第十四章基因工程與蛋白質工程課件

第十四章基因工程與蛋白質工程一、基因工程的定義及主要內容二、重組DNA分子引入宿主細胞和篩選鑒定三、克隆基因的表達四、基因工程的成就和展望五、蛋白質工程第十四章基因工程與蛋白質工程一、基因工程的定義及主要內容1一、基因工程定義及主要內容基因工程也稱基因重組技術、基因克隆或分子克隆.是指利用DNA重組技術生產或改造生物產品、創(chuàng)建或改良動植物品種以及開發(fā)特殊用途的微生物等.是生物工程的重要內容之一.一、基因工程定義及主要內容基因工程也稱基因重組技術、基因克隆2主要步驟：1.帶有目的基因的DNA片段的獲得；2、構建DNA重組分子；3、重組DNA分子引入宿主細胞和篩選鑒定；4、基因的表達.主要步驟：3基因工程基本程序真核染色體DNA克隆載體（質粒）限制酶切割限制酶切割并分離所需片斷重組載體細菌宿主細胞的轉化細胞分離培養(yǎng)增值基因工程基本程序真核染色體DNA克隆載體限制酶切割限制酶切割4構建DNA重組分子工具酶目的基因的制備克隆載體DNA分子的體外重組構建DNA重組分子工具酶5工具酶限制性內切酶是基因工程中最主要的工具酶DNA連接酶（DNAligase）、DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ）、末端轉移酶（terminaltransferase）、逆轉錄酶（reversetranscriptase）、核酸酶S1（nucleaseS1）和核酸外切酶Ⅶ（exonucleaseⅦ）工具酶限制性內切酶是基因工程中最主要的工具酶6限制性核酸內切酶由Smith在1970年從流感噬血菌中發(fā)現.細菌體內有特異的限制修飾系統(tǒng)，這種修飾系統(tǒng)是通過特殊的修飾酶在細菌本身DNA的特異識別序列處進行甲基化修飾，從而與外源DNA相區(qū)別。這樣，限制性核酸內切酶就能去切割破壞外源DNA，而對本身無影響。目前已從原核生物中分離出400～500多種限制性核酸內切酶.限制性核酸內切酶由Smith在1970年從流感噬血菌中發(fā)現.7限制性核酸內切酶能識別DNA特定核苷酸序列的核酸內切酶分類:三類.命名:EcoRI分布：主要來源于原核生物。特點：特異性，即識別特定核苷酸序列，切割特定切點。結果：產生黏性未端（堿基互補配對）或平端。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制性核酸內切酶能識別DNA特定核苷酸序列的核酸內切酶分類:8限制性核酸內切酶限制性內切酶可識別4或6個特異核苷酸序列.粘性末端：指限制性內切酶的切割部位不在識別序列的中心軸，在斷段產生一個短的單股突伸出來的不齊末端。鈍性末端：指限制性內切酶的切割部位在識別序列的中心軸處，即產生平齊末端。限制性核酸內切酶限制性內切酶可識別4或6個特異核苷酸序列.9限制性核酸內切酶同裂酶:來源不同,但有相同的識別序列.或稱異源同工酶.同切點酶:不僅識別序列相同,而且切點也相同.同尾酶:酶的識別序列不完全相同,但切出的粘性末端相同.限制性核酸內切酶同裂酶:來源不同,但有相同的識別序列.或稱異10幾種限制性內切酶的作用位點幾種限制性內切酶的作用位點11幾種限制性內切酶的作用位點幾種限制性內切酶的作用位點12目的基因的制備目的基因就是所需要克隆的外源基因.制備方法：1、人工合成法.2、逆轉錄法.3、用限制性內切酶直接從染色體DNA中分離.4、用PCR法擴增目的基因片段.目的基因的制備目的基因就是所需要克隆的外源基因.13目的基因的制備：人工合成法較小分子基因可用人工化學合成的方法獲得.DNA化學人工合成的方法已經自動化.人工合成目的基因的先決條件：基因的核苷酸序列是已知的.缺點是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因時遺傳密碼的兼并現象會為選擇密碼帶來很大困難；3、費用較高目的基因的制備：人工合成法較小分子基因可用人工化學合成的方法14目的基因的制備：逆轉錄法若所需基因較大，人工合成有困難，從組織中分離提取也不容易，則可利用逆轉錄法合成。該法是：以編碼某特異多肽的mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下反轉錄成該多肽mRNA的互補DNA（cDNA）；再以cDNA為模板，在DNA聚合酶I作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA（dsDNA）?？捎糜谡婧松锬康幕虻墨@得.目的基因的制備：逆轉錄法若所需基因較大，人工合成有困難，從組15目的基因的制備：逆轉錄法目的基因的制備：逆轉錄法16第十四章基因工程與蛋白質工程課件17目的基因的制備：逆轉錄法用逆轉錄法合成cDNA的主要問題是：1、mRNA必需提得很純.2、逆轉錄中常產生各種不完全的逆轉錄產物.3、以單鏈cDNA為模板往往難以合成與單鏈cDNA一樣長的ds－cDNA，這與實驗技術有關。目的基因的制備：逆轉錄法用逆轉錄法合成cDNA的主要問題是：18用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法主要適用于制備原核基因.對于物理圖譜已清楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出來.鳥槍法：指把目的基因從已用限制酶降解的染色體片段群中分離純化出的方法，即把包括目的基因在內的全部DNA片段插入到載體DNA（如pBR322）中，轉化大腸桿菌，做成基因文庫。再用目的基因的轉錄產物作探針，通過分子雜交，選擇出含有所需基因的DNA片段。用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法主要適用于制備原核19

