微生物的遺傳變異

第六章微生物的遺傳變異與菌種選育第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)微生物的基因突變第三節(jié)微生物的基因重組質(zhì)第四節(jié)微生物的菌種選育第五節(jié)微生物菌種的保藏和復(fù)壯

第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)種質(zhì)連續(xù)理論：1883~1889年間Weissmann提出。認(rèn)為遺傳物質(zhì)是一種具有特定分子結(jié)構(gòu)的化合物。基因?qū)W說：二十世紀(jì)初發(fā)現(xiàn)了染色體并提出基因?qū)W說，使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上。染色體由核酸和蛋白質(zhì)兩種長鏈高分子組成。20多種氨基酸經(jīng)過不同排列組合，可以演變出的蛋白質(zhì)數(shù)目幾乎可以達(dá)到一個天文數(shù)字，而核酸的組成卻簡單得多，一般僅由4種不同的核苷酸組成，它們通過排列組合只能產(chǎn)生較少種類的核酸，因此當(dāng)時認(rèn)為決定生物遺傳型的染色體和基因，起活性成分是蛋白質(zhì)。DNA是遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)的證明：1944年以后，利用微生物為實驗對象進(jìn)行的三個著名實驗（肺炎球菌的轉(zhuǎn)化試驗、噬菌體感染試驗、病毒的拆開與重建試驗）1928年，Griffith進(jìn)行了以下幾組實驗：（1）動物實驗

對小鼠注射活R菌或死S菌————小鼠存活

對小鼠注射活S菌————————小鼠死亡

對小鼠注射活R菌和熱死S菌———小鼠死亡抽取心血分離活的S菌

一、證明核酸是遺傳變異物質(zhì)基礎(chǔ)的經(jīng)典實驗（一）肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗（transformation）：F.Griffith，研究對象：Streptococcuspneumoniae（肺炎雙球菌）S型菌株：有致病性，菌落表面光滑，有莢膜R型菌株：無致病性，菌落表面粗糙，無莢膜（2）細(xì)菌培養(yǎng)實驗

熱死S菌—————不生長

活R菌—————長出R菌

熱死S菌+活R菌—————長出大量R菌和10-6S菌（3）S型菌的無細(xì)胞抽提液試驗

活R菌+S菌無細(xì)胞抽提液————長出大量R菌和少量S菌以上實驗說明：加熱殺死的S型細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)可能存在一種轉(zhuǎn)化物質(zhì)，它能通過某種方式進(jìn)入R型細(xì)胞并使R型細(xì)胞獲得穩(wěn)定的遺傳性狀①加S菌DNA②加S菌DNA及DNA酶以外的酶③加S菌的DNA和DNA酶④加S菌的RNA⑤加S菌的蛋白質(zhì)⑥加S菌的莢膜多糖活R菌長出S菌只有R菌1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty從熱死S型S.pneumoniae中提純了可能作為轉(zhuǎn)化因子的各種成分，在離體條件下進(jìn)行了轉(zhuǎn)化試驗：只有S型細(xì)菌的DNA才能將S.Pneumoniae的R型轉(zhuǎn)化為S型。且DNA純度越高，轉(zhuǎn)化效率也越高。說明S型菌株轉(zhuǎn)移給R型菌株的，是遺傳因子。（二）噬菌體的感染實驗A.D.Hershey和M.Chase，1952年（1）含32P-DNA的一組：放射性85%在沉淀中（2）含35S-蛋白質(zhì)的一組：放射性75%在上清液中所以，進(jìn)入細(xì)胞的是噬菌體的核酸而不是蛋白質(zhì)。（三）煙草花葉病毒的拆開與重組實驗為了證明核酸是遺傳物質(zhì)，H.Fraenkel-Conrat（1956）用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實驗。將TMV在一定濃度的苯酚溶液中振蕩，就能將其蛋白質(zhì)外殼與RNA核心相分離。分離后的RNA在沒有蛋白質(zhì)包裹的情況下，也能感染煙草并使其患典型癥狀，而且在病斑中還能分離出正常病毒粒子。選用TMV和霍氏車前花葉病毒（HRV），分別拆分取得各自的RNA和蛋白質(zhì)，將兩種RNA分別與對方的蛋白質(zhì)外殼重建形成兩種雜合病毒：（1）RNA（TMV）-蛋白質(zhì)（HRV）（2）RNA（HRV）-蛋白質(zhì)（TMV）用兩種雜合病毒感染寄主：（1）表現(xiàn)TMV的典型癥狀病分離到正常TMV粒子（2）表現(xiàn)HRV的典型癥狀病分離到正常HRV粒子。上述結(jié)果說明，在RNA病毒中，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸。二、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式

