微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用

專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用了解有關(guān)微生物及培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進(jìn)行無菌技術(shù)的操作，進(jìn)行微生物的培養(yǎng)。

一、課題目標(biāo)：掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸氣滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)，熟練、規(guī)范地進(jìn)行無菌操作，成功地培養(yǎng)微生物。無菌技術(shù)的操作。二、課題重點和難點：三、技能目標(biāo)：微生物包括哪五類：病毒細(xì)菌放線菌真菌原生動物特點：結(jié)構(gòu)簡單,形體微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu).且體內(nèi)一般不含有葉綠素.不能進(jìn)行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界一、基礎(chǔ)知識：

(一)微生物細(xì)菌的外形與大小細(xì)菌：單細(xì)胞不分枝的原核微生物。細(xì)菌細(xì)胞微小而透明，通常用適當(dāng)染料染色后顯微鏡觀察圖1-1常見的三種細(xì)菌典型形態(tài)A.球菌B.桿菌C.弧菌細(xì)菌細(xì)胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖）毛、莢膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中又有液泡、儲存性顆粒、核質(zhì)等。細(xì)菌的構(gòu)造圖1-3細(xì)菌的結(jié)構(gòu)*細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特點：堅韌且有彈性細(xì)胞壁有哪些功能？①固定細(xì)胞外形；

②保護(hù)細(xì)胞免受外力的損傷；

③阻攔大分子物質(zhì)進(jìn)人細(xì)胞；

④使細(xì)胞具有致病性及對噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細(xì)胞壁中含毒素芽孢有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。例如，有的細(xì)菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風(fēng)飄散。當(dāng)環(huán)境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發(fā)，形成一個細(xì)菌.菌落：單個或少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。菌落細(xì)菌的菌落特征因種而異細(xì)菌的營養(yǎng)類型根據(jù)細(xì)菌所利用的能源和碳源的不同，將細(xì)菌分為兩大營養(yǎng)類型。自養(yǎng)菌:分類,舉例?異養(yǎng)菌:腐生菌寄生菌大部分病原菌光合自養(yǎng)型:光合細(xì)菌化能自養(yǎng)型:硝化細(xì)菌,鐵細(xì)菌,硫細(xì)菌放線線菌菌1、、結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)：：單細(xì)細(xì)胞胞原原核核分支支狀狀的的菌菌絲絲（（基基內(nèi)內(nèi)菌菌絲絲、、氣氣生生菌菌絲絲））鏈霉霉素素、、土土霉霉素素、、四四環(huán)環(huán)素素、、氯霉霉素素、、紅紅霉霉素素、、慶慶大大霉霉素素微生生物物中中發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)了了幾幾千千種種抗抗生生素素，，其其中中2/3是是由放放線線菌菌產(chǎn)產(chǎn)生生的的應(yīng)用用:病毒毒的的結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)2、、病病毒毒的的增增殖殖：：真菌菌一、、基基礎(chǔ)礎(chǔ)知知識識：：（二二））培培養(yǎng)養(yǎng)基基培養(yǎng)養(yǎng)基基（（培培養(yǎng)養(yǎng)液液））是是由人人工工方方法法配配制制而而成成的的，，專專供供微微生生物物生生長長繁繁殖殖使使用用的的混混合合營營養(yǎng)養(yǎng)液。