第07章蛋白質的分離純化與表征物理與電子科學學院楚雄師范學院課件

第七章蛋白質的分離、純化與表征一、蛋白質的酸堿性質二、蛋白質分子的大小與形狀三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀六、蛋白質的含量測定與純度鑒定四、蛋白質分離純化的一般原則五、蛋白質的分離純化方法12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省第七章蛋白質的分離、純化與表征一、蛋白質的酸堿性質二、蛋1一、蛋白質的酸堿性質蛋白質是一類兩性電解質，能與酸或堿發(fā)生作用。在蛋白質分子中，可解離基團主要是側鏈基團，及少數(shù)N端-NH2和C端-COOH。天然球狀蛋白質的可解離基團大部分可被滴定，而某些天然蛋白質中有一部分可解離基團由于埋藏在分子內部或參與氫鍵形成而不能解離。等電點：在某一pH，它所帶的正電荷與負電荷相等。蛋白質的等電點和它所含的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基的比例有關。等離子點：沒有其它鹽類干擾時，蛋白質質子供體解離出的質子數(shù)與質子受體結合的質子數(shù)相等時的pH值稱等離子點，是每種蛋白質的特征常數(shù)。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省一、蛋白質的酸堿性質蛋白質是一類兩性電解質，能與酸或堿發(fā)生作2二、蛋白質分子的大小與形狀（一）根據(jù)化學組成測定最低相對分子量如Mb含鐵量為0.335%，其最低相對分子質量為：Mb最低相對分子質量＝鐵的原子量鐵的百分含量×100＝55.8/0.335×100＝16700Hb最低相對分子質量＝16700×4牛血清白蛋白含Trp0.58%最低Mr=35200，實際為69000，含2個Trp楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省二、蛋白質分子的大小與形狀（一）根據(jù)化學組成測定最低相對分子3（二）滲透壓法測定相對分子量用半透膜將蛋白質溶液與純水隔開，當滲透達平衡時，測定其滲透壓，計算分子量：Mr＝RTlimπcc→0C：濃度（g/m3）R：氣體常數(shù)（8.314J/(K·mol))T：絕對溫度（K）：以大氣壓表示的滲透壓(N/m2)12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ǘB透壓法測定相對分子量用半透膜將蛋白質溶液與純水隔開，4（三）蛋白質的擴散和擴散系數(shù)擴散：由于濃度差引起的溶質分子的凈遷移。擴散的熱力學驅動力是熵的增加。擴散系數(shù)D：等于當濃度梯度為一個單位時，在一秒鐘內通過1cm2面積所擴散的溶質量。擴散系數(shù)隨Mr的增加而降低，但對Mr的變化不敏感。對球形的大分子來說，擴散系數(shù)與Mr的立方根成反比。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ㄈ┑鞍踪|的擴散和擴散系數(shù)擴散：由于濃度差引起的溶質分子的5（四）沉降分析法測定相對分子量楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省（四）沉降分析法測定相對分子量楚雄師范學院化學與生命科學系61.沉降速率法楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省1.沉降速率法楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/1712/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世82.沉降平衡法楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省2.沉降平衡法楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/19（五）凝膠過濾法測定蛋白質相對分子量12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ㄎ澹┠z過濾法測定蛋白質相對分子量12/12/2022臺州10（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子量12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子量12/12/211三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀（一）蛋白質的膠體性質蛋白質分子直徑在1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運動，丁達爾現(xiàn)象，不能通過半透膜）。透析：將含小分子雜質的蛋白質放入透析袋中，置水溶液中，小分子雜質不斷從袋中出來，大分子蛋白質仍留在袋中。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀（一）蛋白質的膠體性質蛋12蛋白質在水中溶解度依賴于多肽鏈氨基酸殘基側鏈基團的相對極性，離子化基團數(shù)量越多，溶解度越大。

穩(wěn)定蛋白質膠體溶液的主要因素

①蛋白質表面極性基團形成的水化膜將蛋白質顆粒彼此隔開，不會互相碰撞凝聚而沉淀。

②兩性電解質非等電狀態(tài)時，帶同種電荷，互相排斥不致聚集而沉淀。

一旦電荷被中和或水化膜被破壞，蛋白質顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省蛋白質在水中溶解度依賴于多肽鏈氨基酸殘基側鏈基團的相對極性，13（二）蛋白質的沉淀①鹽析法

向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白質脫去水化層而聚集沉淀。②有機溶劑沉淀法

破壞水化膜，降低介電常數(shù)。③重金屬鹽沉淀pH大于等電點時，蛋白質帶負電荷，可與重金屬離子（Hg2+.

