎn)染效率不高，如果將重組的λ分子裝配成頭-尾結(jié)構(gòu)的病毒粒子，將極大的提高效率。12/13/202280歡迎同學(xué)們聽課！體外裝配（invitropackaging）：λDNA噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法12/13/202281歡迎同學(xué)們聽課！噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法12/13/202225歡迎同學(xué)們聽噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法12/13/202282歡迎同學(xué)們聽課！噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法12/13/202226歡迎同學(xué)們聽λ噬菌體的體外裝配有兩種不同的系統(tǒng)可以應(yīng)用：

一種是cos位點突變的噬菌體的單品系系統(tǒng)。

另一種系統(tǒng)需要兩種不同的缺陷品系一個是基因D的突變體，另一個品系是基因E的突變體，由于蛋白質(zhì)合成的缺陷。體外的裝配過程可以利用兩種不同培養(yǎng)物的混合物，含有完整的外殼蛋白，完成裝配過程。將裝配的噬菌體接入細菌就可以完成正常的侵染過程。12/13/202283歡迎同學(xué)們聽課！λ噬菌體的體外裝配有兩種不同的系統(tǒng)可以應(yīng)用：

一種是λ噬菌體體外裝配的兩種系統(tǒng)12/13/202284歡迎同學(xué)們聽課！λ噬菌體體外裝配的兩種系統(tǒng)12/13/202228歡迎同學(xué)們噬菌斑λ和M13噬菌體都能形成噬菌斑，λ形成的是真正的噬菌斑(透明)，是由于細胞的裂解引起的；而M13的噬菌斑是渾濁的，因為細胞并未裂解，它引起的是細菌生長的減慢，而使細菌的濃度低于周圍細胞。12/13/202285歡迎同學(xué)們聽課！噬菌斑λ和M13噬菌體都能形成噬菌斑，λ形成的是真正的噬重組噬菌體的鑒定（一）利用插入失活鑒定

M13噬菌體，多種λ噬菌體載體都含有l(wèi)acZ’基因，可以通過插入失活鑒定重組噬菌體。

（二）λ噬菌體的cI基因的插入失活

λ噬菌體載體在cI基因位點上含有單一的酶切位點，該位點上插入外源基因可以導(dǎo)致該基因的失活，引起表現(xiàn)型的變化。正常的噬菌斑是渾濁的，但重組的噬菌斑是清亮的。

（三）利用Spi(sensitivetoP2inhibition)表型選擇

一般來講，λ噬菌體不能侵染已被P2噬菌體侵染的大腸桿菌細胞，因此λ噬菌體被稱為Spi+（對P2前噬菌體抑制敏感），插入新的DNA后，能變成spi-，可以侵染含有P2噬菌體的細菌，只有重組子是Spi-可以形成噬菌斑，因此可以很方便的選擇出來。12/13/202286歡迎同學(xué)們聽課！重組噬菌體的鑒定（一）利用插入失活鑒定

M13噬菌體，多（四）根據(jù)λ基因組的大小篩選

λ裝配系統(tǒng)，只有37kb-52kb的DNA分子可以進入頭部結(jié)構(gòu)，小于37kb的不能裝配。許多構(gòu)建的λ載體切除了部分DNA，因而小于37kb，只有插入外源DNA分子后才能被裝配到頭部結(jié)構(gòu)中，使載體的長度等于或大于37kb。對于這樣的λ噬菌體載體，只有重組的噬菌體才能進行正常的復(fù)制。12/13/202287歡迎同學(xué)們聽課！（四）根據(jù)λ基因組的大小篩選

λ裝配系統(tǒng)，只有37kb-利用lacZ'基因的插入失活篩選重組噬菌斑12/13/202288歡迎同學(xué)們聽課！利用lacZ'基因的插入失活篩選重組噬菌斑12/13/205.3.3重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細胞重組DNA分子導(dǎo)入植物細胞－植物基因工程(見后面第八章)重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動物細胞－動物基因工程(見后面第九章)12/13/202289歡迎同學(xué)們聽課！5.3.3重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細胞重組DNA分子導(dǎo)入植物5.4重組子篩選的方法5.4.1遺傳表型直接檢測法5.4.2依賴重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法5.4.3基因表達產(chǎn)物分析法5.4.4DNA序列測定法12/13/202290歡迎同學(xué)們聽課！5.4重組子篩選的方法5.4.1遺傳表型直接檢測法125.4.1遺傳表型直接檢測法根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選根據(jù)插入序列的表型特征篩選重組子12/13/202291歡迎同學(xué)們聽課！5.4.1遺傳表型直接檢測法根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選通過插入失活可以初步篩選重組子，但篩選到的克隆是否插入了正確的片段，還需要進一步的鑒定，鑒定的方法主要有如下幾種情況：