1.細(xì)胞水平

2.亞細(xì)胞核水平3.分子水平一、基因突變基因突變（genemutation）簡稱突變，是變異的一種，指生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化。突變率常在10-8~10-9范圍內(nèi)。第二節(jié)微生物的基因突變突變變株株的的表表型型成成因因檢檢出出方方法法營養(yǎng)養(yǎng)缺缺陷陷型型因因突突變變而而喪喪失失合合成成一一補(bǔ)補(bǔ)充充培培養(yǎng)養(yǎng)基基（auxotroph））種種或或幾幾種種生生長長因因子子的的能力力不不能能在在基基本本培培養(yǎng)養(yǎng)基上上生生長長突突變變株株抗性性突突變變型型因因突突變變而而產(chǎn)產(chǎn)生生了了對對某某藥藥物物培培養(yǎng)養(yǎng)基基（resistantmutant））種種化化學(xué)學(xué)藥藥物物或或致致死死物理理因因子子的的抗抗性性條件件致致死死型型突突變變后后在在某某種種條條件件下下培培養(yǎng)養(yǎng)條條件件改改變變（conditional可可正正常常生生長長、、繁繁殖殖并并lethalmutant））實實現(xiàn)現(xiàn)其其表表型型，，而而在在另另一條條件件下下卻卻無無法法生生長長繁殖殖的的突突變變型型一、、基基因因突突變變的的類類型型突變變株株的的表表型型成成因因檢檢出出方方法法形態(tài)態(tài)突突變變型型因因突突變變而而產(chǎn)產(chǎn)生生的的個個體體形形態(tài)態(tài)Morphologycal或或菌菌落落形形態(tài)態(tài)的的非非選選擇擇（（常常用用顏顏色色變變化化））mutant性性變變異異抗原原突突變變型型因因突突變變而而引引起起的的抗抗原原借借助助于于抗抗原原antigenic結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)發(fā)發(fā)生生改改變變抗抗體體反反應(yīng)應(yīng)mutant其它它突突變變型型：：毒毒力力、、糖糖發(fā)發(fā)酵酵能能力力、、代代謝謝產(chǎn)產(chǎn)物物等等二、、突突變變的的特特點點1.不不對對應(yīng)應(yīng)性性：突突變變的的性性狀狀與與突突變變原原因因之之間間無無直直接接的的對對應(yīng)應(yīng)關(guān)關(guān)系系。。（（變變量量試試驗驗、、涂涂布布試試驗驗、、平平板板影影印印培培養(yǎng)養(yǎng)試試驗驗））2.自自發(fā)發(fā)性性：突突變變可可以以在在沒沒有有人人為為誘誘變變因因素素處處理理下下自自發(fā)發(fā)地地產(chǎn)產(chǎn)生生。。3.稀稀有有性性：突變變率率低低且且穩(wěn)穩(wěn)定定。。4.獨獨立立性性：各各種種突突變變獨獨立立發(fā)發(fā)生生，，不不會會互互相相影影響響。。5.可可誘誘發(fā)發(fā)性性：誘誘變變劑劑可可提提高高突突變變率率。。6.