Pb2+.

Cu2+

等）結成不溶性沉淀④生物堿試劑和某些酸類沉淀法pH小于等電點時，蛋白質帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸

類：三氯乙酸、磺基水楊酸。⑤加熱變性沉淀往往是不可逆的。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ǘ┑鞍踪|的沉淀①鹽析法

向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽14四、蛋白質分離純化的一般原則純化的實質：增加制品(preparation)的純度或比活性。①蛋白與非蛋白分開，②蛋白質之間分開一般程序：前處理、粗分級、細分級、濃縮與保存楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省四、蛋白質分離純化的一般原則純化的實質：增加制品(prepa15

電泳

前處理粗分離細分離生物組織

無細胞提取液破碎、溶解、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質凝膠過濾疏水層析吸附層析12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省電泳161、前處理：①將組織和細胞破碎動物組織和細胞：電動搗碎機（waringblender)勻漿器（homogenizer)超聲波處理（ultrasonication)植物組織和細胞：石英砂+提取液，研磨纖維素酶處理細菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）②差速離心法收集細胞的某一組分（differentialcentrifugation)：在不同離心力下沉降的細胞組分③如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當?shù)慕橘|提取。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省1、前處理：楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/12172、粗分級（roughfractionation)一般用選擇性沉淀法。①（NH4）2SO4分級沉淀法（鹽析）②等電點選擇性沉淀法③有機溶劑分級沉淀法④熱處理選擇性沉淀法⑤生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法3、細分級（finefractionation)①透析除鹽②sephdexG-25凝膠過濾除鹽★層析法：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）★電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細絲電泳等）、盤狀電泳、等電聚焦、雙向電泳★密度梯度離心12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省2、粗分級（roughfractionation)12/1184、濃縮與保存濃縮方法：保存方法：①晶體保存：結晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結晶不僅是純度的一個指標，也是判斷制品是否有活性的指標。純度越高，溶液越濃，越容易結晶。結晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機溶劑、調節(jié)pH、接入晶種。②凍干粉保存：③溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后-20～-70℃保存。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省4、濃縮與保存12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工19五、蛋白質的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超濾透析：半透膜阻留蛋白質分子，而讓小的溶質分子和水通過，以除去蛋白質溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省五、蛋白質的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.20超濾：施以一定的壓力使小分子溶質通過半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應的蛋白質分子楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省超濾：施以一定的壓力使小分子溶質通過半透膜，而按半透膜的篩孔21沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關。離心后按其沉降的速度不同，彼此分開形成區(qū)帶。再進行光學定位，針刺或冰凍切片采樣分析。2.密度梯度（區(qū)帶）離心12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關。離心后按其沉降的速度22蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省蔗糖密度梯度楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/12233.凝膠過濾12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省3.凝膠過濾12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學2412/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世25交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP）；瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-GelA）楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Ge26交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）楚雄師范學院化學與生命科學系2712/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世28（二）利用溶解度差別的純化方法1.