（1））按物物理狀狀態(tài)分分：固體培培養(yǎng)基基和液體培培養(yǎng)基基、半半固體體培養(yǎng)養(yǎng)基。其中中固體體培養(yǎng)養(yǎng)基用用于菌菌種保（2）按功能分：選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基。（3）按成分分：天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1.培培養(yǎng)基基的類類型和和用途途選擇培培養(yǎng)基基加入青青霉素素的培培養(yǎng)基基:分離酵酵母菌菌、霉霉菌等等真菌菌加入高高濃度度食鹽鹽的培培養(yǎng)基基:分離金金黃色色葡萄萄球菌菌不加氮氮源的的無氮氮培養(yǎng)養(yǎng)基:分離固固氮菌菌不加含含碳有有機(jī)物物的無無碳培培養(yǎng)基基:分離自自養(yǎng)型型微生生物加入青青霉素素等抗抗生素素的培培養(yǎng)基基:分離導(dǎo)導(dǎo)入了了目的的基因因的受受體細(xì)細(xì)胞加入氨氨基喋喋呤分離雜交瘤細(xì)胞天然培培養(yǎng)基基有血血清、、血漿漿、和和組織織提取取液（（如雞雞胚和和牛胚胚浸液液）。。優(yōu)點：：營養(yǎng)成成分豐豐富，，培養(yǎng)養(yǎng)效果果好缺點：：來源受受限;成分分復(fù)雜雜，影影響對對某些些實驗驗產(chǎn)物物的提提取和和實驗驗結(jié)果果的分分析;易發(fā)發(fā)生支支原體體污染染;根據(jù)細(xì)細(xì)胞生生存所所需物物質(zhì)的的種類類和數(shù)數(shù)量，，用人人工方方法模模擬合合成的的。合成培培養(yǎng)基基主要要成分分是氨氨基酸酸、維維生素素、碳碳水化化合物物、無無機(jī)鹽鹽和其其它一一些輔輔助物物質(zhì)。。優(yōu)點：：標(biāo)準(zhǔn)化化生產(chǎn)產(chǎn)，組組分和和含量量相對對固定定;成成本低低缺點：：缺少某某些成成分，，不能能完全全滿足足體外外細(xì)胞胞生長長需要要。合成培培養(yǎng)基基:天然培培養(yǎng)基基：血清中中含有有：①多種蛋蛋白質(zhì)質(zhì)（白白蛋白白、球球蛋白白、鐵鐵蛋白白等））②多種金金屬離離子；；③激素；；④促貼附附物質(zhì)質(zhì)，如如纖粘粘蛋白白、冷冷析球球蛋白白、膠膠原等等。⑤各種生生長因因子⑥轉(zhuǎn)移蛋蛋白⑦不明成成分人工合合成培培養(yǎng)基基只能能維持持細(xì)胞胞生存存，要要想使使細(xì)胞胞生長長和繁繁殖，，還需需補(bǔ)充充一定定量的的天然然培養(yǎng)養(yǎng)基（（如血血清））。液體培培養(yǎng)基基：表面生生長均勻混混濁生生長沉淀生生長固體培培養(yǎng)基基：菌菌落，，菌苔苔半固體體培養(yǎng)養(yǎng)基：：無動力力有有動動力(彌散散)(是否否運(yùn)動動)2.不不同的的微生生物往往往需需要采采用不不同的的培養(yǎng)養(yǎng)基配配方(參考考教材材附錄錄內(nèi)容容)3.不不管哪哪種培培養(yǎng)基基，一一般都都含有有水、碳源、和氮源、無機(jī)鹽鹽、等營養(yǎng)物物質(zhì)，，另外還還需要要滿足足微生生物生生長對對pH、特殊營營養(yǎng)物物質(zhì),例如如:生長因因子(即細(xì)菌菌生長長必需需，而而自身身不能能合成成的化化合物物,如如維生生素、、某些些氨基基酸、、嘌呤呤、嘧嘧啶)以及氧氣、二氧化化碳、滲透壓壓等的要求求。4.培培養(yǎng)基基的用用途液體培培養(yǎng)基基：增增菌固體培培養(yǎng)基基：純純化，，增菌菌半固體體培養(yǎng)養(yǎng)基：：動力力檢測測，保保種二、無無菌技技術(shù)1.