穩(wěn)穩(wěn)定定性性：變變異異性性狀狀穩(wěn)穩(wěn)定定可可遺遺傳傳。。7.可可逆逆性性：原原始始的的野野生生基基因因到到變變異異株株的的突突變變稱稱為為正正向向突突變變（（forwardmutation）），，相相反反的的過過程程則則稱稱為為回回復(fù)復(fù)突突變變或或回回變變（（backmutation或或reversemutation））。。.誘誘發(fā)發(fā)突突變變的的機(jī)機(jī)制制誘變變劑劑（（mutagen））：凡凡能能提提高高突突變變率率的的任任何何理理化化因因子子，，誘誘變變劑劑的的種種類類很很多多，，作作用用方方式式多多樣樣。。即即使使是是同同一一種種誘誘變變劑劑，，也也常常有有不不同同的的作作用用方方式式。。三、基因突突變的機(jī)制制堿基置換（（substitution）定義：對DNA來來說，堿基基的置換屬屬于一種染染色體的微微小損傷（（microlesion）），一般也也稱點突變變（pointmutation））。它只涉涉及一對堿堿基被另一一對堿基所所置換。分類：轉(zhuǎn)換（transition），，即DNA鏈中的一一個嘌呤被被另一個嘌嘌呤或是一一個嘧啶被被另一個嘧嘧啶所置換換；顛換（transversion），即一一個嘌呤被被另一個嘧嘧啶或是一一個嘧啶被被另一個嘌嘌呤所置換換。對某一具體體誘變劑來來說，可同同時引起轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換與顛換換，也可只只具其中的的一種功能能。根據(jù)化化學(xué)誘變劑劑是直接還還是間接地地引起置換換，可把置置換的機(jī)制制分成以下下兩類來討討論。直接引起置置換的誘變變劑一類可直接接與核酸的的堿基發(fā)生生化學(xué)反應(yīng)應(yīng)的誘變劑劑，例如亞硝酸、羥羥胺和各種種烷化劑（硫酸二乙乙酯，甲基基磺酸乙酯酯，N-甲甲基-N’’硝基-N-亞硝基基胍，N-甲基-N-亞硝基基脲，乙烯烯亞胺，環(huán)環(huán)氧乙酸，，氮芥等））。它們可與與一個或幾幾個核苷酸酸發(fā)生化學(xué)學(xué)反應(yīng)，從從而引起DNA復(fù)制制時堿基配配對的轉(zhuǎn)換換，并進(jìn)一一步使微生生物發(fā)生變變異。在這這些誘變劑劑中，除羥羥胺只引起起G┇C→→A：T外外，其余都都是可使G┇CA：T發(fā)生互變變的。能引引起顛換的的誘變劑很很少，只是是部分烷化化劑才有。。移碼突變移碼突變（frame-shiftmutation）指誘變變劑使DNA分子中中的一個或或少數(shù)幾個個核苷酸的的增添（插插入）或缺缺失，從而而使該部位位后面的全全部遺傳密密碼發(fā)生轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯譯錯誤的一一類突變。。由移碼突變變所產(chǎn)生的的突變株，，稱為移碼突變株株（frameshiftmutant）。。與染色體體畸變相比比，移碼突突變也只能能算是DNA分子的的微小損傷傷。