等電點沉淀和pH控制在等電點條件下，蛋白質的電導性、溶解度最小，粘度最大。在pI時，分子電荷為零，蛋白質分子間的靜電排斥消失，從而蛋白質出現(xiàn)聚集沉淀。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ǘ├萌芙舛炔顒e的純化方法1.等電點沉淀和pH控制在等電292.蛋白質的鹽溶和鹽析鹽溶：低鹽濃度時，蛋白質溶解度增加。鹽析：高鹽濃度時，使蛋白質溶解度降低析出。鹽析多用溶解度大的中性鹽，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的飽和溶液。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省2.蛋白質的鹽溶和鹽析鹽溶：低鹽濃度時，蛋白質溶解度增加。楚303.有機溶劑分級分離法與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。在室溫下，這些有機溶劑不僅能引起蛋白質沉淀，而且伴隨者變性。在一定溫度、pH和離子強度條件下，引進蛋白質沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此控制有機溶劑濃度也可以分離蛋白質。有機溶劑引起蛋白質沉淀的主要原因之一是改變介質的介電常數(shù)；另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質爭奪水化水，致使蛋白質聚集體的形成并沉淀。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇（PEG）也能引起蛋白質沉淀。聚乙二醇的主要作用可能是脫去蛋白質的水化層。聚乙二醇與蛋白質親水基團發(fā)生相互作用并在空間上阻礙蛋白質與水相接近。蛋白質在聚乙二酵中的溶解度明顯地依賴于聚乙二醇的分子量。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省3.有機溶劑分級分離法與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮314.溫度對蛋白質溶解度的影響在一定的溫度范圍內，大部分球狀蛋白質的溶解度隨溫度升高而增加。大多數(shù)蛋白質在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進行。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省4.溫度對蛋白質溶解度的影響在一定的溫度范圍內，大部分球狀蛋32（三）根據(jù)電荷不同的純化方法1.電泳在外電場的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質分子，將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱電泳(electrophoresis)或離子泳(ionphoresis)。電泳不僅是分離蛋白質混合物和鑒定蛋白質純度的重要于段，而且也是研究蛋白質性質很有用的一種物理化學方法。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ㄈ└鶕?jù)電荷不同的純化方法1.電泳在外電場的作用下，帶電顆33普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細管電泳從電泳結果分：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、盤狀電泳從裝置上分：圓盤電泳（柱狀）、水平板電泳、垂直板電泳。從支持物分：自由界面電泳、紙電泳（或薄膜電泳）、凝膠電泳（PAGE，瓊脂糖膠，淀粉膠等）楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細管電泳楚雄師范學342.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省2.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）12/12/2022臺州學353.毛細管電泳楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省3.毛細管電泳楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/1364.等電聚焦電泳12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省4.等電聚焦電泳12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化37等電聚焦電泳法測定蛋白質pI12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省等電聚焦電泳法測定蛋白質pI12/12/2022臺州學院生命385.SDS12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省5.SDS/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)3912/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世406.離子交換層析離子交換纖維素：離子交換交聯(lián)葡聚糖：兼有分子篩效應離子交換交聯(lián)瓊脂糖：12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省6.離子交換層析離子交換纖維素：12/12/2022臺州學院4112/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世42楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/12/2022臺43（四）利用選擇性吸附的純化方法極性：硅膠、氧化鋁、巖藻土（離子吸引和氫鍵）非極性：活性炭（范德華力、疏水作用）最廣泛最有效：羥基磷灰石（hydroxyapatite)，即結晶磷酸鈣[Ca10（PO4）6（OH）2]，可分離蛋白質、核酸，與DNA的親和力最高層析介質：苯基瓊脂糖（phenyl-sephadex)辛基瓊脂糖(octa-sephadex)

