碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件

中山大學(xué)碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法聰明出于勤奮，天才在于積累中山大學(xué)碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法中山大學(xué)碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法聰明出于勤奮，天才在于積累基因組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)馬珊珊中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室中山大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究常用方法1.檢測基因的表達(dá)水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：報道基因2.證明轉(zhuǎn)錄因子的功能：增強(qiáng):overexpression,constitutivelyactivate抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.導(dǎo)入外源基因方法：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，病毒感染，穩(wěn)定細(xì)胞株中山大學(xué)碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法聰明出于勤奮1碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件2碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件3碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件4碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件5意義神經(jīng)元凋亡→AD、PD等神經(jīng)退行性疾病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控研究－尋找調(diào)控凋亡的關(guān)鍵分子揭示神經(jīng)退行性疾病機(jī)制并確立新的防治靶點6意義神經(jīng)元凋亡→AD、PD等神經(jīng)退行性疾病6JNK/c-Jun是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵通路

撤NGF處理交感神經(jīng)元撤鉀處理小腦顆粒神經(jīng)元

β淀粉樣蛋白處理大腦皮質(zhì)神經(jīng)元黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元凋亡

……7JNK/c-Jun是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵通路撤NGF處理交88c-Jun的靶基因是什么？

FasL

MolCellBiol2019

MolCellNeurosci2019JCellBiol2019Bim

Neuron2019

Neuron2019

NeurosciLett20199c-Jun的靶基因是什么？

FasLMolCell1010尋找c-Jun促凋亡靶基因

－基因芯片方法促凋亡靶基因：1凋亡時上調(diào)2Ad-169抑制3促凋亡作用

25K,5K,5K+Ad-169提RNAcDNAAffymetrixgenechip尋找c-Jun促凋亡靶基因

11Δ169結(jié)構(gòu)示意圖Δ169結(jié)構(gòu)示意圖12腺病毒技術(shù)感染率80％腺病毒技術(shù)感染率80％13各類病毒比較見下表病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒Adenovirus慢病毒Lentivirus腺相關(guān)病毒Ad-associatedvirus病毒基因組雙鏈DNA病毒RNA病毒單鏈DNA病毒復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制復(fù)制缺陷是否整合病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時表達(dá)病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達(dá)病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達(dá)感染細(xì)胞類型分裂和不分裂細(xì)胞分裂和不分裂細(xì)胞分裂和不分裂細(xì)胞表達(dá)豐度高水平表達(dá)中水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時間快（1-2天）慢(

2-4天)慢滴度滴度高達(dá)1012pfu/ml滴度最高可達(dá)109TU/ml滴度最高可達(dá)105TU/ml克隆容量可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過10kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過5kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性各類病毒比較見下表病毒腺病毒慢病毒腺相關(guān)病毒病毒基因組雙鏈D14c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,atf3,drak215c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,JNK/c-Jun介導(dǎo)dp5表達(dá)上調(diào)16JNK/c-Jun介導(dǎo)dp5表達(dá)上調(diào)16

c-Jun直接調(diào)控dp5直接調(diào)控:c-Jun結(jié)合dp5啟動子觸發(fā)dp5表達(dá)

c-Jun直接調(diào)控dp5直接調(diào)控:c-Jun結(jié)合dp517確立dp5啟動子核心區(qū)確立dp5啟動子核心區(qū)18分析dp5啟動子上的TF位點TRANSFAC：

gene-regulation/pub/databases.htmlGenomatixSuite：需注冊ALGGEN：alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.htmlalggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3分析dp5啟動子上的TF位點TRANSFAC：19碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件20Dp5啟動子上有c-Jun結(jié)合的ATF位點Dp5啟動子上有c-Jun結(jié)合的ATF位點21dp5啟動子上的ATF位點對其轉(zhuǎn)錄活性是否重要？dp5啟動子上的ATF位點對其轉(zhuǎn)錄活性是否重要？22報道基因報道基因23ATF位點是dp5上調(diào)的關(guān)鍵位點24ATF位點是dp5上調(diào)的關(guān)鍵位點24c-Jun是否直接結(jié)合在dp5啟動子的ATF位點上？25c-Jun是否直接結(jié)合在dp5啟動子的ATF位點上？25ElectrophoreticMobilityShiftAssay(EMSA)26ElectrophoreticMobilityShiftc-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合c-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合27Chromatin

