生物化學第三章核酸的結構與功能課件

第三章核酸第三章核酸核酸（Nucleicacid）是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。DNA（Deoxyribonucleicacid）脫氧核糖核酸

存在于細胞核和線粒體，攜帶遺傳信息，并通過復制傳遞給下一代。RNA（Ribonucleicacid）核糖核酸分布于細胞核、細胞質、線粒體，是DNA轉錄的產物，參與遺傳信息的復制與表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。核酸（Nucleicacid）是以核苷酸為基本組成單位的3.1核酸的組成成分元素組成主要元素組成：C、H、O、N、P（9~11%）蛋白質比較，核酸一般不含S，而P的含量較為穩(wěn)定，占9-11%?；緲嫵蓡挝唬汉塑账?nucleotide)

戊糖（ribose）：核糖，脫氧核糖

堿基（base）：嘌呤堿，嘧啶堿

磷酸（phosphate）3.1核酸的組成成分元素組成核酸（DNA和RNA）核苷酸核苷和脫氧核苷磷酸戊糖堿基嘌呤嘧啶核糖脫氧核糖核酸（DNA和RNA）核苷酸核苷和脫氧核苷磷酸戊糖堿基嘌呤嘧3.1.1戊糖（DNA含脫氧核糖；RNA含核糖）3.1.1戊糖（DNA含脫氧核糖；RNA含核糖）3.1.2含氮堿堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤鳥嘌呤尿嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶存在于DNA和RNA中僅存在于RNA中僅存在于DNA中3.1.2含氮堿堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤鳥嘌呤尿嘧啶胸腺嘧啶胞嘧兩類核酸中除了以上各四種堿基的核苷酸外，還有一些其他修飾堿基，通常含量很少，所以稱為稀有堿基。核酸中的稀有堿基是核酸生物合成后修飾產物。RNA中，特別是tRNA中含有較多的稀有堿基如二氫尿嘧啶（D）、1-甲基次黃嘌呤（m1I）、次黃嘌呤（I）、假尿嘧啶（ψ）等。兩類核酸中除了以上各四種堿基的核苷酸外，還有一些其他修飾堿基嘌呤（Pu）嘧啶（Py）嘌呤（Pu）嘧啶（Py）（1）嘌呤堿（1）嘌呤堿生物化學第三章核酸的結構與功能課件（2）嘧啶堿（2）嘧啶堿4-硫尿嘧啶二氫尿嘧啶（D）4-硫尿嘧啶二氫尿嘧啶（D）生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件（3）堿基的互變異構體（3）堿基的互變異構體酮式烯醇式互變異構酮式烯醇式互變異構胺式亞胺式互變異構胺式亞胺式互變異構3.1.3核苷戊糖和含氮堿生成的糖苷DNA含β-D-2-脫氧核糖RNA含β-D-核糖糖與堿基之間的C-N鍵：C-N糖苷鍵，且都是β糖苷鍵C1－N1（嘧啶）C1－N9（嘌呤）堿基與糖環(huán)平面垂直3.1.3核苷戊糖和含氮堿生成的糖苷（1）核苷（ribonucleoside）

嘌呤N-9或嘧啶N-1與核糖C-1＇通過β-N-糖苷鍵相連形成核苷：AR，GR，UR，CR（1）核苷（ribonucleoside）嘌呤N-（2）脫氧核苷（deoxyribonucleoside）嘌呤N-9或嘧啶N-1與脫氧核糖C-1＇通過β-N-糖苷鍵相連形成脫氧核苷：dAR，dGR，dTR，dCR（2）脫氧核苷（deoxyribonucleoside）生物化學第三章核酸的結構與功能課件（3）稀有核苷假尿苷，pseudouridine，ψ（3）稀有核苷假尿苷，pseudouridine，ψ3.1.4核苷酸核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）核苷的磷酸酯，磷酸位于C－5＇核苷酸的組成：含氮堿基、戊糖和磷酸。核苷酸的其他形式多磷酸核苷（NDP、NTP），環(huán)化核苷酸（cAMP、cGMP等）輔酶或輔基（NAD、NADP、FAD、CoA等，均含有AMP）活性代謝物（UDPG、CDP-膽堿等）

