免疫原和抗血清的制備

關于免疫原和抗血清的制備第一頁，共四十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)免疫原的制備

免疫原是能夠引起機體產生抗體，并能與之發(fā)生反應的物質

一、顆粒性抗原的制備：1.顆?？乖讣毎乖蚣毦乖?。

2.細菌抗原：H抗原有動力的菌株O抗原100℃

2-2.5h為了破壞H抗原，獲得O抗原Vi抗原

3.蟲卵、細胞膜顆?？乖嗜闈釥?，多用V內免疫，較少用佐劑作皮內注射

第二頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、可溶性抗原的制備：組織和細胞粗抗原的制備：

1.組織和細胞混合抗原的制備：

組織勻漿制備：

標本要求：新鮮或低溫（＜-40℃）保存的去除表面包膜或結締組織或一些大血管，臟器應進行

灌注，除去血管內殘留血液

制備

處理好組織→0.05％NaN3生理鹽水洗凈→剪成小塊

粉碎→高速組織搗碎機法→2000-3000rpm離心10min

研磨法：玻璃勻漿器,乳缽研磨

→上清10000-20000rpm20-30min高速離心

第三頁，共四十八頁，2022年，8月28日2.細胞抗原的制備：

細胞抗原細胞膜蛋白抗原

細胞漿抗原

細胞核及核膜抗原

粉碎：

（1）反復凍融法

（2）冷熱交替法：適合細菌，病毒蛋白質及核酸

（3）超聲破碎法：適合于微生物和組織細胞

細菌，尤其真菌厚膜孢子難破壞

（4）自溶法：利用組織和微生物的自身酶系

需一定PH和溫度動物組織cell

0-4℃

微生物室溫

（5）溶菌酶法：一定PH（PH8.0），溶菌酶可專一破壞菌胞。蝸牛酶，纖維素酶消化細菌和組織cell

（6）表面活性劑處理法

第四頁，共四十八頁，2022年，8月28日

蛋白質抗原的制備和純化：可溶性抗原絕大部分為蛋白質

1.超速離心和梯度密度離心法：

用來分離亞細胞部分及大分子蛋白質

1）差速離心：高低速交替進行。將大分子物質分離

2）梯度密度離心：區(qū)帶分離法，通過梯度密度來維持重力的穩(wěn)定性，通常分離的懸液中的顆粒比液體重，要使之上浮，必須加入第三種成份，其密度連續(xù)或不連續(xù)升高，即所謂梯度

3）第三種成份多用甘油、蔗糖氯化色，氯化銣

適合于少部分大分子抗原，對于大量的中、小分子量的蛋白質抗原不適用此法

第五頁，共四十八頁，2022年，8月28日2.選擇性沉淀法：用沉淀劑或改變某些條件促使抗原成分沉淀

1）核酸除去法：

（1）提取沉淀劑：

（2）核糖核酸酶降解法：用DNA或RNA酶與提取液作用30-60min（4℃），即可除去核酸

2）鹽析沉淀法：

（1）抗原的粗篩33-50％飽和度的硫酸銨

（2）提取丙種球蛋白主要為IgG

33-40％飽和度的硫酸銨

（3）抗原的濃縮

3）有機溶劑沉淀法：

有機溶劑多為酒精和丙酮

4）水溶性非離子型聚合物沉淀法：

PEG+蛋白質顆?！恋怼秃衔?、蛋白質發(fā)生水的重分配分子量2000-6000PEG可用于沉淀蛋白PEG濃度不同可沉淀不同pro3-4％沉淀免疫復合物6-7％沉淀IgM

8-12％沉淀IgG

12-15%沉淀其他球蛋白

25％沉淀白蛋白第六頁，共四十八頁，2022年，8月28日3.凝膠過濾和離子交換層析：

1）分析篩層析又名凝膠過濾，將Ag分成大、中、小三種

大分子較快出來，小分子因被阻留，出來較慢。根據分子量不同

2）離子交換層析：離用帶離子基因的纖維素

流動相逐步增加離子強度，蛋白質按電荷不同或量的差異分組常用DEAE纖維素（二乙基氨基乙基纖維素）

根據pro攜帶電荷不同（溶液中等電點不同）

常用于分離IgM

因為IgM分子量大

凝膠過濾洗脫曲線

第七頁，共四十八頁，2022年，8月28日4.親和層析：

利用生物大分子的生物學特異性，即生物分子間的具有的專一性親和力而設計的層析技術。

eg：Ag和Ab，酶和酶的抑制劑，酶蛋白和輔酶，激素和激素受體等其之間有特殊親和力，可緊密結合成復合物.