Immunoprecipitation

(ChIP)Chromatin

Immunoprecipitation28c-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合29c-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合29dp5上調(diào)是神經(jīng)元凋亡所必需30dp5上調(diào)是神經(jīng)元凋亡所必需30siRNAsiRNA313232JonathanHamLabJonathanHamLab333434碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件35ATF位點介導(dǎo)c-Jun靶基因上調(diào)反式作用因子c-Jun/ATF2ATFsiteTTACCTCA36ATF位點介導(dǎo)c-Jun靶基因上調(diào)反式作用因子c-Jc-Jun異二聚體的靶序列37c-Jun異二聚體的靶序列373838393940404141c-Jun/ATF2形成二聚體42c-Jun/ATF2形成二聚體42Immunoprecipitation(IP)Immunoprecipitation(IP)43c-Jun/ATF2介導(dǎo)ATF活性c-Jun/ATF2介導(dǎo)ATF活性44抑制c-Jun或ATF2保護(hù)神經(jīng)元凋亡45抑制c-Jun或ATF2保護(hù)神經(jīng)元凋亡45干擾c-Jun、ATF2抑制神經(jīng)元凋亡46干擾c-Jun、ATF2抑制神經(jīng)元凋亡46atf-decoy抑制神經(jīng)元凋亡p12ATF-(TTACATCA)-c-Jun/ATF2p12ATF-(GGACATCG)-mut47atf-decoy抑制神經(jīng)元凋亡p12ATF-(TTACc-Jun、ATF2協(xié)同促凋亡c-Jun、ATF2協(xié)同促凋亡48constitutivelyactivateconstitutivelyactivate49c-Jun/ATF2二聚體促進(jìn)神經(jīng)元凋亡c-Jun/ATF2二聚體促進(jìn)神經(jīng)元凋亡50515151BiFC(BimolecularFluorescenceComplementationAssay)

Chang-DengHuetal.2019,MolCellBiFC(BimolecularFluorescence52凋亡時BiFC增多凋亡時BiFC增多53Fos↑→BiFC↓,

Fos↓→BiFC↑54Fos↑→BiFC↓,Fos↓→BiFC↑54Fos抑制c-Jun/ATF2二聚體形成55Fos抑制c-Jun/ATF2二聚體形成55Fos保護(hù)神經(jīng)元56Fos保護(hù)神經(jīng)元565757碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件58轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究常用方法1.檢測基因的表達(dá)水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：報道基因2.證明轉(zhuǎn)錄因子的功能：

增強(qiáng):overexpression,constitutivelyactivate

抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.導(dǎo)入外源基因方法：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，病毒感染，穩(wěn)定細(xì)胞株轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究常用方法1.檢測基因的表達(dá)水平：59轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究常用方法4.從源頭尋找差異基因方法：genechip,ChIPonchip,ChIPsequence5.啟動子分析：確立啟動子核心區(qū)預(yù)測啟動子上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點6.證明轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在啟動子上：EMSA，ChIP7.蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用Co-IP,GST-pulldown,BiFC,FRET，PLA…轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究常用方法4.從源頭尋找差異基因方法：60謝謝！謝謝！6166、節(jié)制使快樂增加并使享受加強(qiáng)?！轮兛死?/p>

67、今天應(yīng)做的事沒有做，明天再早也是耽誤了?！崴固┞妪R

68、決定一個人的一生，以及整個命運(yùn)的，只是一瞬之間。——歌德

69、懶人無法享受休息之樂?！伎?/p>

70、浪費(fèi)時間是一樁大罪過?！R梭66、節(jié)制使快樂增加并使享受加強(qiáng)?！轮兛死?2中山大學(xué)碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法聰明出于勤奮，天才在于積累中山大學(xué)碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法中山大學(xué)碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法聰明出于勤奮，天才在于積累基因組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)馬珊珊中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室中山大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究常用方法1.檢測基因的表達(dá)水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：報道基因2.證明轉(zhuǎn)錄因子的功能：增強(qiáng):overexpression,constitutivelyactivate抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.導(dǎo)入外源基因方法：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，病毒感染，穩(wěn)定細(xì)胞株中山大學(xué)碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法聰明出于勤奮63碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件64碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件65碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件66碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件67意義神經(jīng)元凋亡→AD、PD等神經(jīng)退行性疾病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因調(diào)控研究－尋找調(diào)控凋亡的關(guān)鍵分子揭示神經(jīng)退行性疾病機(jī)制并確立新的防治靶點68意義神經(jīng)元凋亡→AD、PD等神經(jīng)退行性疾病6JNK/c-Jun是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵通路

撤NGF處理交感神經(jīng)元撤鉀處理小腦顆粒神經(jīng)元

β淀粉樣蛋白處理大腦皮質(zhì)神經(jīng)元黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元凋亡

……69JNK/c-Jun是神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵通路撤NGF處理交708c-Jun的靶基因是什么？

