微生物生態(tài)學(xué)農(nóng)藥污染土壤的微生物分子生態(tài)效應(yīng)課件

農(nóng)藥污染土壤的

微生物分子生態(tài)學(xué)效應(yīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室農(nóng)藥污染土壤的

微生物分子生態(tài)學(xué)效應(yīng)1近年來(lái)，化學(xué)合成工業(yè)的發(fā)展給環(huán)境帶來(lái)了大量異生物質(zhì)（xanobiotics），導(dǎo)致環(huán)境污染日益嚴(yán)重、生態(tài)破壞不斷加劇。研究生物系統(tǒng)與被污染的環(huán)境系統(tǒng)之間的相互作用規(guī)律及采用生態(tài)學(xué)原理和方法對(duì)污染環(huán)境進(jìn)行控制和修復(fù)研究成為目前研究的熱點(diǎn)?；瘜W(xué)農(nóng)藥是一類重要的環(huán)境污染物，其土壤環(huán)境的污染與效應(yīng)引起了廣泛的重視。近年來(lái)，化學(xué)合成工業(yè)的發(fā)展給環(huán)境帶來(lái)了大量異生物質(zhì)（2被污染的環(huán)境系統(tǒng)與生物系統(tǒng)之間的相互作用是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其變化能否成為評(píng)價(jià)土壤污染的分子指標(biāo)之一？被污染的環(huán)境系統(tǒng)與生物系統(tǒng)之間的相互作用是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程3農(nóng)藥（甲基對(duì)硫磷）長(zhǎng)期污染對(duì)土壤微生物的影響對(duì)照土壤樣品：未污染土壤污染土壤樣品：受甲基對(duì)硫磷20多年污染的土壤實(shí)驗(yàn)材料（土壤）：農(nóng)藥（甲基對(duì)硫磷）長(zhǎng)期污染對(duì)土壤微生物的影響對(duì)照土壤樣品：4基于常規(guī)方法的分析研究：1、三大菌群數(shù)量基于常規(guī)方法的分析研究：1、三大菌群數(shù)量5個(gè)/g.干土

2、對(duì)生理功能群的影響（MPN法計(jì)數(shù)）×107

×106

×103

×101

×103

個(gè)/g.干土2、對(duì)生理功能群的影響（MPN法計(jì)數(shù)）×1076土壤土壤微生物活性呼吸作用CO2量ml/100g干土氨化作用

10ml培養(yǎng)液增加銨量mg硝化作用強(qiáng)度（%）對(duì)照土壤5.58±0.5448.61±8.991.42污染土壤3.91±0.8463.37±8.6889.993、對(duì)土壤微生物活性的影響土壤微生物活性呼吸7基于16SrDNA方法評(píng)價(jià)土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的變化對(duì)照土壤和污染土壤16SrDNA文庫(kù)的構(gòu)建構(gòu)建路線兩種土壤總DNA的提取純化細(xì)菌混合16SrDNA的PCR擴(kuò)增T-VECTORT/A克隆轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白斑轉(zhuǎn)化子保存基于16SrDNA方法評(píng)價(jià)對(duì)照土壤和污染土壤16SrDN816SrDNA文庫(kù)克隆插入片段的RFLP分析限制性內(nèi)切酶：HhaⅠ：GCG’C

RsaⅠ：GT’AC

16SrDNA文庫(kù)克隆插入片段的RFLP分析限制性內(nèi)切酶9CloneofuniquephylotypeTotalphylotypesUniquephylotypesTotalclonescommonphylotypesCloneofcommonphylotypesrarephylotypes74.36%72.50%69.42%67.22%25.64%27.49%30.58%32.78%81.73%71.13%CloneofuniquephylotypeTotal10甲基對(duì)硫磷長(zhǎng)期污染對(duì)細(xì)菌遺傳多樣性的影響