無無菌技技術(shù)的的概念念無菌操操作泛泛指在培養(yǎng)養(yǎng)微生生物的的操作作中，，所有有防止止雜菌菌污染染的方方法。。無論是是隨后后將要要學(xué)到到的倒平板板、平板劃劃線操作，，還是是平板稀稀釋涂涂布法法，其操操作中中的每每一步步都需需要做做到““無菌菌”，，即防防止雜雜菌污污染。。只有有熟練練、規(guī)規(guī)范地地進(jìn)行行無菌菌操作作，才才可能能成功功地培培養(yǎng)微微生物物。（１））消毒定定義：：利用化化學(xué)或或物理理方法法，殺殺死大大部份份致病病微生生物的的過程程。區(qū)區(qū)分為為高程度度消毒毒（High-levelDisinfection））、中程度消消毒（Intermediate-levelDisinfection）、、低程度消消毒（Low-levelDisinfection）三三種方式式。2.消毒毒與滅菌菌的概念念及兩者者的區(qū)別別（2）滅滅菌的定定義：以化學(xué)劑劑或物理理方法消消滅所有微生物，，包括所所有細(xì)菌菌的繁殖殖體、芽芽孢、霉霉菌及病病毒，而而達(dá)到完全無菌菌之過程。。滅滅菌菌消毒技技術(shù)是微微生物有有關(guān)工作作中最普普通也是是最重要要的技術(shù)術(shù)。1、煮沸消毒毒法:100℃℃煮沸5-6min2、巴氏氏消毒法法：70-75℃下下煮30min或80℃℃下煮煮15min3、化學(xué)學(xué)藥劑消消毒法:用75%酒精精、新潔潔爾滅等等進(jìn)行皮皮膚消毒毒;氯氣氣消毒水水源4、紫外外線消毒毒……(1)消消毒的方方法：3.常用用的消毒毒與滅菌菌的方法法1、灼燒燒滅菌2、干熱熱滅菌：：160-170℃℃下加熱熱1-2h。3、高壓壓蒸氣滅滅菌：100kPa、、121℃下下維持15-30min.(2)滅滅菌的方方法：最常用的的滅菌方方法是高壓蒸汽汽滅菌，它可以以殺滅所所有的生生物，包包括最耐耐熱的某某些微生生物的休休眠體，，同時可可以基本本保持培培養(yǎng)基的的營養(yǎng)成成分不被被破壞。。有些玻璃璃器皿也也可采用用高溫干熱熱滅菌。為了防防止雜菌菌，特別別是空氣氣中的雜雜菌污染染，試管管及玻璃璃燒瓶都都需采用用適宜的的塞子塞塞口，通通常采用用棉花塞塞，也可可采用各各種金屬屬、塑料料及硅膠膠帽，它它們只可可讓空氣氣通過，，而空氣氣中的其其他微生生物不能能通過。。而平皿是是由正反反兩平面面板互扣扣而成，，這種器器具是專專為防止止空氣中中微生物物的污染染而設(shè)計計的。分類定義方法滅菌法殺滅一切微生物物理法：熱力、輻射、微波、等離子體化學(xué)法：醛類、烷化劑高效消毒法殺滅一切致病微生物紫外線、含氯劑、臭氧、復(fù)配劑等中效消毒法殺滅除芽孢外的致病微生物超聲波、碘類、醇類、酚類低效消毒法殺滅細(xì)菌繁殖體、親脂病毒單鏈季胺鹽、雙胍類、中草藥、金屬離子無菌技術(shù)術(shù)3.微生生物實驗驗室培養(yǎng)養(yǎng)的基本本操作程程序1、器具具的滅菌菌2、培養(yǎng)養(yǎng)基的配配制3、培養(yǎng)養(yǎng)基的滅滅菌4、倒平平板5、微生生物接種種6、恒溫溫箱中培培養(yǎng)7、菌種種的保存存1.無菌菌技術(shù)除除了用來來防止實實驗室的的培養(yǎng)物物被其他他外來微微生物污污染外，，還有什什么目的的？2.請你你判斷以以下材料料或用具具是否需需要消毒毒或滅菌菌。如果果需要，，請選擇擇合適的的方法。。（1）培培養(yǎng)細(xì)細(xì)菌用的的培養(yǎng)基基與培養(yǎng)養(yǎng)皿（2）玻玻棒、、試管、、燒瓶和和吸管（3）實實驗操操作者的的雙手答：無菌菌技術(shù)還還能有效效避免操操作者自自身被微微生物感感染。答：（1）、（（2）需需要滅菌菌；（3）需要要消毒。。三、實驗驗操作1.制備備牛肉膏膏蛋白胨胨培養(yǎng)基基（用于于培養(yǎng)細(xì)細(xì)菌）1．計算算、稱量2．溶化化3．調(diào)pH：pH7．64．過濾濾：這一一步可以以省去。。5．分裝裝：分裝裝過程中中注意不不要使培培養(yǎng)基沾沾在管口口或瓶口口上，以以免沾污污棉塞而而引起污污染。分分裝三角角燒瓶的的量以不不超過三三角燒瓶瓶容積的的一半為為宜。6．加塞7．包扎操作步驟8．滅菌:將50ml培養(yǎng)基用用玻棒轉(zhuǎn)移移至三角錐錐瓶中，塞塞上棉花塞9．倒平板:

待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。倒平板技術(shù)術(shù)1.培養(yǎng)基基滅菌后，，需要冷卻卻到50℃℃左右時時，才能用用來倒平板板。你用什什么辦法來來估計培養(yǎng)養(yǎng)基的溫度度？問題討論答：可以用手觸觸摸盛有培培養(yǎng)基的錐錐形瓶，感感覺錐形瓶瓶的溫度下下降到剛剛剛不燙手時時，就可以以進(jìn)行倒平平板了。2.為什么么需要使錐錐形瓶的瓶瓶口通過火火焰？答：通過灼灼燒滅菌，，防止瓶口口的微生物物污染培養(yǎng)養(yǎng)基。3.平板冷冷凝后，為為什么要將將平板倒置置？4.在倒平平板的過程程中，如果果不小心將將培養(yǎng)基濺濺在皿蓋與與皿底之間間的部位，，這個平板板還能用來來培養(yǎng)微生生物嗎？為為什么？答：平板冷冷凝后，皿皿蓋上會凝凝結(jié)水珠，，凝固后的的培養(yǎng)基表表面的濕度度也比較高高，將平板板倒置，既既可以使培培養(yǎng)基表面面的水分更更好地?fù)]發(fā)發(fā)，又可以以防止皿蓋蓋上的水珠珠落入培養(yǎng)養(yǎng)基，造成成污染。答：空氣中中的微生物物可能在皿皿蓋與皿底底之間的培培養(yǎng)基上滋滋生，因此此最好不要要用這個平平板培養(yǎng)微微生物。2、純化大大腸桿菌接種方法有有：平板劃線法法和稀釋涂涂布平板法法平板劃線法法:通過接種環(huán)環(huán)在瓊脂固固體培養(yǎng)基基表面連續(xù)續(xù)畫線的操操作,將聚聚集的菌鐘鐘逐步稀釋釋分散到培培養(yǎng)基的表表面.在數(shù)次畫線線后,可以以分離到由由一個細(xì)胞胞繁殖而來來的肉眼可可見的子細(xì)細(xì)胞群體,這就是菌菌落.微生物的接接種技術(shù)平板劃線的的操作方法法交叉劃線法法連續(xù)劃線法法平板劃線時時不能劃破破培養(yǎng)基的的原因一旦劃破，，會造成劃劃線不均勻勻，難以達(dá)達(dá)到分離單單菌落的目目的；二是存留在在劃破處的的單個細(xì)胞胞無法形成成規(guī)矩的菌菌落，菌落落會沿著劃劃破處生長長，會形成成一個條狀狀的菌落。。問題討論1.為什么么在操作的的第一步以以及每次劃劃線之前都都要灼燒接接種環(huán)？在在劃線操作作結(jié)束時，，仍然需要要灼燒接種種環(huán)嗎？為為什么？答：操作的的第一步灼灼燒接種環(huán)環(huán)是為了避避免接種環(huán)環(huán)上可能存存在的微生生物污染培培養(yǎng)物；每每次劃線前前灼燒接種種環(huán)是為了了殺死上次次劃線結(jié)束束后，接種種環(huán)上殘留留的菌種，，使下一次次劃線時，，接種環(huán)上上的菌種直直接來源于于上次劃線線的末端，，從而通過過劃線次數(shù)數(shù)的增加，，使每次劃劃線時菌種種的數(shù)目逐逐漸減少，，以便得到到菌落。劃劃線結(jié)束后后灼燒接種種環(huán)，能及及時殺死接接種環(huán)上殘殘留的菌種種，避免細(xì)細(xì)菌污染環(huán)環(huán)境和感染染操作者。。2.在灼燒燒接種環(huán)之之后，為什什么要等其其冷卻后再再進(jìn)行劃線線？答：以免接接種環(huán)溫度度太高，殺殺死菌種。。3.在作第第二次以及及其后的劃劃線操作時時，為什么么總是從上上一次劃線線的末端開開始劃線？？答：劃線后后，線條末末端細(xì)菌的的數(shù)目比線線條起始處處要少，每每次從上一一次劃線的的末端開始始，能使細(xì)細(xì)菌的數(shù)目目隨著劃線線次數(shù)的增增加而逐步步減少，最最終能得到到由單個細(xì)細(xì)菌繁殖而而來的菌落落。問題題討討論論涂布布平平板板的的所所有有操操作作都都應(yīng)應(yīng)在在火火焰焰附附近近進(jìn)進(jìn)行行。。結(jié)結(jié)合合平平板板劃劃線線與與系系列列稀稀釋釋的的無無菌菌操操作作要要求求，，想想一一想想，，第第2步步應(yīng)應(yīng)如如何何進(jìn)進(jìn)行行無無菌菌操操作作？？應(yīng)從從操操作作的的各各個個細(xì)細(xì)節(jié)節(jié)保保證證““無無菌菌””。。