1）親和層析支持物的選擇：

常用：瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）

第八頁，共四十八頁，2022年，8月28日

2）配體的選擇：

3）抗原或抗體與支持物的結合：

步驟：

（1）活化支持物上的功能基因

溴化氛PH11與支持物上的羥基形成氨基形成氨基甲酸酯基因

（2）交聯(lián)（聯(lián)接）

（3）清洗：除去未結合的pro

（4）親和層析條件的選擇：原理：一定條件下，Ag和Ab能可逆性地結合成復合物，當條件改變（如稀酸、稀堿、濃鹽、加溫等）時又可將抗原抗體解離。如果將抗原或抗體固定在不溶性的載體上能從液相中專一性分出抗體或抗原。根據這一原理，將可溶性抗原（或抗體）用化學方法偶聯(lián)到不溶性載體上，當將相應的抗血清（或抗原）按層析方法加入柱中，抗血清中的相應的抗體與抗原特異性結合。其他蛋白成分隨洗脫液流出。再改變緩沖液的PH值和離子強度，則可以使抗體和偶聯(lián)在載體上的Ag解離（加入解脫劑），經洗脫，從而得到純化的Ab。

第九頁，共四十八頁，2022年，8月28日2）配體的選擇：抗原或抗體與支持物的結合：

步驟：

（1）活化支持物上的功能基團

溴化氰PH11與支持物上的羥基形成氨基甲酸酯基團

（2）交聯(lián)（聯(lián)接）

（3）清洗：除去未結合的pro

（4）親和層析條件的選擇：原理：在一定條件下，Ag和Ab能可逆性地結合成復合物，當條件改變（如稀酸、稀堿、濃鹽、加溫等）時又可將抗原抗體解離。如果將抗原或抗體固定在不溶性的載體上就能從液相中專一性地

分出抗體或抗原。根據這一原理，將可溶性抗原（或抗體）用化學方法偶聯(lián)到不溶性載體上，當將相應的抗血清（或抗原）按層析方法加入柱中，抗血清中的相應的抗體與抗原特異性結合。其他蛋白成分隨洗脫液流出。再改變緩沖液的PH值和離子強度，則可以使抗體和偶聯(lián)在載體上的Ag解離（加入解脫劑），經洗脫，從而得到純化的Ab。第十頁，共四十八頁，2022年，8月28日以免疫親和層析為例

（三）免疫球蛋白片段的制備：

1）溫和分離亞單位：

（1）改變PH值PH＜3或＞10，Ig亞單位自動解離

（2）利用強度性劑

適合載脂蛋白Ag和膠原肽的提取

2）二硫鍵的解離：

適合于將輕、重鏈分開

3）溴化氰裂解法：

與蛋白質中的甲硫氨酸側鏈的硫醚基起反應，生成溴化亞氨內酯

4）酶法裂解：

木瓜酶將IgG分解為Fc和Fab（×2）三個片段

胃蛋白酶IgG分解為（Fab）2和幾個小肽段

胰蛋白酶IgG切成不規(guī)則肽鏈

應用：木瓜酶切斷，得Fc段，制備抗重鏈血清

胃蛋白酶切取，得F（ab）2，用于診斷（用Ab鑒別Ag）

第十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日（四）純化抗原的鑒定：1.含量鑒定：

生化方法酚試劑法

雙縮脲法可見光吸收法

紫外吸收法Ag寶貴，少

2純度的鑒定：醋酸纖維薄膜電泳法－－經典常用

聚丙烯酰胺凝膠電泳法

免疫電泳法

免疫雙擴散法

ELISA或RIA（放免）－－

不純，也可能是同一物質的聚合體或降解物

較純，也不能排除在這條帶中有其他成分

所以單一方法，可信度差。因而幾種方法聯(lián)用較可靠第十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日三、半抗原免疫原的制備

半抗原：只有反應原性，沒有免疫原性的小分子物質

半抗原+載體→大分子物質-------Ab

人工抗原

結合方法物理法：利用電荷和微孔

化學法

（一）載體的選擇：

1.蛋白質：常用牛血清白蛋白

2.多肽類聚合物：常用多聚賴aa

3.大分子的聚合物和某些顆粒：加入福氏佐劑可產生良好Ab

（二）聯(lián)接的方法：

三個基本條件：

1.碳化二亞胺法;