土壤多樣性參數(shù)豐富度（d）香農(nóng)-威納指數(shù)（H）均勻度（E）辛普森指數(shù)(D)對(duì)照土壤51.9298.1420.9830.995污染土壤47.9367.8110.9430.951甲基對(duì)硫磷長(zhǎng)期污染會(huì)造成土壤微生物多樣性下降甲基對(duì)硫磷長(zhǎng)期污染對(duì)細(xì)菌遺傳多樣性的影響土壤11污染土壤中優(yōu)勢(shì)類群的分類地位污染土壤中優(yōu)勢(shì)類群的分類地位12常規(guī)分析技術(shù)與基于16SrDNA的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果趨于一致，越來(lái)越多的證據(jù)顯示該方法可以成為土壤污染的分子判別的指標(biāo)之一。常規(guī)分析技術(shù)與基于16SrDNA的土壤微生物13污染土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離與多樣性研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離mp-1Pseudaminobactermp-2Alcaligenesmp-3Ochrobactrummp-4Ochrobactrummp-5Ochrobactrummp-6Ochrobactrummp-7Brucella污染土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離與多樣性研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌14有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的培養(yǎng)特征形態(tài)特征菌株mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7菌體形狀桿狀桿狀桿狀桿狀桿狀桿狀短桿狀大小(長(zhǎng)×寬um)1.39×0.521.84×0.891.63×0.821.58×0.791.55×0.871.47×0.741.39×0.53菌落顏色微黃色乳白乳白乳白乳白乳白乳白菌落形狀圓形圓形圓形圓形圓形圓形圓形菌落邊緣整齊整齊整齊整齊整齊整齊整齊鞭毛周生一根端生周生周生周生周生周生運(yùn)動(dòng)性運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的培養(yǎng)特征形態(tài)特征菌株mp-1mp-2mp-15降解菌的生理生化特征生化特征菌株編號(hào)mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7革蘭氏染色陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性氧化酶陽(yáng)性弱陽(yáng)性陽(yáng)性弱陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性接觸酶陽(yáng)性陽(yáng)性弱陽(yáng)性弱陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性乙醇氧化陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性淀粉水解陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性葡萄糖氧化產(chǎn)酸不氧化產(chǎn)酸產(chǎn)酸產(chǎn)酸產(chǎn)酸產(chǎn)酸葡萄糖發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵石蕊牛乳反應(yīng)凝乳酶凝固胨化酸凝固酸凝固胨化胨化胨化V.P反應(yīng)陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性吲哚反應(yīng)陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性降解菌的生理生化特征生化特征菌株編號(hào)mp-1mp-2mp-316菌株mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7mp-1100mp-277.36100mp-393.4876.54100mp-493.3976.4099.58100mp-593.4177.3598.0298.24100mp-693.3377.1597.9598.1799.79100mp-793.4876.3198.5298.6797.4597.37100降解菌16SrDNA序列的相似性距陣菌株mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-17有機(jī)磷農(nóng)藥菌株編號(hào)mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7甲基對(duì)硫磷+++++++乙基對(duì)硫磷+++++++辛硫磷+++++++三唑磷---+---吡蟲磷-------甲基異柳磷-------毒死蜱+++++++降解菌對(duì)有機(jī)磷化學(xué)農(nóng)藥的降解譜

mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7++18芳香族化合物底物菌株編號(hào)mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7對(duì)硝基酚+++++++鄰硝基酚-------鄰苯二酚-------對(duì)苯二酚-++++++間苯二酚-------鄰氨基苯酚-------間硝基苯酚-------2.4-二硝基苯酚-------4-硝基兒茶酚+--+---降解菌對(duì)芳香族化合物的降解

芳香族化合物mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-619有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的ERIC-PCR圖譜

有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的ERIC-PCR圖譜20然而，SouthernBlot證明這些降解菌水解酶基因卻很保守這些降解菌在形態(tài)、生理生化特征、降解譜、16SrDNA相似性、ERIC指紋圖譜等方面存在廣泛的多樣性。然而，SouthernBlot證明這些降解菌水解酶基因卻21降解菌多樣性降解基因的保守性Anyrelationship?降解基因是通過(guò)水平轉(zhuǎn)移而來(lái)？基因水平轉(zhuǎn)移是降解基因分布在不同種群中的分子機(jī)制？降解基因的水平轉(zhuǎn)移是微生物適應(yīng)污染生態(tài)的機(jī)理之一？降解菌多樣性降解基因的保守性Anyrelationship22（1）進(jìn)化上相近的降解基因（簇）從地理位置上很遠(yuǎn)的細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)；（2）同一污染物不同菌株降解基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與宿主菌16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系不一致；（3）降解有機(jī)污染物的基因與自轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子等MGEs相連；（4）降解基因（簇）G+C%含量與宿主菌的明顯不同，一般也認(rèn)為降解基因是通過(guò)水平轉(zhuǎn)移獲得的。

基因水平轉(zhuǎn)移的證據(jù)：（1）進(jìn)化上相近的降解基因（簇）從地理位置上很遠(yuǎn)的細(xì)菌中被發(fā)23

通過(guò)鳥槍法建庫(kù)克隆了菌株的降解基因，獲得了大片段的包含降解基因上下游序列在內(nèi)的全部基因信息通過(guò)鳥槍法建庫(kù)克隆了菌株的降解基因，24邏輯證據(jù)——降解菌16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹與降解菌水解酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的一致性比較基于16SrDNA序列基于有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶基因序列進(jìn)化關(guān)系不一致邏輯證據(jù)——基于16SrDNA序列基于有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶基因251291bp分子基礎(chǔ)證據(jù)——降解代謝轉(zhuǎn)座子（catabolictransposon）的克隆與分析1291bp分子基礎(chǔ)證據(jù)——26TnpAIRLIRR轉(zhuǎn)座子插入序列IS6100結(jié)構(gòu)示意圖IRR：TTTGCAACAGAGCC

