還原型谷胱甘肽含量測定

還原型谷胱甘肽含量測定一、目的要求了解果蔬組織中抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)代謝過程，學(xué)習(xí)還原型谷胱甘肽含量的測定原理和方法。二、基本原理谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Cly）組成的天然三肽，是一種含巰基（-SH）的化合物，廣泛存在于動(dòng)物組織、植物組織、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’–二硫代–雙–（2–硝基苯甲酸）（5,5-dithiobis-2-nitrobenzoicacid，DTNB）反應(yīng)產(chǎn)生2–硝基–5–巰基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2–硝基–5–巰基苯甲酸為一黃色產(chǎn)物，在波長412nm處的具有最大光吸收。因此，利用分光光度計(jì)法可測定樣品中谷胱甘肽（GSH）的含量。三、材料、儀器及試劑（一）材料蘋果、梨、馬鈴薯等。（二）儀器及用具研缽、高速冷凍離心機(jī)、移液器、離心管、試管、水浴鍋、容量瓶（100mL、200mL、1000mL）、分光光度計(jì)。（三）試劑1．5%三氯乙酸（TCA）溶液（含5mMEDTA-Na2）稱取186mgEDTA-Na2·2H2O，用5%三氯乙酸溶解、定容至100mL。2．100mmol/L、pH7.7和100mmol/LpH6.8磷酸緩沖液母液A（200mmol/LNa2HPO4溶液）：稱取35.61gNa2HPO4·2H2O或53.65gNa2HPO4·7H2O或71.64gNa2HPO4·12H2O，用蒸餾水溶解，定容至1000mL。母液B（200mmol/LNaH2PO4溶液）：稱取27.6gNaH2PO4·H2O或31.2gNaH2PO4·2H2O用蒸餾水溶解，定容至1000mL。取89.5mL母液A和10.5mL母液B混合，調(diào)節(jié)pH值至7.7，稀釋至200mL。另取49.0mL母液A和51.0mL母液B混合，調(diào)節(jié)pH值至6.8，稀釋至200mL。3．4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5-dithiobis-2-nitrobenzoicacid，DTNB）溶液稱取15.8mgDTNB，用100mmol/L、pH6.8磷酸緩沖液溶解、定容至10mL，混勻，4℃保存?，F(xiàn)用現(xiàn)配。4．100μmol/L還原型谷胱甘肽（GSH）標(biāo)準(zhǔn)溶液稱取3.1mg還原型谷胱甘肽，加入少量乙醇溶解，再溶解到蒸餾水中，定容至100mL。四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6支試管，編號，按照表20加入各種試劑，混勻，于25℃保溫反應(yīng)10min，以0號管為參比調(diào)零，測定顯色液在波長412nm處的吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，還原型谷胱甘肽含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。表20．繪制還原型谷光甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線的試劑量項(xiàng)目管號012345還原型谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)液/mL00.20.40.60.81.0蒸餾水/mL1.00.80.60.40.20100mmol/L、pH7.7磷酸緩沖液/mL1.01.01.01.01.01.0DTNB試劑/mL0.50.50.50.50.50.5相當(dāng)于還原型谷胱甘肽量/μmol020406080100（二）提取稱取5.0g果實(shí)樣品置于研缽中，加入5.0mL經(jīng)4℃預(yù)冷的5%（w/v）三氯乙酸溶液（含5mmol/LEDTA-Na2），在冰浴條件下研磨勻漿后，于4℃、12000×g離心20min。收集上清液用來測定谷胱甘肽含量。（三）測定取一支試管，依次加入1.0mL蒸餾水、1.0mL100mmol/L、pH7.7磷酸緩沖液和0.5mL4mmol/LDTNB溶液，混勻即為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的“0”號管溶液。以此溶液作為參比在波長412nm處對分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零。再取兩支試管，分別加入1.0mL提取上清液、1.0mL100mmol/L、pH7.7磷酸緩沖液。然后，向一支試管中0.5mL4mmol/LDTNB溶液，另一支試管中加入0.5mL100mmol/L、pH6.8磷酸緩沖液代替DTNB試劑。將兩支反應(yīng)管置于25℃保溫反應(yīng)10min。按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，迅速測定顯色液在波長412nm處的吸光度值。分別記作ODS和ODC。重復(fù)三次。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算1．將測定的數(shù)據(jù)填入下列表重復(fù)次數(shù)樣品重量W(g)提取液體積V(mL)吸取樣品液體積VS(mL)412nm吸光度值由標(biāo)曲查得GSH量C(μmol)樣品中還原型GSH含量(μmol/gFW)ODSODCODS-ODC計(jì)算值平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差1232．計(jì)算結(jié)果顯色反應(yīng)后，分別記錄樣品管反應(yīng)混合液的吸光度值（ODS）和空白對照管反應(yīng)混合液的吸光度值（ODC）。根據(jù)吸光度值差值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查處相應(yīng)的還原型谷胱甘肽量，計(jì)算每克鮮重（FW）果蔬組織中還原型谷胱甘肽含量，表示為μmol/gFW。計(jì)算公式：式中：V——樣品提取液總體積，mL；VS——吸取樣品液體積，mL；C——由標(biāo)曲查得溶液中還原型GSH的量，μmol；W——樣品重量，g。六、注意事項(xiàng)1．在提取樣品時(shí)，需要沉淀去蛋白質(zhì)，以防止蛋白質(zhì)中所含巰基及相關(guān)酶對測定結(jié)果的影響。2．利用本方法還可以測定樣品中總谷胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量。在谷胱甘肽還原酶（GR）作用下，將GSSG還原成GSH