2.二醛法：

3.混合酸酐法（氯甲酸異丁酯法）

三）無羧基和氨基半抗原衍生物的制備：

1.琥珀酸酐法

2.O-（羧甲基）羥胺法

3.一氯醋酸鈉法，適用于帶酚基的半抗原

4.重氮化的對氨基苯甲酸法：適于帶酚基的半抗原第十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日四.佐劑：（一）使用佐劑的目的為提高免疫原性

佐劑本身可有或無免疫原性

（二）機理：

1.可直接或參與cell免疫反應

2.佐劑與Ag混合，可以使Ag在局部組織的存留時間長，延長Ag的局部吸收?？沙掷m(xù)刺激機體，產生高滴度Ab

3.佐劑可增加Ag表面積，并改變Ag的活性基因構型，從而增加Ag的免疫原性。

第十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日常用的佐劑和制備方法：

1.應用最多的為福氏佐劑不完全：石蠟油+羊毛脂

完全：石蠟油+羊毛脂+卡介苗

2.乳劑的制備：

乳劑：Ag和佐劑的混合物

Ag與佐劑比例為1：1，注射前要充分乳化

乳化方法研磨法

攪拌混合法旋渦混合第十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日抗體的制備多克隆抗體的制備單克隆抗體的制備第十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)抗血清的制備

免疫原+佐劑→刺激動物機體→獲得抗血清

一.動物的選擇

1.種屬差異越遠越好，太近不易產生良好的抗體，甚至不產生

2.抗血清量的要求：量大，選大動物

量少，選小動物

3.抗血清的要求：R型（兔型）H型（馬型）

4.抗原的選擇：蛋白質Ag大部分動物皆適合，常用家兔、山羊

IgE對綿羊，胰島素對家兔，酶對山羊免疫時不產生Ab

5.甾體激素多用兔，酶多用豚鼠

6.對動物個體的要求：雄性稚齡、健康、正常、無感染

第十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、免疫前準備1.正常飼養(yǎng)：3d，觀察是否健康、正常、無感染2.取陰性血清：耳靜脈取血

第十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、免疫劑量、時間和途徑選擇原則：

1.劑量：大動物0.5-1mg/只

小動物0.1-0.6mg/只

1）免疫劑量不要過大，Ag過量，易產生免疫抑制

2）第一次免疫劑量要小，多次免疫后可加大劑量

3）選擇合適的免疫劑量，要根據Ag性強弱，分子量大小，動物大小，免疫時間而定。

2.時間：1）間隔時間短，易產生免疫抑制

一般第1、2次間要有10-20d，2次以后7-10d

2）半抗原間隔時間長3.途徑：多點注射，（足掌、腋窩L結周圍，背部兩側，頜下，耳后皮內或皮下注射）

Ag寶貴，采取微量注射法

第十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日免疫程序：1.背部皮下多點注射2.淋巴結內注射第二十頁，共四十八頁，2022年，8月28日試血1.根據免疫程序末次免疫，從耳靜脈取血分離血清2.瓊脂雙擴散測效價第二十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日三.動物采血法：

