NAD 激酶（NADK）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書-微量法UPLC-MS-4353

電話：400-998-2324郵箱：service_uplc_ms@163.com網(wǎng)址：本產(chǎn)品僅供科學(xué)研究使用！請(qǐng)勿用于臨床、診斷、食品、化妝品檢測(cè)等用途！-上海液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)有限公司第第頁(yè)NAD激酶（NADK）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書操作。貨號(hào)：UPLC-MS-4353規(guī)格：100T/48S

微量法產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系工作人員。試劑名稱規(guī)格保存條件提取液液體60mL×1瓶4℃保存試劑一液體5mL×1瓶4℃保存試劑二液體10mL×1瓶4℃保存試劑三粉劑×1瓶-20℃保存試劑四粉劑×1支-20℃保存試劑五粉劑×1瓶-20℃保存試劑六粉劑×1瓶-20℃保存試劑七粉劑×1瓶4℃保存試劑八液體14μL×1瓶4℃保存試劑九液體20mL×1瓶4℃保存試劑十液體40mL×1瓶（自備）標(biāo)準(zhǔn)品粉劑×1支4℃保存溶液的配制：1、試劑三：用時(shí)加入3mL雙蒸水，充分溶解，可分裝保存，-20℃保存兩周，禁止反復(fù)凍融；臨用前取出一支稀釋100倍使用。21mL雙蒸水，充分溶解，4℃保存；32mL雙蒸水，充分溶解，4℃保存；42mL雙蒸水，充分溶解，4℃保存；5、試劑七：用時(shí)加入2mL雙蒸水，充分溶解，4℃避光保存；6EP0.986mL蒸餾水充分溶解，可分裝后-20℃反復(fù)凍融；7、試劑十：自備95%乙醇；81.9mL2μmol/mLNADP10020nmol/mLNADP標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。產(chǎn)品說(shuō)明：NADK（EC3）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前所發(fā)現(xiàn)的生物體內(nèi)唯一能夠催NAD+NADP+NAD(H)ATP或無(wú)機(jī)多聚磷酸[poly(P)]作為磷酰基供體進(jìn)行磷酸化反NADP(H)。因此，NADNADP(H)NAD(H)NADP(H)的平衡上具有重要作用。NADKNAD+6-PMS的遞氫作用，還原氧化型噻唑藍(lán)（570nmK活性的大小。注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。需自備的儀器和用品：臺(tái)式離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/水乙醇、冰和蒸餾水。操作步驟：一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣本的制備：5001mL破碎細(xì)菌或細(xì)胞（20%3s10s30次；8000g4℃10min，取上清，置冰上待測(cè)。0.1g1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿；8000g4℃10min2、血清（漿）樣本：直接檢測(cè)。二、測(cè)定步驟1、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至570nm，95%乙醇調(diào)零。2、標(biāo)準(zhǔn)品的配制：按下表混合試劑三和標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品（μL）試劑三（μL）標(biāo)準(zhǔn)管濃度（nmol/mL）050054521040415356203082525103020123515143、操作表：（在EP管中操作）試劑名稱(μL)測(cè)定管對(duì)照管標(biāo)準(zhǔn)管空白管樣本1010--標(biāo)準(zhǔn)品--10-蒸餾水10試劑一14242424試劑三10試劑四6666充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）25℃（其它物種）15min2min（散失10000rpm5min20μL1.5mLEP管中，繼續(xù)加入下列試劑。試劑二50505050試劑五15151515試劑六15151515試劑七15151515試劑八7777室溫避光靜置20min。試劑九100100100100混勻靜置5min，15000g，常溫離心10min。去上清，留沉淀。試劑十20020020020096570nmA空白，計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白。三、NADK活性計(jì)算1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：NADPx軸，ΔAyy=kx+bΔA測(cè)定帶入公式x（nmolmL。2、NADK活力的計(jì)算：按樣本蛋白濃度計(jì)算：mg1nmolNADPNADK（U/mgprot）=x×V樣本÷（Cpr×V樣本）÷T=0.067×x÷Cpr按樣本質(zhì)量計(jì)算：g1nmolNADPNADK（U/g質(zhì)量）=x×V樣本÷（W×V樣本÷V提?。耇=0.067×x÷W按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：11nmolNADPNADK（U/104cell）=x×V樣本÷（500×V樣本÷V提取）÷T=x×1.33×10-4按血清（漿）體積計(jì)算：mL血清（漿）1nmolNADPNADK（U/mL）=x÷T=0.067×xV樣本：加入樣本體積，0.01mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V提?。杭尤氲奶崛∫后w積，1mL；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)；T：