紫外-可見分光光度法課件

紫外—可見分光光度法紫外—可見分光光度法1目錄紫外可見光譜學(xué)原理和應(yīng)用儀器樣品處理及測定方法二極管分光光度計的特性目錄紫外可見光譜學(xué)原理和應(yīng)用21.基本原理電磁波譜：無線電波、紅外線、宇宙射線、x射線、紫外線、可見光波長范圍：200-800nm波長和頻率：E=hνν=c/λλ越短，E越高短波長的紫外光能量高，這種成份導(dǎo)致了皮膚曬黑。1.基本原理電磁波譜：無線電波、紅外線、宇宙射線、x射線、紫3紫外—可見光譜的來源：輻射作用于物質(zhì)，發(fā)生反射、散射、吸收、熒光、磷光、光化學(xué)反應(yīng)。通常測量紫外—可見光譜時我們希望只發(fā)生吸收。分子內(nèi)電子躍遷導(dǎo)致譜帶變寬，產(chǎn)生吸收光譜適用含量范圍:10-5%～50%紫外—可見光譜的來源：適用含量范圍:10-5%～50%42.定性分析：

鑒定譜圖和結(jié)構(gòu)同一性的認證

顏色

其他定性信息

蛋白質(zhì)的熔點測定

酶活性

2.定性分析：鑒定譜圖和結(jié)構(gòu)53.定量分析：

朗伯—比爾定律：

A=εb

c(ε為摩爾吸光系數(shù))多組分的分析

疊加性原理：一種混合物在任何波長下的吸光率等與混合物中各組分在該波長下的A之和。

濃溶液的不適用性

化學(xué)偏離與儀器偏離幾乎所有金屬元素的定量分析>0.01mol/L時,粒子相互影響電荷分別改變.ε也改變.濃電解質(zhì)中有類似效應(yīng).化學(xué):締合,離解,溶劑化,PH變化等儀器:單色光不純.

峰值處測量可改善3.定量分析：朗伯—比爾定律：幾乎所有金屬元素的定量分6該方法能分析復(fù)雜的混合物和圖譜相似的簡單混合物。用最小二乘法計算的偏差表明了標準光譜和樣品光譜的擬合程度，同時也說明了分析結(jié)果的準確性。簡單聯(lián)立方程式最小二乘法偏最小二乘法（PLS）,關(guān)鍵組分的回歸法（PCR）,多重最小二乘法（MLS）多組分分析方法該方法能分析復(fù)雜的混合物和圖譜相似的簡單混合物。簡單聯(lián)立方程74.間接測量：

化學(xué)衍生法分光廣度滴定酶動力學(xué)分析4.間接測量：化學(xué)衍生法81.儀器設(shè)計分光光度計的組成產(chǎn)生一定光譜寬度的電磁輻射光源色散裝置：從光源發(fā)射寬的電磁波中選擇特定的波長樣品區(qū)域檢測器:測量輻射強度1.儀器設(shè)計分光光度計的組成9傳統(tǒng)的分光光度計

適用于測量光譜中單點吸光度傳統(tǒng)的分光光度計

適用于測量光譜中單點吸光度10二極管陣列分光光度計

比較：樣品和色散元件的相對位置次序相反，稱為反向光路

二極管陣列分光光度計

比較：樣品和色散元件的相對位置次序相反11按構(gòu)型分單光束設(shè)計：提供高的光通量，靈敏度高；但光源漂移產(chǎn)生較大誤差雙光束設(shè)計：矯正漂移。斬光器以一定速度旋轉(zhuǎn)，使空白和樣品的交替測量每秒進行數(shù)次。缺點，降低了光的能量和靈敏度分光束設(shè)計：分裂器將光分成兩束，同時穿過參比和空白，到達兩個分開但一樣的檢測器，可同時測定樣品和空白

雙波長設(shè)計：同時測定兩個波長，如樣品中兩個同時發(fā)生的反應(yīng)按構(gòu)型分單光束設(shè)計：提供高的光通量，靈敏度高；但光源12紫外—可見分光光度法課件13紫外—可見分光光度法課件142.主要儀器參數(shù)（可能影響吸光度測量值準確度及精確度的一些儀器參數(shù)）光譜分辨率波長準確度及精確度線性動態(tài)范圍漂移SBW/NBW≤0.12.主要儀器參數(shù)（可能影響吸光度測量值準確度及精確度的一些儀15影響測光準確度和精確度的因素：