抗血清鑒定

采血前，禁食動物24h，防止血脂過高

末次免疫后，5-7d之內采血。否則抗血清效價↓

1.頸動脈放血法：適于兔、羊

2.心臟采血法：適于小動物

3.靜脈多次采血清免：耳中央V

100ML

羊：頸V

1500-2000ML

小鼠：斷尾或摘除眼球2ML

抗血清分離，滅活56℃30min

第二十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三節(jié)抗血清的鑒定和保存

一、抗血清的鑒定：

免疫成功，Ab較純，含有雜Ab免疫不成功

1.特異性鑒定：免疫雙擴散法

2.效價的鑒定：免疫雙擴散法

Ab稀釋法：不稀釋1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

Ag∴1/32作為Ag效價

3.AgAb的親和力的鑒定

Ag+AbAgAbK值109-1011L/mol之間

K值大，AgAb結合力大

K值小，AgAb結合力小

第二十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日二、抗血清其他鑒定方法：三、抗血清的保存：

1.4℃無菌處理，防腐液體狀態(tài)3-6月

2.-20℃--40℃度冰凍保存5年小包裝

3.干燥冰凍5-10年

第二十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日第四節(jié)抗血清中抗體的純化

目的：除去雜Ab

1.Ab特異性的純化

除去雜Ab1）吸附劑法

2）親和層析

2.特異性IgG抗體的制備：

1）鹽析法粗提V－球蛋白

不同飽和度的（NH4）2SO4或Na2SO4

2）離子交換層析法提取IgG：

常用DEAE纖維素IgG帶正電荷，其他pro帶負電荷

3）親和層析法提取特異性IgG

4）酶解法制備F（ab）2片段第二十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日第五節(jié)單克隆抗體及基因工程抗體一、單克隆抗體：1、淋巴細胞雜交瘤技術2、單克隆抗體3、單克隆與多克隆抗體比較4、用途二、基因工程抗體第二十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日一、單克隆抗體

1、淋巴細胞雜交瘤技術(kohlermilstein)

淋巴細胞雜交瘤技術：75年才創(chuàng)立的技術，將在體外不能長期生存的免疫細胞與在體外能迅速增殖的骨髓瘤細胞在聚乙二醇的作用下融合產生雜交瘤細胞，所得雜交瘤細胞繼承了兩種細胞的能力，即保存了瘤細胞在體外迅速增殖傳代的能力，又繼承了免疫細胞合成與分化的能力，淋巴細胞主要T細胞、B細胞(T細胞與胸腺瘤細胞融合，可產生分泌淋巴因子的T細胞雜交瘤)B細胞與瘤細胞融合，產生能分泌特異抗體的B細胞雜交瘤。

第二十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日2、單克隆抗體：通過淋巴細胞雜交瘤技術，把產生特定抗體的B細胞與能無限生長的骨髓瘤的細胞融合，形成的B細胞雜交瘤，由這克隆化B的雜交瘤所產生的抗體。純度高，專一性強，重復性好，且能持續(xù)在動物體外或體內產生固體性抗體。第二十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日3、單、多克隆抗體比較：多克隆抗體—：是由多個淋巴細胞克隆產生的(抗原分子量大，表面決定簇多產生不抗體)是高度異質性，特異性低，純度差，反應不夠靈敏，限制免疫學血清學的發(fā)展，影響診斷準確性和治療效果。單克隆抗體—：特異性強，體外產生，質地均一，反應靈敏，工業(yè)化生產任何多肽蛋白質特別是半抗原均可用淋巴細胞雜交瘤技術來制備單克隆抗體。第二十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日第三十頁，共四十八頁，2022年，8月28日4、單克隆抗體的應用：單克隆抗體技術被譽為免疫學的一次革命，是20世紀后20年內最為重要的生物高技術之一。1984年獲諾貝爾醫(yī)學與生理學獎。從醫(yī)、農、食品等給人帶來新的希望。多克隆抗體特異性低，純度差，反應不夠靈敏，影響診斷的準確性，及治療效果，以及實驗技術的提高，還出現(xiàn)血清病，過敏性休克，含量不一，無法標準化。單克隆抗體特異性高，滴度高，質地均一，反應靈敏，可標準化等優(yōu)點，可工業(yè)化大規(guī)模生產，單克隆產品診斷試劑投資少，收效快，產值高。任何多肽與蛋白如病毒、細菌、寄生蟲，正常細胞及惡化細胞，各種因子受體與介質、激素、酶類和血液成份，食物品與環(huán)境的有害物，甚至一段氨基酸、核苷酸DNAorRNA順序化合物半抗原，都可通過B細胞雜交瘤技術，制備出相應單克隆抗體。第三十一頁，共四十八頁，2022年，8月28日開發(fā)癌瘤、病毒性疾病、化膿性疾病、自身免疫疾病和移植排斥反應的單抗新藥，廣泛應用基礎研究、疾病診斷、環(huán)境、食品監(jiān)測，治療、預防提純蛋白，優(yōu)生優(yōu)育等，主要應用以下幾方面：（1）疾病診斷（2）體內顯象定位檢查（3）體內治療和導向治療（4）食品環(huán)境監(jiān)測（5）提純蛋白與基因工程產品，用于人、動、植物各學科的分子生物學研究第三十二頁，共四十八頁，2022年，8月28日5.單克隆抗體的制備單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）