基因文庫的構建

將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質粒或噬菌體載體上，轉化大腸桿菌,便構成了該生物的基因文庫?；蛭膸斓臉嫿?0用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法的優(yōu)點是獲得的目的基因的組織結構與天然基因一樣，也具有間隔順序。此方法的缺點是：由于含有插入順序，原始轉錄本不能被原核細胞識別，并將插入順序切除，以形成成熟轉錄本，因此也得不到目的基因的產物多肽或蛋白質。用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法的優(yōu)點是獲得的目的21用PCR方法擴增目的基因片段PCR是聚合酶鏈反應的縮寫.是一種在體外模擬天然DNA復制過程的核酸擴增技術.在有少量DNA模板、引物、四種dNTP、TaqDNA聚合酶、合適的緩沖系統(tǒng)下，通過儀器控制DNA變性、退火及延伸的溫度與時間，來合成新的DNA鏈，新合成的DNA鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。理論上經n次循環(huán)后，DNA鏈可達2n..用PCR方法擴增目的基因片段PCR是聚合酶鏈反應的縮寫.22用PCR方法擴增目的基因片段用PCR方法擴增目的基因片段23克隆載體目的基因若無合適的載體協(xié)助，就很難進入受體細胞；為了保證目的基因能夠繁殖，必需將它與載體連接.理想的載體：1、較小的、能進行復制的分子，具有高拷貝數.2、具有較少的限制酶的切點，最好是單一切割點，以便所要克隆的DNA片段能被插入載體.克隆載體目的基因若無合適的載體協(xié)助，就很難進入受體細胞；24克隆載體3、外源DNA片段插入載體后，不得使載體的復制功能喪失.4、具有某種明顯的標志，例如抗藥性標記，以便利用這些標志篩選陽性克隆.5、攜帶外源DNA的幅度較寬.6、生物防護是安全的.克隆載體3、外源DNA片段插入載體后，不得使載體的復制功能喪25克隆載體pBR322克隆載體pBR32226克隆載體常用的克隆載體有：質粒、噬菌體及病毒.質粒是某些細菌中獨立于染色體外的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA。質粒具有復制能力，它的存在與否一般對細菌的生存沒有決定性影響。λ噬菌體是一種能感染大腸桿菌的病毒，其DNA中的1/3對噬菌體的生長并非絕對需要，因此可被外源性DNA所替代，同時它可在體外包裝成病毒顆粒，高效感染大腸桿菌。克隆容量小于23kb.克隆載體常用的克隆載體有：質粒、噬菌體及病毒.27克隆載體粘性質粒（Cosmid）：是人工構建的、兼具質粒與噬菌體雙重特性的大容量載體?？寺∪萘靠蛇_45kb。酵母人工染色體：20世紀80年代發(fā)展起來的大片段外源基因克隆體系，其克隆容量可達200-1000kb?？寺≥d體粘性質粒（Cosmid）：是人工構建的、兼具質粒與噬28DNA分子的體外重組所謂重組DNA分子就是把外源DNA分子（目的基因）插入到載體中，使兩種DNA分子連接起來.