洗脫：低鹽高pH非離子型去污劑（tritonx-100)脂肪醇（丁醇、乙二醇）12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ㄋ模├眠x擇性吸附的純化方法極性：硅膠、氧化鋁、巖藻土（離44（五）利用對配體的特異生物學親和力的純化方法配基：酶的底物、輔酶、抑制劑、效應物及其結構類似物，激素與受體蛋白，抗原與抗體，生物素與親和素（抗親和素蛋白），凝集素。免疫親和層析凝集素親和層析金屬螯和層析染料配體層析楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ㄎ澹├脤ε潴w的特異生物學親和力的純化方法配基：楚雄師范學4512/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世4612/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世47六、蛋白質的含量測定與純度鑒定（一）蛋白質含量測定總蛋白含量分析：凱氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、雙縮脲法、考馬斯亮藍法、紫外吸收法。特定蛋白組分的含量分析：酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性）其它蛋白：抗原抗體反應(westernblot)楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省六、蛋白質的含量測定與純度鑒定（一）蛋白質含量測定總蛋白含量48楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/12/2022臺49楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/12/2022臺50（二）純度鑒定（均一性）基本手段：電泳分析：單條帶。N端測定：1種N端氨基酸。選用手段：沉降分析、溶解度分析、結晶分析（能結晶的一般比較純，具有活性）其它鑒定工作：1.分子量的測定；2.等電點測定；3.N-末端AA測定；4.C-末端AA的測定（肼解法）；5.分子中糖鏈：①血球凝集反應；②糖蛋白電泳（甲苯胺蘭、R山蘭、schiff試劑）；③糖組分分析（層析、液相色譜）6.含脂成分：蘇丹黑預染、電泳。7.光吸收：全波長掃描。找出它的吸收峰位置和最大吸收值。8.AA組分分析。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省（二）純度鑒定（均一性）基本手段：電泳分析：單條帶。12/151第七章蛋白質的分離、純化與表征一、蛋白質的酸堿性質二、蛋白質分子的大小與形狀三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀六、蛋白質的含量測定與純度鑒定四、蛋白質分離純化的一般原則五、蛋白質的分離純化方法12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省第七章蛋白質的分離、純化與表征一、蛋白質的酸堿性質二、蛋52一、蛋白質的酸堿性質蛋白質是一類兩性電解質，能與酸或堿發(fā)生作用。在蛋白質分子中，可解離基團主要是側鏈基團，及少數(shù)N端-NH2和C端-COOH。天然球狀蛋白質的可解離基團大部分可被滴定，而某些天然蛋白質中有一部分可解離基團由于埋藏在分子內部或參與氫鍵形成而不能解離。等電點：在某一pH，它所帶的正電荷與負電荷相等。蛋白質的等電點和它所含的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基的比例有關。等離子點：沒有其它鹽類干擾時，蛋白質質子供體解離出的質子數(shù)與質子受體結合的質子數(shù)相等時的pH值稱等離子點，是每種蛋白質的特征常數(shù)。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省一、蛋白質的酸堿性質蛋白質是一類兩性電解質，能與酸或堿發(fā)生作53二、蛋白質分子的大小與形狀（一）根據(jù)化學組成測定最低相對分子量如Mb含鐵量為0.335%，其最低相對分子質量為：Mb最低相對分子質量＝鐵的原子量鐵的百分含量×100＝55.8/0.335×100＝16700Hb最低相對分子質量＝16700×4牛血清白蛋白含Trp0.58%最低Mr=35200，實際為69000，含2個Trp楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省二、蛋白質分子的大小與形狀（一）根據(jù)化學組成測定最低相對分子54（二）滲透壓法測定相對分子量用半透膜將蛋白質溶液與純水隔開，當滲透達平衡時，測定其滲透壓，計算分子量：Mr＝RTlimπcc→0C：濃度（g/m3）R：氣體常數(shù)（8.314J/(K·mol))T：絕對溫度（K）：以大氣壓表示的滲透壓(N/m2)12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ǘB透壓法測定相對分子量用半透膜將蛋白質溶液與純水隔開，55（三）蛋白質的擴散和擴散系數(shù)擴散：由于濃度差引起的溶質分子的凈遷移。擴散的熱力學驅動力是熵的增加。擴散系數(shù)D：等于當濃度梯度為一個單位時，在一秒鐘內通過1cm2面積所擴散的溶質量。擴散系數(shù)隨Mr的增加而降低，但對Mr的變化不敏感。對球形的大分子來說，擴散系數(shù)與Mr的立方根成反比。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ㄈ┑鞍踪|的擴散和擴散系數(shù)擴散：由于濃度差引起的溶質分子的56（四）沉降分析法測定相對分子量楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省（四）沉降分析法測定相對分子量楚雄師范學院化學與生命科學系571.沉降速率法楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省1.沉降速率法楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/15812/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世592.沉降平衡法楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省2.沉降平衡法楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/160（五）凝膠過濾法測定蛋白質相對分子量12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省（五）凝膠過濾法測定蛋白質相對分子量12/12/2022臺州61（六）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子量12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。㏒DS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定相對分子量12/12/262三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀（一）蛋白質的膠體性質蛋白質分子直徑在1-100nm之間，在水溶液中具有膠體溶液的通性（布朗運動，丁達爾現(xiàn)象，不能通過半透膜）。透析：將含小分子雜質的蛋白質放入透析袋中，置水溶液中，小分子雜質不斷從袋中出來，大分子蛋白質仍留在袋中。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀（一）蛋白質的膠體性質蛋63蛋白質在水中溶解度依賴于多肽鏈氨基酸殘基側鏈基團的相對極性，離子化基團數(shù)量越多，溶解度越大。