IRL：GGCTCTGTTGCAAA

TnpAIRLIRR轉(zhuǎn)座子插入序列IS6100結(jié)構(gòu)示意圖IR271、污染環(huán)境中的水平基因轉(zhuǎn)移在代謝轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)散以及新的代謝途徑形成中發(fā)揮著重要的作用，使細(xì)菌群落能更快的適應(yīng)污染環(huán)境。2、降解基因水平轉(zhuǎn)移的另一個(gè)重要作用是有力的促進(jìn)了一些生境中污染物的降解。攜帶污染物代謝轉(zhuǎn)座子的宿主菌接種至污染環(huán)境中，代謝轉(zhuǎn)座子可以向土著微生物轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)微生物修復(fù)農(nóng)藥殘留面源污染的效果。

降解基因水平轉(zhuǎn)移在污染環(huán)境中功能與作用：1、污染環(huán)境中的水平基因轉(zhuǎn)移在代謝轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)散以及新的28ThankYouThankYou29農(nóng)藥污染土壤的

微生物分子生態(tài)學(xué)效應(yīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物工程重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室農(nóng)藥污染土壤的

微生物分子生態(tài)學(xué)效應(yīng)30近年來(lái)，化學(xué)合成工業(yè)的發(fā)展給環(huán)境帶來(lái)了大量異生物質(zhì)（xanobiotics），導(dǎo)致環(huán)境污染日益嚴(yán)重、生態(tài)破壞不斷加劇。研究生物系統(tǒng)與被污染的環(huán)境系統(tǒng)之間的相互作用規(guī)律及采用生態(tài)學(xué)原理和方法對(duì)污染環(huán)境進(jìn)行控制和修復(fù)研究成為目前研究的熱點(diǎn)?；瘜W(xué)農(nóng)藥是一類重要的環(huán)境污染物，其土壤環(huán)境的污染與效應(yīng)引起了廣泛的重視。近年來(lái)，化學(xué)合成工業(yè)的發(fā)展給環(huán)境帶來(lái)了大量異生物質(zhì)（31被污染的環(huán)境系統(tǒng)與生物系統(tǒng)之間的相互作用是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其變化能否成為評(píng)價(jià)土壤污染的分子指標(biāo)之一？被污染的環(huán)境系統(tǒng)與生物系統(tǒng)之間的相互作用是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程32農(nóng)藥（甲基對(duì)硫磷）長(zhǎng)期污染對(duì)土壤微生物的影響對(duì)照土壤樣品：未污染土壤污染土壤樣品：受甲基對(duì)硫磷20多年污染的土壤實(shí)驗(yàn)材料（土壤）：農(nóng)藥（甲基對(duì)硫磷）長(zhǎng)期污染對(duì)土壤微生物的影響對(duì)照土壤樣品：33基于常規(guī)方法的分析研究：1、三大菌群數(shù)量基于常規(guī)方法的分析研究：1、三大菌群數(shù)量34個(gè)/g.干土

2、對(duì)生理功能群的影響（MPN法計(jì)數(shù)）×107

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個(gè)/g.干土2、對(duì)生理功能群的影響（MPN法計(jì)數(shù)）×10735土壤土壤微生物活性呼吸作用CO2量ml/100g干土氨化作用

10ml培養(yǎng)液增加銨量mg硝化作用強(qiáng)度（%）對(duì)照土壤5.58±0.5448.61±8.991.42污染土壤3.91±0.8463.37±8.6889.993、對(duì)土壤微生物活性的影響土壤微生物活性呼吸36基于16SrDNA方法評(píng)價(jià)土壤微生物種群結(jié)構(gòu)的變化對(duì)照土壤和污染土壤16SrDNA文庫(kù)的構(gòu)建構(gòu)建路線兩種土壤總DNA的提取純化細(xì)菌混合16SrDNA的PCR擴(kuò)增T-VECTORT/A克隆轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取白斑轉(zhuǎn)化子保存基于16SrDNA方法評(píng)價(jià)對(duì)照土壤和污染土壤16SrDN3716SrDNA文庫(kù)克隆插入片段的RFLP分析限制性內(nèi)切酶：HhaⅠ：GCG’C

RsaⅠ：GT’AC

16SrDNA文庫(kù)克隆插入片段的RFLP分析限制性內(nèi)切酶38CloneofuniquephylotypeTotalphylotypesUniquephylotypesTotalclonescommonphylotypesCloneofcommonphylotypesrarephylotypes74.36%72.50%69.42%67.22%25.64%27.49%30.58%32.78%81.73%71.13%CloneofuniquephylotypeTotal39甲基對(duì)硫磷長(zhǎng)期污染對(duì)細(xì)菌遺傳多樣性的影響