3.1.4核苷酸核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核生物化學第三章核酸的結構與功能課件5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷生物化學第三章核酸的結構與功能課件pA，pT，pG，pC，pU分別表示相應的5′-核苷酸除了5′-核苷酸外，還有3′-核苷酸用Ap，Tp，Gp，Cp，Up表示生物體內游離的2′-核苷酸較少，用Gp2′表示相應的2′-核苷酸pA，pT，pG，pC，pU分別表示相應的5′-核苷八種核苷酸腺嘌呤A鳥嘌呤G胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TRNA

AMPGMPCMPUMP未發(fā)現DNAdAMPdGMPdCMP未發(fā)現dTMPM/單，D/二，T/三；P-磷酸RNA的名稱為單/二/三苷酸，DNA在單/二/三前加脫氧兩字。如：AMP稱腺苷一磷酸（或腺苷酸）dAMP稱為脫氧腺苷一磷酸（脫氧腺苷酸）稀有核苷酸與上類似八種核苷酸腺嘌呤A鳥嘌呤G胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TRNA生物化學第三章核酸的結構與功能課件核苷酸的其他形式cAMP3′,5′-環(huán)腺苷細胞間信使

cAMP

3′,5′-環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸

cGMP

3′,5′-環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸

cAMP和cGMP的環(huán)狀磷酯鍵是一個高能鍵：pH7.4時水解能約為43.9kJ/mol，比ATP水解能高得多。核苷酸的其他形式cAMP細胞間信使輔酶ⅠNAD+輔酶ⅡNADP+輔酶Ⅰ輔酶ⅡAMPADPATPAMPADPATPATP是重要的能量轉換中間體ATP含兩個高能磷酸鍵：水解時可釋放大量自由能，推動體內各種需能反應。ATP也是磷酰化劑：磷?；牡孜锞咻^高能量（活化分子），是許多生物化學反應的激活步驟。GTP游離存在于生物體內，也是一種高能化合物,具有類似ATP的結構主要是作為蛋白質合成中磷?；w在許多情況下,ATP和GTP可以相互轉換ATP是重要的能量轉換中間體4種核糖核苷三磷酸（ATP,UTP,GTP,CTP）直接合成RNA的原料4種三磷酸脫氧核糖核苷（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）則是直接合成DNA的原料。ATP在所有生物系統(tǒng)中化學能的貯藏和利用的能量通貨有些核苷三磷酸參與特定的代謝過程如UTP參加者糖的互相轉化與合成，CTP參加磷脂的合成，GTP參加蛋白質和嘌呤的合成等核苷酸的生物學功能4種核糖核苷三磷酸（ATP,UTP,GTP,CTP）直接合成3.2核酸的一級結構核酸中核苷酸的排列順序，核苷酸的排列順序代表了遺傳信息。由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。3.2核酸的一級結構核酸中核苷酸的排列順序，核苷酸的排列順多個脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵構成了具有方向性的線性分子，稱為多聚脫氧核苷酸，即DNA鏈。一個脫氧核苷酸3′的羥基與另一個核苷酸5′的α-磷酸基團縮合形成磷酸二酯鍵。方向：5′端→3′端（由左至右）多個脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵構成了具有方向性的線性分子，稱為結構式線條式文字縮寫5`