穩(wěn)定蛋白質膠體溶液的主要因素

①蛋白質表面極性基團形成的水化膜將蛋白質顆粒彼此隔開，不會互相碰撞凝聚而沉淀。

②兩性電解質非等電狀態(tài)時，帶同種電荷，互相排斥不致聚集而沉淀。

一旦電荷被中和或水化膜被破壞，蛋白質顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省蛋白質在水中溶解度依賴于多肽鏈氨基酸殘基側鏈基團的相對極性，64（二）蛋白質的沉淀①鹽析法

向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽[（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白質脫去水化層而聚集沉淀。②有機溶劑沉淀法

破壞水化膜，降低介電常數(shù)。③重金屬鹽沉淀pH大于等電點時，蛋白質帶負電荷，可與重金屬離子（Hg2+.

Pb2+.

Cu2+

等）結成不溶性沉淀④生物堿試劑和某些酸類沉淀法pH小于等電點時，蛋白質帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸

類：三氯乙酸、磺基水楊酸。⑤加熱變性沉淀往往是不可逆的。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ǘ┑鞍踪|的沉淀①鹽析法

向蛋白質溶液中加入大量的中性鹽65四、蛋白質分離純化的一般原則純化的實質：增加制品(preparation)的純度或比活性。①蛋白與非蛋白分開，②蛋白質之間分開一般程序：前處理、粗分級、細分級、濃縮與保存楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省四、蛋白質分離純化的一般原則純化的實質：增加制品(prepa66