FasL

MolCellBiol2019

MolCellNeurosci2019JCellBiol2019Bim

Neuron2019

Neuron2019

NeurosciLett201971c-Jun的靶基因是什么？

FasLMolCell7210尋找c-Jun促凋亡靶基因

－基因芯片方法促凋亡靶基因：1凋亡時上調(diào)2Ad-169抑制3促凋亡作用

25K,5K,5K+Ad-169提RNAcDNAAffymetrixgenechip尋找c-Jun促凋亡靶基因

73Δ169結(jié)構(gòu)示意圖Δ169結(jié)構(gòu)示意圖74腺病毒技術(shù)感染率80％腺病毒技術(shù)感染率80％75各類病毒比較見下表病毒表達(dá)系統(tǒng)腺病毒Adenovirus慢病毒Lentivirus腺相關(guān)病毒Ad-associatedvirus病毒基因組雙鏈DNA病毒RNA病毒單鏈DNA病毒復(fù)制自主復(fù)制自主復(fù)制復(fù)制缺陷是否整合病毒基因組游離于宿主基因組外，瞬時表達(dá)病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達(dá)病毒基因組整合于宿主基因組，長時間、穩(wěn)定表達(dá)感染細(xì)胞類型分裂和不分裂細(xì)胞分裂和不分裂細(xì)胞分裂和不分裂細(xì)胞表達(dá)豐度高水平表達(dá)中水平表達(dá)高水平表達(dá)表達(dá)時間快（1-2天）慢(

2-4天)慢滴度滴度高達(dá)1012pfu/ml滴度最高可達(dá)109TU/ml滴度最高可達(dá)105TU/ml克隆容量可插入高達(dá)8kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過10kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低可插入不超過5kb的外源片段，滴度隨插入片段長度增加而降低免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性各類病毒比較見下表病毒腺病毒慢病毒腺相關(guān)病毒病毒基因組雙鏈D76c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,atf3,drak277c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,JNK/c-Jun介導(dǎo)dp5表達(dá)上調(diào)78JNK/c-Jun介導(dǎo)dp5表達(dá)上調(diào)16

c-Jun直接調(diào)控dp5直接調(diào)控:c-Jun結(jié)合dp5啟動子觸發(fā)dp5表達(dá)

c-Jun直接調(diào)控dp5直接調(diào)控:c-Jun結(jié)合dp579確立dp5啟動子核心區(qū)確立dp5啟動子核心區(qū)80分析dp5啟動子上的TF位點TRANSFAC：

gene-regulation/pub/databases.htmlGenomatixSuite：需注冊ALGGEN：alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.htmlalggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3分析dp5啟動子上的TF位點TRANSFAC：81碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件82Dp5啟動子上有c-Jun結(jié)合的ATF位點Dp5啟動子上有c-Jun結(jié)合的ATF位點83dp5啟動子上的ATF位點對其轉(zhuǎn)錄活性是否重要？dp5啟動子上的ATF位點對其轉(zhuǎn)錄活性是否重要？84報道基因報道基因85ATF位點是dp5上調(diào)的關(guān)鍵位點86ATF位點是dp5上調(diào)的關(guān)鍵位點24c-Jun是否直接結(jié)合在dp5啟動子的ATF位點上？87c-Jun是否直接結(jié)合在dp5啟動子的ATF位點上？25ElectrophoreticMobilityShiftAssay(EMSA)88ElectrophoreticMobilityShiftc-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合c-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合89Chromatin

Immunoprecipitation

(ChIP)Chromatin

Immunoprecipitation90c-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合91c-Jun與dp5啟動子ATF位點直接結(jié)合29dp5上調(diào)是神經(jīng)元凋亡所必需92dp5上調(diào)是神經(jīng)元凋亡所必需30siRNAsiRNA939432JonathanHamLabJonathanHamLab959634碩士研究生生物醫(yī)學(xué)課程-轉(zhuǎn)錄調(diào)控基本方法課件97ATF位點介導(dǎo)c-Jun靶基因上調(diào)反式作用因子c-Jun/ATF2ATFsiteTTACCTCA98ATF位點介導(dǎo)c-Jun靶基因上調(diào)反式作用因子c-Jc-Jun異二聚體的靶序列99c-Jun異二聚體的靶序列3710038101391024010341c-Jun/ATF2形成二聚體104c-Jun/ATF2形成二聚體42Immunoprecipitation(IP)Immunoprecipitation(IP)105c-Jun/ATF2介導(dǎo)ATF活性c-Jun/ATF2介導(dǎo)ATF活性106抑制c-Jun或ATF2保護(hù)神經(jīng)元凋亡107抑制c-Jun或ATF2保護(hù)神經(jīng)元凋亡45干擾c-Jun、ATF2抑制神經(jīng)元凋亡108干擾c-Jun、ATF2抑制神經(jīng)元凋亡46atf-decoy抑制神經(jīng)元凋亡p12ATF-(TTACATCA)-c-Jun/ATF2p12ATF-(GGACATCG)-mut109atf-decoy抑制神經(jīng)元凋亡p12ATF-(TTACc-Jun、ATF2協(xié)同促凋亡c-Jun、ATF2協(xié)同促凋亡110constitutivelyactivateconstitutivelyactivate111c-Jun/ATF2二聚體促進(jìn)神經(jīng)元凋亡c-Jun/ATF2二聚體促進(jìn)神經(jīng)元凋亡11211351113BiFC(BimolecularFluorescenceComplementationAssay)

Chang-DengHuetal.2019,MolCellBiFC(BimolecularFluorescence114凋亡時