體外DNA分子重組有兩種方法：1、粘性末端連接法.2、平頭末端連接法.DNA分子的體外重組所謂重組DNA分子就是把外源DNA分子（29粘性末端連接法用同一種或兩種限制酶去消化載體和外源DNA分子，可產生相同的粘性末端，這些粘性末端能退火互補，進一步用DNA連接酶將斷端封口，即可獲得重組DNA分子。用同一種限制酶處理外源DNA和載體，重組時可導致外源DNA特別是質粒的自我環(huán)化.用堿性磷酸脂酶（不處理外源DNA分子）處理粘性末端的5‘磷酸基，能促使載體與外源DNA分子連接。重組體每條鏈仍殘留的一個缺口，待進入宿主細胞內可被修復.粘性末端連接法用同一種或兩種限制酶去消化載體和外源DNA分子30磷酸脂酶能防止載體的自我環(huán)化磷酸脂酶能防止載體的自我環(huán)化31用兩種限制酶處理載體也可防止環(huán)化用兩種限制酶處理載體也可防止環(huán)化32鈍性末端連接法用前述的化學合成法、逆轉錄法獲得的DNA或cDNA片斷，以及某些限制酶切生成的DNA片斷，均為鈍性末端，可用T4DNA連接酶連接，也可將其改造成粘性末端再行連接.1、加接頭：這種人工接頭含某種限制酶的單切點，用限制酶消化該接頭可產生粘性末端。2、加尾巴：應用末端轉移酶在載體與外源DNA分子上加上互補的同聚核苷酸，經過退火可使兩者形成重組體.鈍性末端連接法用前述的化學合成法、逆轉錄法獲得的DNA或cD33鈍性末端連接法末端轉移酶處理退火鈍性末端連接法末端轉移酶處理退火34二、重組DNA引入宿主細胞和篩選鑒定重組DNA引入宿主細胞1、轉染：將噬菌體DNA引入宿主細胞的過程.2、轉化：將質?；蛉旧wDNA引入宿主細胞的過程.轉化是否成功取決:1)制備感受態(tài)細胞;2)重組DNA避免受體細胞核酸酶的降解.重組體克隆的篩選與鑒定1、插入滅活法.2、噬菌斑形成篩選法.3、核酸雜交法.二、重組DNA引入宿主細胞和篩選鑒定重組DNA引入宿主細胞35插入滅活法目前使用的質粒載體都有抗藥標記。被轉化的細菌在含有這種（些）抗生素的培養(yǎng)基中能夠生長，而未被轉化的細菌則不能生長或被殺死。然而，當限制酶作用于載體DNA的某一抗藥基因上并在此插入外源DNA時，載體上原有的抗藥基因即被破壞。由此重組體轉化的宿主細胞，則對這個抗生素敏感，這樣便可篩選出轉化菌株。插入滅活法目前使用的質粒載體都有抗藥標記。被轉化的細菌在含有36插入滅活法限制酶切轉化含四環(huán)素TA＋T插入滅活法限制酶切轉化含四環(huán)素TA＋T37三、克隆基因的表達外源基因在大腸桿菌體系中的表達.外源基因在真核細胞體系中的表達.三、克隆基因的表達外源基因在大腸桿菌體系中的表達.38四、基因工程的成就與展望在農業(yè)上的成就與意義；在制藥工業(yè)中的成就與意義；在工業(yè)方面的成就與意義；癌癥的研究與治療；遺傳病的預防與治療.四、基因工程的成就與展望在農業(yè)上的成就與意義；391、蛋白質工程的概念

蛋白質工程是研究蛋白質的結構及結構與功能的關系，然后人為地設計一個新蛋白質，并按這個設計的蛋白質結構去改變其基因結構，從而產生新的蛋白質?；蛘邚牡鞍踪|結構與功能的關系出發(fā)，定向地改造天然蛋白質的結構，特別是對功能基因的修飾，也可以制造新型的蛋白質。（一）、基因定點突變是指將基因的某一個或某些位點進行人工替換或刪除的過程。（二）、蛋白質設計依賴于蛋白質結構測定和分子模型的建立，按照蛋白質構效關系的理論基礎，設計出比天然蛋白質性能優(yōu)越的新型蛋白質。五.蛋白質工程1、蛋白質工程的概念