雜散光和噪聲

雜散光：檢測到選定波長帶寬以外的任何波長光。

T=(I+Is)/(I0+Is)噪聲光子噪聲：在測量低濃度低吸光率樣品時，影響精確測量兩束高強度的光之間的微小差別。電子噪聲：是固有的，與測定的光強度無關(guān)。在高吸光度樣品的信號很小時影響大

影響測光準確度和精確度的因素：

雜散光和噪聲

雜散光：檢測到16

液體樣品固體樣品弱吸收強吸收干擾光化學(xué)問題液體樣品17動力學(xué)光譜法固相光譜法多元校正—多組分測定導(dǎo)數(shù)光譜法動力學(xué)光譜法導(dǎo)數(shù)光譜法18Beer定律：A=abc一階導(dǎo)數(shù)：如果控制I0不變，則,而結(jié)論：A’信號也正比于c，在原拐點處靈敏度最大高階導(dǎo)數(shù)光譜同樣適用Beer定律：A=abc一階導(dǎo)數(shù)：如果控制I0不變，則19導(dǎo)數(shù)光譜的特點：

隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加，峰越來越尖銳，靈敏度提高信噪比隨導(dǎo)數(shù)的階數(shù)增加而降低原譜一階導(dǎo)數(shù)二階導(dǎo)數(shù)導(dǎo)數(shù)光譜的特點：隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加，峰越來越尖銳，靈敏度20二極管陣列分光光度計的特點二極管陣列光譜學(xué)的優(yōu)點二極管陣列光譜學(xué)的缺點快速采集，多波長同時測定，靈敏度高，有統(tǒng)計學(xué)意義，很高的穩(wěn)定性和可靠性，敞開式的樣品室分辨率較低，散射光嚴重，樣品會分解二極管陣列分光光度計的特點二極管陣列光譜學(xué)的優(yōu)點快速采21參考文獻：

Tonyowen著,現(xiàn)代紫外—可見光譜學(xué)基礎(chǔ)，1997，12-5965-5123E

張劍榮，戚苓,方惠群編，儀器分析試驗，科學(xué)出版社，1999

曾永昌，向立人，周在德編，儀器分析，四川大學(xué)出版社，1992

G.W.尤因著，華東化工學(xué)院分析化學(xué)教研組譯，化學(xué)分析的儀器方法，1986

羅國安，邱家學(xué)，王義明編，可見紫外定量分析及微機應(yīng)用，上?？茖W(xué)技術(shù)文獻出版社，1988參考文獻：

Tonyowen著,現(xiàn)代紫外—可見光譜學(xué)基22謝謝大家謝謝大家23紫外—可見分光光度法紫外—可見分光光度法24目錄紫外可見光譜學(xué)原理和應(yīng)用儀器樣品處理及測定方法二極管分光光度計的特性目錄紫外可見光譜學(xué)原理和應(yīng)用251.基本原理電磁波譜：無線電波、紅外線、宇宙射線、x射線、紫外線、可見光波長范圍：200-800nm波長和頻率：E=hνν=c/λλ越短，E越高短波長的紫外光能量高，這種成份導(dǎo)致了皮膚曬黑。1.基本原理電磁波譜：無線電波、紅外線、宇宙射線、x射線、紫26紫外—可見光譜的來源：輻射作用于物質(zhì)，發(fā)生反射、散射、吸收、熒光、磷光、光化學(xué)反應(yīng)。通常測量紫外—可見光譜時我們希望只發(fā)生吸收。分子內(nèi)電子躍遷導(dǎo)致譜帶變寬，產(chǎn)生吸收光譜適用含量范圍:10-5%～50%紫外—可見光譜的來源：適用含量范圍:10-5%～50%272.定性分析：

鑒定譜圖和結(jié)構(gòu)同一性的認證

顏色

其他定性信息

蛋白質(zhì)的熔點測定

酶活性

2.定性分析：鑒定譜圖和結(jié)構(gòu)283.定量分析：

朗伯—比爾定律：

A=εb

c(ε為摩爾吸光系數(shù))多組分的分析

疊加性原理：一種混合物在任何波長下的吸光率等與混合物中各組分在該波長下的A之和。

濃溶液的不適用性

化學(xué)偏離與儀器偏離幾乎所有金屬元素的定量分析>0.01mol/L時,粒子相互影響電荷分別改變.ε也改變.濃電解質(zhì)中有類似效應(yīng).化學(xué):締合,離解,溶劑化,PH變化等儀器:單色光不純.