丫啶啶類染料，，如丫啶黃黃、丫啶橙橙和α-氨氨基丫啶等等，都是移移碼突變的的有效誘變變劑。丫啶類化合合物的誘變變機(jī)制至今還不很很清楚。有有人認(rèn)為，，由于它們們是一種平平面型三環(huán)環(huán)分子，結(jié)結(jié)構(gòu)與一個個嘌呤–嘧嘧啶對十分分相似，故故能嵌入兩兩個相鄰DNA堿基基對之間，，造成雙螺螺旋的部分分解開（兩兩個堿基對對原來相距距0.34nm，當(dāng)當(dāng)嵌入一個個丫啶分子子時，就變變成0.68nm）），從而在在DNA復(fù)復(fù)制過程中中，會使鏈鏈上增添或或缺失一個個堿基，結(jié)結(jié)果就引起起了移碼突突變。染色體畸變變（chromosomalaberration））某些理化因因子，如X射線等的的輻射及烷烷化劑、亞亞硝酸等，，除了能引引起點突變變外，還會會引起DNA的大損損傷（macrolesion）———染色體畸畸變，包括括以下兩個個方面：染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)上的缺失（deletion）、、重復(fù)（duplication）、、易位（translocation）和倒位位（inversion）染色體數(shù)目目的變化。染色體結(jié)構(gòu)構(gòu)上的變化化染色體內(nèi)畸畸變只涉及及一條染色色體上的變變化，如發(fā)發(fā)生染色體體的部分缺失或重復(fù)時，其結(jié)果果可造成基因的減少少或增加；又如發(fā)生生倒位或易位時，則可造造成基因排列順順序的改變變，但數(shù)目卻卻不改變。。倒位是指指斷裂下來來的DNA片段旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)180°°后，重新新插入到原原來染色體體的位置上上；易位則則指斷裂下下來的一小小段染色體體再順向或或逆向地插插入到同一一條染色體體的其它部部位上。染色體間畸畸變，則指指非同源染染色體間的的易位。紫外線（U.V.，，ultravioletray））對DNA的損傷嘧啶對紫外外線的敏感感性要比嘌嘌呤強(qiáng)得多多。嘧啶的光光化產(chǎn)物主主要是二聚聚體和水合合物，其中中了解較清清楚的是胸腺嘧啶二二聚體的形成和消消除。紫紫外線的的主要作用用是使同鏈鏈DNA的的相鄰胸腺腺嘧啶間形形成共價結(jié)結(jié)合的胸腺腺嘧啶二聚聚體，它的的出現(xiàn)會減減弱雙鏈間間氫鍵的作作用，并引引起雙鏈結(jié)結(jié)構(gòu)扭曲變變形，阻礙礙堿基間的的正常配對對，從而引引起突變或或死亡。在在互補(bǔ)雙鏈鏈間形成嘧嘧啶二聚體體的機(jī)會較較少，但一一旦形成，，就會妨礙礙雙鏈的解解開，因而而影響DNA的復(fù)制制和轉(zhuǎn)錄，，并使細(xì)胞胞死亡。.自身突變變的機(jī)制背景輻射和和環(huán)境中多多因素低劑劑量的誘變變效應(yīng)微生物自身身代謝產(chǎn)物物的誘變效效應(yīng)互變異構(gòu)效效應(yīng)環(huán)狀突出效效應(yīng)第三節(jié)微微生物的基基因重組基因組：細(xì)細(xì)胞中基因因以及非基基因的DNA序列的的總稱，包包括結(jié)構(gòu)基基因、調(diào)控控序列以及及目前功能能未知的DNA序列列。一、原核生生物的基因因重組緊密纏繞的的環(huán)狀雙鏈鏈DNA分分子遺傳信息的的連續(xù)性功能相關(guān)的的結(jié)構(gòu)基因因組成操縱縱子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因的的單拷貝及及rRNA基因的多多拷貝基因組的重重復(fù)序列少少而短二、真核生生物的基因因重組DNA與組組蛋白構(gòu)成成染色體有間隔子或或內(nèi)含子序序列沒有明顯的的操縱子結(jié)結(jié)構(gòu)含有一定數(shù)數(shù)量的重復(fù)復(fù)序列（低低度、中度度和高度重重復(fù)）遺傳豐余：較高同源源性的DNA重復(fù)序序列第四節(jié)微微生物的的菌種選育育在微生物工工業(yè)應(yīng)用中中，微生生物菌種工工作主要包包括以下四四方面：①菌種的的分離篩選選：挑選符符合生產(chǎn)要要求的菌種種，這是選選種工作的的任務(wù)。②菌種培培育：改改良已有菌菌種的生產(chǎn)產(chǎn)性能，使使產(chǎn)品的質(zhì)質(zhì)和量不斷斷提高，或或使它更適適應(yīng)于工藝藝的要求，，這是育種種工作的任任務(wù)。③菌種的的保藏：一一切生產(chǎn)產(chǎn)菌種都要要使它避免免死亡和生生產(chǎn)性能的的下降，這這是菌種保保藏工作的的任務(wù)。④退化菌菌種的復(fù)壯壯：如果果發(fā)現(xiàn)菌種種的生產(chǎn)性性能下降，，就要設(shè)法法使它恢復(fù)復(fù)，這便是是菌種復(fù)壯壯工作的任任務(wù)。一、從自然然界中分離離篩選菌種種的方法步步驟采樣