3`首端末端pApGpCpTpG……pCpA-G-C-T-G……C結構式線條式文字縮寫5`DNA的一級結構是由四種脫氧核苷酸（dAMP、dGMP、dCMP、dTMP）通過3′,5′-磷酸二酯鍵連接起來的直線形或環(huán)狀多聚體。通常一個染色體中就是一個DNA分子（通常為雙鏈），最大有染色體DNA可超過108bp——也表示為100Mb、105Kb等人類基因組大小為3.2Gb，大約能為31000個蛋白質編碼。實際上，編碼序列只占基因組的1.1%到1.4%。RNA的一級結構是由四種核苷酸（AMP、GMP、CMP、TMP）通過3’,5’-磷酸二酯鍵連接起來的直線形多聚體tRNAmRNAsnmRNAs和RNA組學：核內小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、胞質小RNA（scRNA）、催化性小RNA（即ribozyme）、小片段干涉RNA（siRNA）DNA的一級結構生物化學第三章核酸的結構與功能課件3.3DNA的二級結構DNA雙鏈的螺旋形空間結構稱DNA的二級結構（secondarystructureofDNA）。1953年Watson和Crick提出DNA的雙螺旋結構（DNAdoublehelix，duplex）模型。是20世紀自然科學最重要的發(fā)現之一，對生命科學的發(fā)展具有劃時代的意義。3.3DNA的二級結構DNA雙鏈的螺旋形空間結構稱DNA的3.3.1雙螺旋結構的實驗依據X射線衍射數據關于堿基成對的證據：Chargaff規(guī)則不同生物種屬的DNA的堿基組成不同同一個體的不同器官或組織的DNA堿基組成相同A=T，G≡C，A+C=G+T，A+G=C+TDNA的滴定曲線3.3.1雙螺旋結構的實驗依據X射線衍射數據AGCTA/TG/CG+C嘌呤/嘧啶大腸桿菌26.024.925.223.91.090.9950.11.04結核桿菌15.134.935.414.61.030.9970.31.00酵母31.718.317.432.60.971.0535.71.00牛29.021.221.228.71.011.0042.41.01豬29.820.720.729.11.021.0041.41.01人30.419.919.930.11.011.0039.81.01不同生物來源DNA堿基組分和相對比例AGCTA/TG/CG+C嘌呤/嘧啶大腸桿菌26.024.93.3.2雙螺旋結構模型的要點3.3.2雙螺旋結構模型的要點（1）兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸纏繞，為右手螺旋。一條鏈的5′-末端與另一條鏈的3′-末端相對親水性的骨架位于雙鏈的外側疏水性的堿基位于雙鏈的內側（1）兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸纏繞，為右手螺旋（2）兩條鏈上的堿基均在主鏈內側，一條鏈上的A一定與另一條鏈上的T配對，G一定與C配對。A與T配對形成2個氫鍵，G與C配對形成3個氫鍵，螺旋直徑為2nm氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定性（2）兩條鏈上的堿基均在主鏈內側，一條鏈上的A一定與另一條鏈雙螺旋模型的堿基配對雙螺旋模型的堿基配對（3）成對堿基大致處于同一平面，該平面與螺旋軸基本垂直，糖環(huán)平面與螺旋軸基本平行，磷酸基連在糖環(huán)的外側。相鄰堿基平面距離0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10對堿基。堿基平面之間有36°的錯位。堿基堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性（3）成對堿基大致處于同一平面，該平面與螺旋軸基本垂直，糖環(huán)相鄰兩個堿基對會有重疊，產生了疏水性的堿基堆積力（basestackingforce）相鄰兩個堿基對會有重疊，產生了疏水性的堿基堆積力（b（4）由于堿基對并不處于兩條主鏈的中間，而是向一側突出，堿基對糖苷鍵的鍵角使兩個戊糖之間的窄角為120°，廣角為240°。堿基對上下堆積起來，窄角的一側形成小溝（minorgroove），其寬度為1.2nm。廣角的一側形成大溝（majorgroove），其寬度為2.2nm。（4）由于堿基對并不處于兩條主鏈的中間，而是向一側突出，堿基生物化學第三章核酸的結構與功能課件（5）大多數天然DNA屬雙鏈DNA（dsDNA），少數病毒的DNA為單鏈DNA（ssDNA）。

（6）雙鏈DNA分子主鏈上的化學鍵受堿基配對等因素影響旋轉受到限制，使DNA分子比較剛硬，呈比較伸展的結構。堿基與中心軸并非垂直，而是有一定的傾斜角12~16中心軸嘌呤嘧啶堿基間夾角并非都是36，而是28~42。（5）大多數天然DNA屬雙鏈DNA（dsDNA），少數病毒的穩(wěn)定雙螺旋結構的因素（1）堿基堆積力形成疏水環(huán)境（主要因素）。（2）堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。（3）磷酸基上的負電荷與介質中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。（4）堿基處于雙螺旋內部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。穩(wěn)定雙螺旋結構的因素（1）堿基堆積力形成疏水環(huán)境（主要因素）雙螺旋結構模型的要點總結1）反平行雙鏈右手螺旋，直徑=2nm，每圈10對核苷酸，螺距為3.4nm2）糖－Pi在螺旋線上，位于外側，平行于軸，堿基伸向內部其平面垂直于軸，表面形成大溝、小溝3）兩鏈之間A與T互補，G與C互補4）穩(wěn)定因素為氫鍵和堿基堆積力雙螺旋結構模型的理論意義1）DNA的復制，DNA遺傳信息在生物世代間、細胞世代間的傳遞