峰值處測量可改善3.定量分析：朗伯—比爾定律：幾乎所有金屬元素的定量分29該方法能分析復(fù)雜的混合物和圖譜相似的簡單混合物。用最小二乘法計算的偏差表明了標準光譜和樣品光譜的擬合程度，同時也說明了分析結(jié)果的準確性。簡單聯(lián)立方程式最小二乘法偏最小二乘法（PLS）,關(guān)鍵組分的回歸法（PCR）,多重最小二乘法（MLS）多組分分析方法該方法能分析復(fù)雜的混合物和圖譜相似的簡單混合物。簡單聯(lián)立方程304.間接測量：

化學(xué)衍生法分光廣度滴定酶動力學(xué)分析4.間接測量：化學(xué)衍生法311.儀器設(shè)計分光光度計的組成產(chǎn)生一定光譜寬度的電磁輻射光源色散裝置：從光源發(fā)射寬的電磁波中選擇特定的波長樣品區(qū)域檢測器:測量輻射強度1.儀器設(shè)計分光光度計的組成32傳統(tǒng)的分光光度計

適用于測量光譜中單點吸光度傳統(tǒng)的分光光度計

適用于測量光譜中單點吸光度33二極管陣列分光光度計

比較：樣品和色散元件的相對位置次序相反，稱為反向光路

二極管陣列分光光度計

比較：樣品和色散元件的相對位置次序相反34按構(gòu)型分單光束設(shè)計：提供高的光通量，靈敏度高；但光源漂移產(chǎn)生較大誤差雙光束設(shè)計：矯正漂移。斬光器以一定速度旋轉(zhuǎn)，使空白和樣品的交替測量每秒進行數(shù)次。缺點，降低了光的能量和靈敏度分光束設(shè)計：分裂器將光分成兩束，同時穿過參比和空白，到達兩個分開但一樣的檢測器，可同時測定樣品和空白

雙波長設(shè)計：同時測定兩個波長，如樣品中兩個同時發(fā)生的反應(yīng)按構(gòu)型分單光束設(shè)計：提供高的光通量，靈敏度高；但光源35紫外—可見分光光度法課件36紫外—可見分光光度法課件372.主要儀器參數(shù)（可能影響吸光度測量值準確度及精確度的一些儀器參數(shù)）光譜分辨率波長準確度及精確度線性動態(tài)范圍漂移SBW/NBW≤0.12.主要儀器參數(shù)（可能影響吸光度測量值準確度及精確度的一些儀38影響測光準確度和精確度的因素：

雜散光和噪聲

雜散光：檢測到選定波長帶寬以外的任何波長光。

T=(I+Is)/(I0+Is)噪聲光子噪聲：在測量低濃度低吸光率樣品時，影響精確測量兩束高強度的光之間的微小差別。電子噪聲：是固有的，與測定的光強度無關(guān)。在高吸光度樣品的信號很小時影響大

影響測光準確度和精確度的因素：

雜散光和噪聲

雜散光：檢測到39

液體樣品固體樣品弱吸收強吸收干擾光化學(xué)問題液體樣品40動力學(xué)光譜法固相光譜法多元校正—多組分測定導(dǎo)數(shù)光譜法動力學(xué)光譜法導(dǎo)數(shù)光譜法41Beer定律：A=abc一階導(dǎo)數(shù)：如果控制I0不變，則,而結(jié)論：A’信號也正比于c，在原拐點處靈敏度最大高階導(dǎo)數(shù)光譜同樣適用Beer定律：A=abc一階導(dǎo)數(shù)：如果控制I0不變，則42導(dǎo)數(shù)光譜的特點：

隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加，峰越來越尖銳，靈敏度提高信噪比隨導(dǎo)數(shù)的階數(shù)增加而降低原譜一階導(dǎo)數(shù)二階導(dǎo)數(shù)導(dǎo)數(shù)光譜的特點：隨著導(dǎo)數(shù)階數(shù)的增加，峰越來越尖銳，靈敏度43二極管陣列分光光度計的特點二極管陣列光譜學(xué)的優(yōu)點二極管陣列光譜學(xué)的缺點快速采集，多波長同時測定，靈敏度高，有統(tǒng)計學(xué)意義，很高的穩(wěn)定性和可靠性，敞開式的樣品室分辨率較低，散射光嚴重，樣品會分解二極管陣列分光光度計的特點二