蛋白質工程是研究蛋白質的結構及結構與功402、蛋白質工程的一般技術

（一）、蛋白質工程的理論設計活性設計：考慮被研究的蛋白質的功能，涉及選擇化學基團及其空間取向。專一性設計：指功能性蛋白質在發(fā)揮其生理功能的時，總是與其他分子發(fā)生專一性相互作用?？蚣茉O計：是指對蛋白質分子的立體設計。（二）、定點突變技術通過刪除或置換DNA片段中的核苷酸，使基因發(fā)生改變，從而產生新的蛋白質。改變DNA核苷酸序列的幾種方法：1.基因的化學合成.2.基因直接修飾法.3.盒式突變技術.2、蛋白質工程的一般技術

（一）、蛋白質工程的理論設計413、蛋白質工程的應用示例

（一）、蛋白質工程酶1.改變酶的催化活性；2.改變酶的底物專一性；3.提高酶的穩(wěn)定性；4.改變酶的反應特性；5.產生新酶.（二）、藥物研制1.B-干擾素2.白細胞介素23.胰島素3、蛋白質工程的應用示例

（一）、蛋白質工程酶42

盡管蛋白質工程的發(fā)展歷史很短，但由于它在理論上對生命科學發(fā)展的貢獻，以及商業(yè)上可能帶來的巨大價值，使得它的發(fā)展異軍突起，迅猛異常?？傊?，由于蛋白質工程能按人的意愿定向地改造蛋白質和酶，必然有著無限廣闊的發(fā)展前景。

盡管蛋白質工程的發(fā)展歷史很短，但由于它在理論上對生命科學發(fā)43思考題1.目的基因獲得的方法有哪些？2.基因工程包括哪些步驟？思考題1.目的基因獲得的方法有哪些？44第十四章基因工程與蛋白質工程一、基因工程的定義及主要內容二、重組DNA分子引入宿主細胞和篩選鑒定三、克隆基因的表達四、基因工程的成就和展望五、蛋白質工程第十四章基因工程與蛋白質工程一、基因工程的定義及主要內容45一、基因工程定義及主要內容基因工程也稱基因重組技術、基因克隆或分子克隆.是指利用DNA重組技術生產或改造生物產品、創(chuàng)建或改良動植物品種以及開發(fā)特殊用途的微生物等.是生物工程的重要內容之一.一、基因工程定義及主要內容基因工程也稱基因重組技術、基因克隆46主要步驟：1.帶有目的基因的DNA片段的獲得；2、構建DNA重組分子；3、重組DNA分子引入宿主細胞和篩選鑒定；4、基因的表達.主要步驟：47基因工程基本程序真核染色體DNA克隆載體（質粒）限制酶切割限制酶切割并分離所需片斷重組載體細菌宿主細胞的轉化細胞分離培養(yǎng)增值基因工程基本程序真核染色體DNA克隆載體限制酶切割限制酶切割48構建DNA重組分子工具酶目的基因的制備克隆載體DNA分子的體外重組構建DNA重組分子工具酶49工具酶限制性內切酶是基因工程中最主要的工具酶DNA連接酶（DNAligase）、DNA聚合酶Ⅰ（DNApolymeraseⅠ）、末端轉移酶（terminaltransferase）、逆轉錄酶（reversetranscriptase）、核酸酶S1（nucleaseS1）和核酸外切酶Ⅶ（exonucleaseⅦ）工具酶限制性內切酶是基因工程中最主要的工具酶50限制性核酸內切酶由Smith在1970年從流感噬血菌中發(fā)現.細菌體內有特異的限制修飾系統(tǒng)，這種修飾系統(tǒng)是通過特殊的修飾酶在細菌本身DNA的特異識別序列處進行甲基化修飾，從而與外源DNA相區(qū)別。這樣，限制性核酸內切酶就能去切割破壞外源DNA，而對本身無影響。目前已從原核生物中分離出400～500多種限制性核酸內切酶.限制性核酸內切酶由Smith在1970年從流感噬血菌中發(fā)現.51限制性核酸內切酶能識別DNA特定核苷酸序列的核酸內切酶分類:三類.