抗原決定簇：Ag上特異的化學基因稱Ag決定簇。

當Ag免疫動物時，Ag的每個抗原決定簇可分別刺激相應Bcell，因為每個Bcell表面的Ag受體只針對一個Ag決定簇，并產生針對該Ag決定簇的Ab。一個Bcell只識別一個Ag決定簇，并產生該Ag決定簇的Ab，稱為單克隆Ab。這種Ab是均一的，且是單一特異性的。

1種Ag可有多個抗原決定簇

第三十三頁，共四十八頁，2022年，8月28日第一節(jié)B淋巴細胞雜交瘤技術的原理B淋巴細胞雜交瘤：

用人工方法使Ab產生cell與骨髓瘤cell融合而成，產生的一類特殊cell。

Ab產生cell來源于小鼠脾cell（B細胞）

骨髓瘤cell來源于同系小鼠?？纱罅矿w外增殖，長期培養(yǎng)

雜交瘤cell兼有兩種親本cell特性，既能分泌Ab，又能大量增殖

第三十四頁，共四十八頁，2022年，8月28日一、Bcell雜交瘤技術的原理：二、小鼠骨髓瘤cell的篩選：三、細胞融合劑：PEG多選分子量1000-2000

PEG的作用基理：PEG可改變cell膜脂類分子排布，使cell膜易脂類分子排布，使cell膜易被打開，最終引起cell融合

第三十五頁，共四十八頁，2022年，8月28日HAT培養(yǎng)基的選擇作用：

HAT

次黃嘌呤（H）核苷酸前體，使cell通過替代途徑合成DNA

氨基蝶呤（A）葉酸拮抗物，阻斷cell合成DNA的主要途徑

胸腺嘧啶核苷（T）使cell通過替代途徑合成DNA

第三十六頁，共四十八頁，2022年，8月28日cell合成DNA有兩種途徑：主要途徑：糖、aa、合成核苷酸合成DNA

需葉酸參與氨基蝶呤（A）可阻替代途徑：次黃嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）

HGPRT

TK催化

小鼠骨髓瘤cell都缺乏HGPRT，在HAT培養(yǎng)基中，不能完成完整DNA合成過程∴易死亡

雜交瘤cell可利用脾C的HGPRT，通過替代途徑合成DNA

第三十七頁，共四十八頁，2022年，8月28日雜交瘤cell的篩選和克隆化

1.篩選目的：Ab陽性分泌的雜交瘤細胞，ELISA：檢測Ab→Ab陽性細胞

純化好的單一性可溶性Ag，包被到微孔上2.雜交瘤的克隆化：2.1定義：用一定方法使混合的cell分離成單個cell獨立狀態(tài)，再經擴大培養(yǎng)形成的各個cell群，就分別是一個克隆，這種方法稱為克隆化2.2目的：獲得目的Ab陽性，Ab分泌旺盛的雜交瘤cell株2.3克隆化方法：有限稀釋法將融合cell用培養(yǎng)液充分稀釋，直至每孔只有1個cell

顯微操作法

瓊脂平板法

細胞選分代法2.4再次克隆化：初次及再次克隆化之前均要檢測Ab多次傳代，冰凍復蘇的雜交瘤cell均要再次克隆化

第三十八頁，共四十八頁，2022年，8月28日第二節(jié)制備McAb的技術要點一、免疫小鼠：

為防止免疫反應不佳或中途死亡，應同時免疫3-4只小鼠

Ag純選用與骨髓瘤cell同源的BALB/C小鼠二、培養(yǎng)骨髓瘤cell：

與待融合脾cell同源

選生長旺盛，形態(tài)良好，處于對數生長期的cell以供融合用

避免cell反祖，用8-AG處理cell

切忌過多傳代三、收集脾cell

分離脾之前，要檢測Ab。采脾，制成懸液四、采取飼養(yǎng)cell五、cell融合：

是雜交瘤的中心環(huán)節(jié)，PEG融合

第三十九頁，共四十八頁，2022年，8月28日六、檢測Ab

Ab檢測結果+陽性cell→克隆化

-更換動物，避免無效試驗

檢測Ab，一般選用ELISA或RIA（放免）

目的：找到陽性細胞株七、單個細胞培養(yǎng)八、制備McAb九、陽性細胞的凍存和復蘇十、McAb的純化

鹽析法粗提半飽和硫酸銨沉淀

進一步純化根據McAb性質層析離子交換層析IgG

親和層析