2）遺傳與變異，DNA分子的堿序列具有保守性和變異性，堿基對是突變的最小單位

3）生物的性狀控制：蛋白質的生物合成時遺傳密碼與反密碼互補配對

4）為現代分子生物學與基因工程奠定了理論基礎雙螺旋結構模型的要點總結雙螺旋結構模型的理論意義3.3.3DNA二級結構的其他類型類型結晶狀態(tài)螺距（nm）堿基距離（nm）每圈（bp數）旋轉方向A相對濕度75%DNA鈉鹽2.80.25611右手B相對濕度92%DNA鈉鹽3.40.3410右手C相對濕度66%DNA鈉鹽3.10.3329.3右手Zd（GCGCGC）1.110.3712左手3.3.3DNA二級結構的其他類型類型結晶狀態(tài)螺距堿基距生物化學第三章核酸的結構與功能課件回文結構：

DNA序列中以某一中心區(qū)域為對稱軸，其兩側的堿基對順序正讀和反讀都相同的雙螺旋結構。即對稱軸一側的片段旋轉180°后，與另一側片段對稱重復?；匚慕Y構能形成十字結構和發(fā)夾結構回文結構：AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAGGATCTTAAGTTCCCTCTTCATATCTTCTCCCTTCCTAG鏡像重復：

存在于同一股上的某些DNA區(qū)段的反向重復序列。此序列各單股中沒有互補序列，不能形成十字型或發(fā)夾結構。AATTCAAGGGAGAAGTATAGAAGAGGGAAG三股螺旋（K.Hoogsteen1963）：通常是一條同型寡核苷酸與寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸雙螺旋的大溝結合：oligo(Py):oligo(Pu)—oligo(Py/Pu)由于設計、合成的第三條連具有結合DNA特定位點的能力，有可能抑制基因的表達，這為藥物的設計帶來了希望。三股螺旋（K.Hoogsteen1963）：生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件3.4DNA的高級結構DNA雙螺旋通過扭曲和折疊所形成的特定構象。超螺旋結構（superhelix

或supercoil）DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結構正超螺旋（positivesupercoil）或負超螺旋（negativesupercoil）盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同或相反3.4DNA的高級結構DNA雙螺旋通過扭曲和折疊所形成的特3.4.1環(huán)狀DNA的超螺旋結構細菌的染色體DNA、病毒的DNA、質粒、真核生物的線粒體和葉綠體的DNA，為雙鏈環(huán)形DNA

（double-strandcircularDNA，dcDNA）可進一步扭曲成超螺旋DNA（superhelixDNA），這種結構還可被稱為共價閉環(huán)DNA

（covalentlyclosedcircularDNA，cccDNA）3.4.1環(huán)狀DNA的超螺旋結構細菌的染色體DNA、病毒的超螺旋DNA的一條鏈斷裂，分子將釋放扭曲張力，形成松弛環(huán)形DNA

（relaxedcircularDNA），也稱為開環(huán)DNA

（opencircularDNA，ocDNA）超螺旋DNA的兩條鏈均斷裂，就會轉化為線形DNA

（linearDNA）超螺旋DNA的一條鏈斷裂，分子將釋放扭曲張力，形成松弛環(huán)形D正超螺旋負超螺旋（多見）雙鏈環(huán)形DNADNA超螺旋結構整體或局部的拓撲學變化及其調控對于DNA復制和RNA轉錄過程具有關鍵作用。正超螺旋負超螺旋雙鏈環(huán)形DNADNA超螺旋結構整體或原核生物DNA多為環(huán)狀，以負超螺旋的形式存在，平均每200堿基就有一個超螺旋形成原核生物DNA多為環(huán)狀，以負超螺旋的形式存在，平均每連環(huán)數（linkingnumber,L）DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數扭轉數（twistingnumber,T）DNA分子中的Watson-Crick螺旋數目，以T表示超螺旋數（纏繞數,writhingnumber,W）比連環(huán)差（specificlinkingdifference,λ）表示DNA的超螺旋程度（Superhelixdensity）三者的關系式：L=T+W連環(huán)數（L）纏繞數（T）扭曲數（W）松馳環(huán)25250解鏈環(huán)23230超螺旋2325-2連環(huán)數（linkingnumber,L）連環(huán)數（L）纏生物化學第三章核酸的結構與功能課件拓撲異構酶：改變DNA拓撲異構體的L值。拓撲異構酶酶I（解旋酶）