命名:EcoRI分布：主要來源于原核生物。特點：特異性，即識別特定核苷酸序列，切割特定切點。結果：產生黏性未端（堿基互補配對）或平端。舉例：大腸桿菌的一種限制酶能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。限制性核酸內切酶能識別DNA特定核苷酸序列的核酸內切酶分類:52限制性核酸內切酶限制性內切酶可識別4或6個特異核苷酸序列.粘性末端：指限制性內切酶的切割部位不在識別序列的中心軸，在斷段產生一個短的單股突伸出來的不齊末端。鈍性末端：指限制性內切酶的切割部位在識別序列的中心軸處，即產生平齊末端。限制性核酸內切酶限制性內切酶可識別4或6個特異核苷酸序列.53限制性核酸內切酶同裂酶:來源不同,但有相同的識別序列.或稱異源同工酶.同切點酶:不僅識別序列相同,而且切點也相同.同尾酶:酶的識別序列不完全相同,但切出的粘性末端相同.限制性核酸內切酶同裂酶:來源不同,但有相同的識別序列.或稱異54幾種限制性內切酶的作用位點幾種限制性內切酶的作用位點55幾種限制性內切酶的作用位點幾種限制性內切酶的作用位點56目的基因的制備目的基因就是所需要克隆的外源基因.制備方法：1、人工合成法.2、逆轉錄法.3、用限制性內切酶直接從染色體DNA中分離.4、用PCR法擴增目的基因片段.目的基因的制備目的基因就是所需要克隆的外源基因.57目的基因的制備：人工合成法較小分子基因可用人工化學合成的方法獲得.DNA化學人工合成的方法已經自動化.人工合成目的基因的先決條件：基因的核苷酸序列是已知的.缺點是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因時遺傳密碼的兼并現象會為選擇密碼帶來很大困難；3、費用較高目的基因的制備：人工合成法較小分子基因可用人工化學合成的方法58目的基因的制備：逆轉錄法若所需基因較大，人工合成有困難，從組織中分離提取也不容易，則可利用逆轉錄法合成。該法是：以編碼某特異多肽的mRNA為模板，在逆轉錄酶的作用下反轉錄成該多肽mRNA的互補DNA（cDNA）；再以cDNA為模板，在DNA聚合酶I作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA（dsDNA）?？捎糜谡婧松锬康幕虻墨@得.目的基因的制備：逆轉錄法若所需基因較大，人工合成有困難，從組59目的基因的制備：逆轉錄法目的基因的制備：逆轉錄法60第十四章基因工程與蛋白質工程課件61目的基因的制備：逆轉錄法用逆轉錄法合成cDNA的主要問題是：1、mRNA必需提得很純.2、逆轉錄中常產生各種不完全的逆轉錄產物.3、以單鏈cDNA為模板往往難以合成與單鏈cDNA一樣長的ds－cDNA，這與實驗技術有關。目的基因的制備：逆轉錄法用逆轉錄法合成cDNA的主要問題是：62用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法主要適用于制備原核基因.對于物理圖譜已清楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出來.鳥槍法：指把目的基因從已用限制酶降解的染色體片段群中分離純化出的方法，即把包括目的基因在內的全部DNA片段插入到載體DNA（如pBR322）中，轉化大腸桿菌，做成基因文庫。再用目的基因的轉錄產物作探針，通過分子雜交，選擇出含有所需基因的DNA片段。用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法主要適用于制備原核63