增殖培養(yǎng)

純種分離純培養(yǎng)生產(chǎn)性能測定方法、地點、時間和周圍環(huán)境記錄純種分離的原則就是使培養(yǎng)物獲得單個菌落：1．稀釋分離法2．平板劃線分離法

⑴

涂菌：

⑵

劃線分離：①分步劃線法；②一次劃線法：

3．組織分離法

測定代謝產(chǎn)物或其它目的性狀（一）誘變變育種的一一般步驟和和方法出出發(fā)菌株同步培養(yǎng)使菌細(xì)胞處處于相同或或接近的生生理狀態(tài)單細(xì)胞（或或單孢子））菌懸液的的制備單細(xì)胞或單單孢子的意意義酵酵母或霉霉菌孢子106/ml、、細(xì)菌108/ml誘變劑的選選擇及其劑劑量的確定定以致死率為為90％～99％為宜

誘變變處理①①物物理誘變劑劑②②化學(xué)誘誘變劑確定出發(fā)菌菌株↓菌種的純化化選優(yōu)↓←出發(fā)菌菌株的性能能鑒定同步培養(yǎng)↓制備單細(xì)胞胞（或單孢孢子）懸液液↓←活菌濃濃度測定誘變劑的選選擇與確定定誘變劑量量的預(yù)試驗驗↓誘變處理↓平板分離↓計形態(tài)變變異的菌落落數(shù)，計算算突變率挑取疑似突突變菌落純純培養(yǎng)↓突變體的初初步篩選↓←用簡單單快捷的方方法重復(fù)篩選↓←搖瓶發(fā)發(fā)酵試驗選出突變體體（根據(jù)情情況進(jìn)行生生產(chǎn)試驗或或重復(fù)誘變變處理）二、微生物物的誘變育育種二、微生物物的誘變育育種（二）變異異菌株的初初步篩選紙片培養(yǎng)顯顯色法透明圈法瓊脂塊培養(yǎng)養(yǎng)法1篩選用用培養(yǎng)基⑴基本培培養(yǎng)基：凡凡是能滿足足某種野生生型菌株營營養(yǎng)要求的的最低成分分的合成培培養(yǎng)基，稱稱為基本培培養(yǎng)基；常常以‘[-]’表示；⑵在基本本培養(yǎng)基中中加入一些些富含氨基基酸、維生生素及含氮氮堿基之類類的天然有有機(jī)物質(zhì)如如蛋白胨、、酵母膏等等，以滿足足該微生物物的各種營營養(yǎng)缺陷型型菌株都能能生長繁殖殖的培養(yǎng)基基，稱為完完全培養(yǎng)基基，常用‘‘[+]’表示；⑶在基本本培養(yǎng)基中中只是有針針對性地加加入某一種種或某幾種種營養(yǎng)缺陷陷成分，以以滿足相應(yīng)應(yīng)的營養(yǎng)缺缺陷型生長長的培養(yǎng)基基，稱為補(bǔ)補(bǔ)充培養(yǎng)基基，補(bǔ)充培培養(yǎng)基可按按所加入營營養(yǎng)成分相相應(yīng)地用‘‘[A]’、‘[B]’等來表示示。（三）營養(yǎng)養(yǎng)缺陷型突突變體的篩篩選及其應(yīng)應(yīng)用二、微生物物的誘變育育種2．營養(yǎng)缺陷陷型菌株篩篩選的一般般方法（1）誘變劑處處理（2）淘汰野生生型菌株①抗生素素法②菌絲過過濾法（3）檢出營養(yǎng)養(yǎng)缺陷型（4）鑒定營養(yǎng)養(yǎng)缺陷型檢出營養(yǎng)缺缺陷型①夾層培養(yǎng)法