例例如如，，酒酒精精燈燈與與培培養(yǎng)養(yǎng)皿皿的的距距離離要要合合適適、、吸吸管管頭頭不不要要接接觸觸任任何何其其他他物物體體、、吸吸管管要要在在酒酒精精燈燈火火焰焰周周圍圍等等等等。。微生生物物的的恒恒溫溫培培養(yǎng)養(yǎng)微生生物物的的恒恒溫溫培培養(yǎng)養(yǎng)菌種種的的保保存存1、、臨臨時時保保藏藏：：接接種種到到固固體體斜斜面面培培養(yǎng)養(yǎng)基基，，菌菌落落長長成成后后置置于于4℃℃冰冰箱箱保保存存。。2、、長長期期保保存存：：甘甘油油冷冷凍凍管管藏藏法法四、、課課題題成成果果評評價價（一一））培培養(yǎng)養(yǎng)基基的的制制作作是是否否合合格格如果果未未接接種種的的培培養(yǎng)養(yǎng)基基在在恒恒溫溫箱箱中中保保溫溫1～～2d后后無無菌菌落落生生長長，，說說明明培培養(yǎng)養(yǎng)基基的的制制備備是是成成功功的的，，否否則則需需要要重重新新制制備備。。（二二））接接種種操操作作是是否否符符合合無無菌菌要要求求如果果培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上生生長長的的菌菌落落的的顏顏色色、、形形狀狀、、大大小小基基本本一一致致，，并并符符合合大大腸腸桿桿菌菌菌菌落落的的特特點點，，則則說說明明接接種種操操作作是是符符合合要要求求的的；；如如果果培培養(yǎng)養(yǎng)基基上上出出現(xiàn)現(xiàn)了了其其他他菌菌落落，，則則說說明明接接種種過過程程中中，，無無菌菌操操作作還還未未達(dá)達(dá)到到要要求求，，需需要要分分析析原原因因，，再再次次練練習(xí)習(xí)。。（三三））是是否否進(jìn)進(jìn)行行了了及及時時細(xì)細(xì)致致的的觀觀察察與與記記錄錄培養(yǎng)養(yǎng)12h與與24h后后的的大大腸腸桿桿菌菌菌菌落落的的大大小小會會有有明明顯顯不不同同，，及及時時觀觀察察記記錄錄的的同同學(xué)學(xué)會會發(fā)發(fā)現(xiàn)現(xiàn)這這一一點點，，并并能能觀觀察察到到其其他他一一些些細(xì)細(xì)微微的的變變化化。。這這一一步步的的要要求求主主要要是是培培養(yǎng)養(yǎng)學(xué)學(xué)生生良良好好的的科科學(xué)學(xué)態(tài)態(tài)度度與與習(xí)習(xí)慣慣。。本課課題題知知識識小小結(jié)結(jié):【典典例例解解析析】】例1．．關(guān)關(guān)微微生生物物營營養(yǎng)養(yǎng)物物質(zhì)質(zhì)的的敘敘述述中中，，正正確確的的A.是是碳碳源源的的物物質(zhì)質(zhì)不不可可能能同同時時是是氮氮源源B.凡凡碳碳源源都都提提供供能能量量C.除除水水以以外外的的無無機(jī)機(jī)物物只只提提供供無無機(jī)機(jī)鹽鹽D.無無機(jī)機(jī)氮氮源源也也能能提提供供能能量量解析析：：不同同的的微微生生物物，，所所需需營營養(yǎng)養(yǎng)物物質(zhì)質(zhì)有有較較大大差差別別，，要要針針對對微微生生物物的的具具體體情情況況分分析析。。對對于于A、、B選選項項，，它它的的表表達(dá)達(dá)是是不不完完整整的的。。有有的的碳碳源源只只能能是是碳碳源源，，如如二二氧氧化化碳碳；；有有的的碳碳源源可可同同時時是是氮氮源源，，如如NH4HCO3；；有有的的碳碳源源同同時時是是能能源源，，如如葡葡萄萄糖糖；；有有的的碳碳源源同同時時是是氮氮源源，，也也是是能能源源，，如如蛋蛋白白胨胨。。對對于于C選選項項，，除除水水以以外外的的無無機(jī)機(jī)物物種種類類繁繁多多，，功功能能也也多多樣樣。。如如二二氧氧化化碳碳，，可可作作為為自自養(yǎng)養(yǎng)型型微微生生物物的的碳碳源源；；NaHCO3，，可可作作為為自自養(yǎng)養(yǎng)型型微微生生物物的的碳碳源源和和無無機(jī)機(jī)鹽鹽；；而而NaCl則則只只能能提提供供無無機(jī)機(jī)鹽鹽。。對對于于D選選項項，，無無機(jī)機(jī)氮氮源源提提供供能能量量的的情情況況還答案：D例2．下下面對發(fā)發(fā)酵工程程中滅菌菌的理解解不正