基因文庫的構建

將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質?；蚴删w載體上，轉化大腸桿菌,便構成了該生物的基因文庫?；蛭膸斓臉嫿?4用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法的優(yōu)點是獲得的目的基因的組織結構與天然基因一樣，也具有間隔順序。此方法的缺點是：由于含有插入順序，原始轉錄本不能被原核細胞識別，并將插入順序切除，以形成成熟轉錄本，因此也得不到目的基因的產物多肽或蛋白質。用限制酶切法直接從染色體DNA中分離此方法的優(yōu)點是獲得的目的65用PCR方法擴增目的基因片段PCR是聚合酶鏈反應的縮寫.是一種在體外模擬天然DNA復制過程的核酸擴增技術.在有少量DNA模板、引物、四種dNTP、TaqDNA聚合酶、合適的緩沖系統(tǒng)下，通過儀器控制DNA變性、退火及延伸的溫度與時間，來合成新的DNA鏈，新合成的DNA鏈又可作為下一輪循環(huán)的模板。理論上經n次循環(huán)后，DNA鏈可達2n..用PCR方法擴增目的基因片段PCR是聚合酶鏈反應的縮寫.66用PCR方法擴增目的基因片段用PCR方法擴增目的基因片段67克隆載體目的基因若無合適的載體協(xié)助，就很難進入受體細胞；為了保證目的基因能夠繁殖，必需將它與載體連接.理想的載體：1、較小的、能進行復制的分子，具有高拷貝數.2、具有較少的限制酶的切點，最好是單一切割點，以便所要克隆的DNA片段能被插入載體.克隆載體目的基因若無合適的載體協(xié)助，就很難進入受體細胞；68克隆載體3、外源DNA片段插入載體后，不得使載體的復制功能喪失.4、具有某種明顯的標志，例如抗藥性標記，以便利用這些標志篩選陽性克隆.5、攜帶外源DNA的幅度較寬.6、生物防護是安全的.克隆載體3、外源DNA片段插入載體后，不得使載體的復制功能喪69克隆載體pBR322克隆載體pBR32270克隆載體常用的克隆載體有：質粒、噬菌體及病毒.質粒是某些細菌中獨立于染色體外的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA。質粒具有復制能力，它的存在與否一般對細菌的生存沒有決定性影響。λ噬菌體是一種能感染大腸桿菌的病毒，其DNA中的1/3對噬菌體的生長并非絕對需要，因此可被外源性DNA所替代，同時它可在體外包裝成病毒顆粒，高效感染大腸桿菌?？寺∪萘啃∮?3kb.克隆載體常用的克隆載體有：質粒、噬菌體及病毒.71克隆載體粘性質粒（Cosmid）：是人工構建的、兼具質粒與噬菌體雙重特性的大容量載體。克隆容量可達45kb。酵母人工染色體：20世紀80年代發(fā)展起來的大片段外源基因克隆體系，其克隆容量可達200-1000kb?？寺≥d體粘性質粒（Cosmid）：是人工構建的、兼具質粒與噬72DNA分子的體外重組所謂重組DNA分子就是把外源DNA分子（目的基因）插入到載體中，使兩種DNA分子連接起來.體外DNA分子重組有兩種方法：1、粘性末端連接法.2、平頭末端連接法.DNA分子的體外重組所謂重組DNA分子就是把外源DNA分子（73粘性末端連接法用同一種或兩種限制酶去消化載體和外源DNA分子，可產生相同的粘性末端，這些粘性末端能退火互補，進一步用DNA連接酶將斷端封口，即可獲得重組DNA分子。用同一種限制酶處理外源DNA和載體，重組時可導致外源DNA特別是質粒的自我環(huán)化.用堿性磷酸脂酶（不處理外源DNA分子）處理粘性末端的5‘磷酸基，能促使載體與外源DNA分子連接。重組體每條鏈仍殘留的一個缺口，待進入宿主細胞內可被修復.粘性末端連接法用同一種或兩種限制酶去消化載體和外源DNA分子74磷酸脂酶能防止載體的自我環(huán)化磷酸脂酶能防止載體的自我環(huán)化75用兩種限制酶處理載體也可防止環(huán)化用兩種限制酶處理載體也可防止環(huán)化76鈍性末端連接法用前述的化學合成法、逆轉錄法獲得的DNA或cDNA片斷，以及某些限制酶切生成的DNA片斷，均為鈍性末端，可用T4DNA連接酶連接，也可將其改造成粘性末端再行連接.1、加接頭：這種人工接頭含某種限制酶的單切點，用限制酶消化該接頭可產生粘性末端。2、加尾巴：應用末端轉移酶在載體與外源DNA分子上加上互補的同聚核苷酸，經過退火可使兩者形成重組體.鈍性末端連接法用前述的化學合成法、逆轉錄法獲得的DNA或cD77鈍性末端連接法末端轉移酶處理退火鈍性末端連接法末端轉移酶處理退火78二、重組DNA引入宿主細胞和篩選鑒定重組DNA引入宿主細胞1、轉染：將噬菌體DNA引入宿主細胞的過程.2、轉化：將質粒或染色體DNA引入宿主細胞的過程.轉化是否成功取決:1)制備感受態(tài)細胞;2)重組DNA避免受體細胞核酸酶的降解.重組體克隆的篩選與鑒定1、插入滅活法.2、噬菌斑形成篩選法.3、核酸雜交法.二、重組DNA引入宿主細胞和篩選鑒定重組DNA引入宿主細胞79插入滅活法目前使用的質粒載體都有抗藥標記。被轉化的細菌在含有這種（些）抗生素的培養(yǎng)基中能夠生長，而未被轉化的細菌則不能生長或被殺死。然而，當限制酶作用于載體DNA的某一抗藥基因上并在此插入外源DNA時，載體上原有的抗藥基因即被破壞。由此重組體轉化的宿主細胞，則對這個抗生素敏感，這樣便可篩選出轉化菌株。插入滅活法目前使用的質粒載體都有抗藥標記。被轉化的細菌在含有80插入滅活法限制酶切