1限制性內(nèi)切酶法：外源片段通過特定的酶切位點插入到載體上，因此，可以通過這些限制性酶酶切重組質(zhì)粒，電泳分析插入片段長度是否正確。

2PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通過PCR的方法進行鑒定

3菌落原位雜交法：將在后面的章節(jié)中提到。

4基因產(chǎn)物檢測法：如果使用的是表達載體，那么就可以通過鑒定基因產(chǎn)物的方法鑒定正確的克隆。12/13/202292歡迎同學(xué)們聽課！通過插入失活可以初步篩選重組子，但篩選到的克隆是否插入了正確抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法pBR322有許多單一切點的限制性位點，可以用來切開分子插入新的DNA片段。如BamHI可以從四環(huán)素位點切開，使該基因不能表達，但仍能表達氨芐抗性基因，對四環(huán)素是敏感的。篩選重組pBR322按照以下方法進行，將轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)于氨芐培養(yǎng)基中，只有轉(zhuǎn)化細胞可以生長形成克隆，影印到四環(huán)素培養(yǎng)基上，不能在該培養(yǎng)基上生長的菌落可能就是目的克隆。這屬于負向選擇

12/13/202293歡迎同學(xué)們聽課！抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法pBR322有許多單一根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選抗藥性選擇標記插入失活/插入表達篩選法-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法（－互補篩選）利用報告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細胞利用遺傳選擇標記篩選哺乳底物轉(zhuǎn)基因細胞12/13/202294歡迎同學(xué)們聽課！根據(jù)載體的選擇標記的初步篩選抗藥性選擇標記插入失活/插入表達12/13/202295歡迎同學(xué)們聽課！12/13/202239歡迎同學(xué)們聽課！利用tetR的插入失活篩選重組克隆12/13/202296歡迎同學(xué)們聽課！利用tetR的插入失活篩選重組克隆12/13/202240歡抗藥性選擇標記插入表達篩選法正向選擇重組子在培養(yǎng)基上能生長，而非重組子不能生長。12/13/202297歡迎同學(xué)們聽課！抗藥性選擇標記插入表達篩選法正向選擇12/13/202241-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法（－互補篩選）載體：含有β-半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控序列和頭146個aa的編碼序列

宿主：缺失了lacZ基因，可編碼β-半乳糖苷酶C端序列

α-互補：lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體可以與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酶隱性突變體之間實現(xiàn)互補。

在這樣的系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細菌獲得了amp抗性，自連質(zhì)?？梢院铣烧５拿福亟M質(zhì)粒的細菌不能合成正常的酶。在培養(yǎng)基中添加酶的誘導(dǎo)物IPTG，乳糖的類似物X-gal乳糖酶作用下顯示藍色，藍斑是載體自連產(chǎn)物，而白色克隆是重組質(zhì)粒。這一系統(tǒng)稱為lacselection。12/13/202298歡迎同學(xué)們聽課！-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法（－互補篩選）載體：含有β-半X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（b-galactosidase)水解后生成的吲哚衍生物顯藍色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達。

12/13/202299歡迎同學(xué)們聽課！X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-b利用lacZ'基因的插入失活篩選重組子12/13/2022100歡迎同學(xué)們聽課！利用lacZ'基因的插入失活篩選重組子12/13/20224植物轉(zhuǎn)基因載體的選擇標記/報告基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinphosphotransferaser-II,NPTII)基因:抗新霉素（neomycin）或卡那霉素（kanamycin）潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycinphosphotransferase,HPT)基因:抗卡那霉素或潮霉素（hygromycin）氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloraphenicolacetyltransferase,CAT)基因:抗氯霉素-葡萄糖酸苷酶(-Glucuronidase,GUS)基因:

熒光檢測或組織化學(xué)檢測，非正向選擇抗除草劑bar基因：抗PPT（L-谷氨酸的類似物）12/