電泳

前處理粗分離細分離生物組織

無細胞提取液破碎、溶解、差速離心選擇性沉淀法親和層析離子交換層析精制后的蛋白質凝膠過濾疏水層析吸附層析12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省電泳671、前處理：①將組織和細胞破碎動物組織和細胞：電動搗碎機（waringblender)勻漿器（homogenizer)超聲波處理（ultrasonication)植物組織和細胞：石英砂+提取液，研磨纖維素酶處理細菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理（分解肽聚糖）②差速離心法收集細胞的某一組分（differentialcentrifugation)：在不同離心力下沉降的細胞組分③如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當?shù)慕橘|提取。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省1、前處理：楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/12682、粗分級（roughfractionation)一般用選擇性沉淀法。①（NH4）2SO4分級沉淀法（鹽析）②等電點選擇性沉淀法③有機溶劑分級沉淀法④熱處理選擇性沉淀法⑤生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法3、細分級（finefractionation)①透析除鹽②sephdexG-25凝膠過濾除鹽★層析法：凝膠過濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）★電泳法：自由界面電泳、區(qū)帶電泳（凝膠電泳、濾紙和薄膜電泳、粉末電泳、細絲電泳等）、盤狀電泳、等電聚焦、雙向電泳★密度梯度離心12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省2、粗分級（roughfractionation)12/1694、濃縮與保存濃縮方法：保存方法：①晶體保存：結晶過程本身也伴隨著一定程度的提純。能否結晶不僅是純度的一個指標，也是判斷制品是否有活性的指標。純度越高，溶液越濃，越容易結晶。結晶方法：使溶液略處于過飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機溶劑、調節(jié)pH、接入晶種。②凍干粉保存：③溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后-20～-70℃保存。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省4、濃縮與保存12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工70五、蛋白質的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.透析和超濾透析：半透膜阻留蛋白質分子，而讓小的溶質分子和水通過，以除去蛋白質溶液中小分子（鹽、低分子酸等）。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省五、蛋白質的分離純化方法（一）根據(jù)分子大小不同的純化方法1.71超濾：施以一定的壓力使小分子溶質通過半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應的蛋白質分子楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省超濾：施以一定的壓力使小分子溶質通過半透膜，而按半透膜的篩孔72沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關。離心后按其沉降的速度不同，彼此分開形成區(qū)帶。再進行光學定位，針刺或冰凍切片采樣分析。2.密度梯度（區(qū)帶）離心12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省沉降的速度與顆粒的重量、密度和形狀有關。離心后按其沉降的速度73蔗糖密度梯度聚蔗糖密度梯度楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省蔗糖密度梯度楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/12743.凝膠過濾12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省3.凝膠過濾12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學7512/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世76交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP）；瓊脂糖凝膠（Sepharose，Bio-GelA）楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）;聚丙烯酰胺凝膠（Bio-Ge77交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省交聯(lián)葡聚糖（Sephadex）楚雄師范學院化學與生命科學系7812/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世79（二）利用溶解度差別的純化方法1.等電點沉淀和pH控制在等電點條件下，蛋白質的電導性、溶解度最小，粘度最大。在pI時，分子電荷為零，蛋白質分子間的靜電排斥消失，從而蛋白質出現(xiàn)聚集沉淀。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世?。ǘ├萌芙舛炔顒e的純化方法1.等電點沉淀和pH控制在等電802.蛋白質的鹽溶和鹽析鹽溶：低鹽濃度時，蛋白質溶解度增加。鹽析：高鹽濃度時，使蛋白質溶解度降低析出。鹽析多用溶解度大的中性鹽，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的飽和溶液。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省2.蛋白質的鹽溶和鹽析鹽溶：低鹽濃度時，蛋白質溶解度增加。楚813.有機溶劑分級分離法與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。在室溫下，這些有機溶劑不僅能引起蛋白質沉淀，而且伴隨者變性。在一定溫度、pH和離子強度條件下，引進蛋白質沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此控制有機溶劑濃度也可以分離蛋白質。有機溶劑引起蛋白質沉淀的主要原因之一是改變介質的介電常數(shù)；另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質爭奪水化水，致使蛋白質聚集體的形成并沉淀。水溶性非離子聚合物如聚乙二醇（PEG）也能引起蛋白質沉淀。聚乙二醇的主要作用可能是脫去蛋白質的水化層。聚乙二醇與蛋白質親水基團發(fā)生相互作用并在空間上阻礙蛋白質與水相接近。蛋白質在聚乙二酵中的溶解度明顯地依賴于聚乙二醇的分子量。12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省3.有機溶劑分級分離法與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮824.溫度對蛋白質溶解度的影響在一定的溫度范圍內，大部分球狀蛋白質的溶解度隨溫度升高而增加。大多數(shù)蛋白質在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進行。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省4.溫度對蛋白質溶解度的影響在一定的溫度范圍內，大部分球狀蛋83（三）根據(jù)電荷不同的純化方法1.電泳在外電場的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質分子，將向著與其電性相反的電極移動，這種現(xiàn)象稱電泳(electrophoresis)或離子泳(ionphoresis)。電泳不僅是分離蛋白質混合物和鑒定蛋白質純度的重要于段，而且也是研究蛋白質性質很有用的一種物理化學方法。楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省（三）根據(jù)電荷不同的純化方法1.電泳在外電場的作用下，帶電顆84普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細管電泳從電泳結果分：自由界面電泳、區(qū)帶電泳、盤狀電泳從裝置上分：圓盤電泳（柱狀）、水平板電泳、垂直板電泳。從支持物分：自由界面電泳、紙電泳（或薄膜電泳）、凝膠電泳（PAGE，瓊脂糖膠，淀粉膠等）楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省普通電泳、等電聚焦、雙向電泳、脈沖電泳、毛細管電泳楚雄師范學852.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省2.聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）12/12/2022臺州學863.毛細管電泳楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省3.毛細管電泳楚雄師范學院化學與生命科學系范樹國12/1874.等電聚焦電泳12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省4.等電聚焦電泳12/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化88等電聚焦電泳法測定蛋白質pI12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省等電聚焦電泳法測定蛋白質pI12/12/2022臺州學院生命895.SDS12/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省5.SDS/12/2022臺州學院生命科學與醫(yī)9012/14/2022臺州學院生命科學與醫(yī)藥化工學院柯世省12/12/2022臺州學院生