土壤多樣性參數(shù)豐富度（d）香農(nóng)-威納指數(shù)（H）均勻度（E）辛普森指數(shù)(D)對(duì)照土壤51.9298.1420.9830.995污染土壤47.9367.8110.9430.951甲基對(duì)硫磷長(zhǎng)期污染會(huì)造成土壤微生物多樣性下降甲基對(duì)硫磷長(zhǎng)期污染對(duì)細(xì)菌遺傳多樣性的影響土壤40污染土壤中優(yōu)勢(shì)類群的分類地位污染土壤中優(yōu)勢(shì)類群的分類地位41常規(guī)分析技術(shù)與基于16SrDNA的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果趨于一致，越來(lái)越多的證據(jù)顯示該方法可以成為土壤污染的分子判別的指標(biāo)之一。常規(guī)分析技術(shù)與基于16SrDNA的土壤微生物42污染土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離與多樣性研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離mp-1Pseudaminobactermp-2Alcaligenesmp-3Ochrobactrummp-4Ochrobactrummp-5Ochrobactrummp-6Ochrobactrummp-7Brucella污染土壤中有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離與多樣性研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌43有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的培養(yǎng)特征形態(tài)特征菌株mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7菌體形狀桿狀桿狀桿狀桿狀桿狀桿狀短桿狀大小(長(zhǎng)×寬um)1.39×0.521.84×0.891.63×0.821.58×0.791.55×0.871.47×0.741.39×0.53菌落顏色微黃色乳白乳白乳白乳白乳白乳白菌落形狀圓形圓形圓形圓形圓形圓形圓形菌落邊緣整齊整齊整齊整齊整齊整齊整齊鞭毛周生一根端生周生周生周生周生周生運(yùn)動(dòng)性運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)運(yùn)動(dòng)有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的培養(yǎng)特征形態(tài)特征菌株mp-1mp-2mp-44降解菌的生理生化特征生化特征菌株編號(hào)mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7革蘭氏染色陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性氧化酶陽(yáng)性弱陽(yáng)性陽(yáng)性弱陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性接觸酶陽(yáng)性陽(yáng)性弱陽(yáng)性弱陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性乙醇氧化陰性陰性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性淀粉水解陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性葡萄糖氧化產(chǎn)酸不氧化產(chǎn)酸產(chǎn)酸產(chǎn)酸產(chǎn)酸產(chǎn)酸葡萄糖發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵不發(fā)酵石蕊牛乳反應(yīng)凝乳酶凝固胨化酸凝固酸凝固胨化胨化胨化V.P反應(yīng)陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性陽(yáng)性吲哚反應(yīng)陰性陰性陰性陰性陰性陰性陰性降解菌的生理生化特征生化特征菌株編號(hào)mp-1mp-2mp-345菌株mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7mp-1100mp-277.36100mp-393.4876.54100mp-493.3976.4099.58100mp-593.4177.3598.0298.24100mp-693.3377.1597.9598.1799.79100mp-793.4876.3198.5298.6797.4597.37100降解菌16SrDNA序列的相似性距陣菌株mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-46有機(jī)磷農(nóng)藥菌株編號(hào)mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7甲基對(duì)硫磷+++++++乙基對(duì)硫磷+++++++辛硫磷+++++++三唑磷---+---吡蟲磷-------甲基異柳磷-------毒死蜱+++++++降解菌對(duì)有機(jī)磷化學(xué)農(nóng)藥的降解譜

mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7++47芳香族化合物底物菌株編號(hào)mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-6mp-7對(duì)硝基酚+++++++鄰硝基酚-------鄰苯二酚-------對(duì)苯二酚-++++++間苯二酚-------鄰氨基苯酚-------間硝基苯酚-------2.4-二硝基苯酚-------4-硝基兒茶酚+--+---降解菌對(duì)芳香族化合物的降解

芳香族化合物mp-1mp-2mp-3mp-4mp-5mp-648有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的ERIC-PCR圖譜

有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的ERIC-PCR圖譜49然而，SouthernBlot證明這些降解菌水解酶基因卻很保守這些降解菌在形態(tài)、生理生化特征、降解譜、16SrDNA相似性、ERIC指紋圖譜等方面存在廣泛的多樣性。然而，SouthernBlot證明這些降解菌水解酶基因卻50降解菌多樣性降解基因的保守性Anyrelationship?降解基因是通過(guò)水平轉(zhuǎn)移而來(lái)？基因水平轉(zhuǎn)移是降解基因分布在不同種群中的