②限量補(bǔ)充培養(yǎng)法

③影印接種法

④

逐個檢出法

鑒定營養(yǎng)缺缺陷型①含營養(yǎng)養(yǎng)缺陷型菌菌株的基本本培養(yǎng)基平平板的制備備。②營養(yǎng)缺缺陷型營養(yǎng)養(yǎng)類別的鑒鑒定。③缺陷型型菌株單一一營養(yǎng)因素素的鑒定。。第一組第二組第三組第四組第五組第六組第七組第八組第九組丙氨酸谷氨酸亮氨酸絲氨酸精氨酸谷氨酰氨賴氨酸蘇氨酸天冬酰氨甘氨酸蛋氨酸色氨酸天冬氨酸組氨酸苯丙氨酸酪氨酸半胱氨酸異亮氨酸脯氨酸

纈氨酸原生質(zhì)體融融合育種細(xì)胞（A+B—）細(xì)胞（A—B+）脫壁處理脫壁處理原生質(zhì)體（（A+B—）原生質(zhì)體（（A—B+）混合加融合劑原生質(zhì)體融融合涂平板（原原生質(zhì)體再再生）形成菌落檢出重組子子菌落（A+B+）轉(zhuǎn)基因工程程菌株的構(gòu)構(gòu)建1．提取目的的基因用用密度梯梯度離心方方法分別從從供體細(xì)胞胞中提取所所需要的DNA即目的基因因和作為載載體的細(xì)菌菌質(zhì)粒或噬噬菌體核酸酸，目的基基因也可通通過化學(xué)方方法人工合合成。2．處理目的的基因根根據(jù)基因因工程的““設(shè)計藍(lán)圖圖”的要求求，在從供供體細(xì)胞中中提取出的的目的基因因中加入專專一性很強(qiáng)強(qiáng)的限制性性核酸內(nèi)切切酶進(jìn)行處處理，從而而獲得帶有有特定基因因并暴露出出粘性末端端的DNA單鏈部分。。必要時這這種粘性末末端也可用用人工方法法合成。對作為載體體的細(xì)菌質(zhì)質(zhì)?；蚴删wDNA可采用與處處理目的基基因同一種種類的限制制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶進(jìn)行行處理，使使其形成并并暴露出與與目的基因因相應(yīng)的粘粘性末端。。3．體外重組組將上上述分別處處理過的目目的基因和和細(xì)菌質(zhì)粒粒DNA片段（或噬噬菌體核酸酸）放在試試管中，在在較低溫度度（5～6℃）下混合合“退火””。由于這這兩種DNA是用同一種種限制性核核酸內(nèi)切酶酶進(jìn)行處理理，具有相相同的粘性性末端，因因此相互之之間能夠形形成氫鍵，，這就是所所謂“退火火”。而相相鄰的核苷苷酸，在DNA連接酶的作作用下也能能形成磷酸酸二酯鍵，，這樣就完完成了目的的基因與質(zhì)質(zhì)粒DNA（或噬菌體體DNA）的重組，，得到的是是一個完整整的具有復(fù)復(fù)制能力的的環(huán)狀DNA重組體，即即“雜種質(zhì)質(zhì)粒”（或或雜種噬菌菌體）。4．載體傳遞遞即通通過載體將將供體生物物中的遺傳傳基因?qū)肴氲绞荏w細(xì)細(xì)胞內(nèi)。載載體必須具具有自我復(fù)復(fù)制的能力力，一般可可利用質(zhì)粒粒的轉(zhuǎn)化作作用或噬菌菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)作用，將將供體基因因帶入受體體細(xì)胞內(nèi)。。5．復(fù)制、表表達(dá)在在理想情況況下，進(jìn)入入受體細(xì)胞胞內(nèi)的雜種種質(zhì)粒（或或雜種噬菌菌體），可可通過自我我復(fù)制到擴(kuò)擴(kuò)增，并使使受體細(xì)胞胞表達(dá)出作作為供體細(xì)細(xì)胞所固有有的部分遺遺傳性狀，，成為“工工程菌”。。6．篩選、