能使雙鏈負超螺旋DNA轉變成松馳形環(huán)狀DNA，每次催化使L增加1。

拓撲異構酶酶II（促旋酶）能使松馳環(huán)狀DNA轉變成負超螺旋形DNA，每次催化使L減少2。拓撲異構酶：改變DNA拓撲異構體的L值。3.4.2真核生物染色體結構在細胞周期的大部分時間里，DNA以松散的染色質（chromatin）形式存在，在細胞分裂期，則形成高度致密的染色體（chromosome）3.4.2真核生物染色體結構在細胞周期的大部分時間里，DNDNA染色質呈現出的串珠樣結構染色質的基本單位是核小體（nucleosome）DNA染色質呈現出的串珠樣結構核小體的組成：

DNA：約200bp組蛋白：H1，H2A、H2B，H3，H4長約140bp的DNA分子繞核心部位1?圈核小體的組成：長約140bp的DNA分子繞核心部位1?圈生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件2nm2nm，10bp11nm，80bp30nm，1200bp300nm，75000bp2nm2nm，10bp11nm，80bp30nm，1200b100nm，4.5×105bp人的DNA大分子在染色質中反復折疊盤繞共壓縮8000～10000倍700nm，1.35×107bp100nm，4.5×105bp人的DNA大分子在染色質中反復DNA的功能

DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復制和轉錄的模板。它是生命遺傳的物質基礎，也是個體生命活動的信息基礎。

基因從結構上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。DNA的功能3.5DNA和基因組基因和基因組的概念病毒和細菌基因組的特點真核生物基因組的特點3.5DNA和基因組基因和基因組的概念3.5.1基因和基因組的概念DNA通過復制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質分子，從而決定生物的表現型。DNA的復制、轉錄和翻譯過程就構成了遺傳學的中心法則。DNA分子中最小的功能單位稱基因某生物所含的全部基因稱該生物體的基因組3.5.1基因和基因組的概念DNA通過復制將遺傳信息由親代轉錄：生物體可用堿基配對的方式合成與DNA核苷酸序列相對應的RNA信使RNA

（messengerRNA，mRNA）：轉錄生成的RNA一部分用于指導蛋白質合成翻譯：mRNA的核苷酸序列決定蛋白質的氨基酸序列，由mRNA指導蛋白質合成的過程核糖體RNA

（ribosomeRNA，rRNA）：核糖體中所含的RNA轉移RNA（transferRNA，tRNA）：將氨基酸轉運到核糖體的特定部位用于蛋白質合成的RNArRNA、tRNA和一些其他類型的RNA均由DNA轉錄生成轉錄：生物體可用堿基配對的方式合成與DNA核苷酸序列相對應的3.5.2病毒和細菌基因組的特點共同特點（1）基因組很小，結構簡練，環(huán)型和線型DNA分子組成（2）大部分為蛋白質編碼的基因，基因間隔序列很短（3）功能相關的基因常串聯在一起，有共同的調控元件操縱子（Operon

）指啟動基因、操縱基因和一系列緊密連鎖的結構基因的總稱，其中結構基因的表達受到操縱基因的調控。3.5.2病毒和細菌基因組的特點共同特點病毒基因組的特點

（1）基因組可由DNA組成，也可由RNA組成；但只可以由其中的一種組成。（2）不少病毒以RNA為遺傳物質（3）存在重疊基因，一個基因編碼幾種蛋白質。病毒基因組的特點（1）正鏈RNA病毒

病毒RNA進入細胞后可直接指導合成蛋白質

例如：冠狀病毒和脊髓灰質炎病毒等（2）負鏈RNA病毒

病毒RNA進入細胞后需先合成互補的RNA然后合成蛋白質

例如：狂犬病病毒等，侵入宿主細胞后，依靠攜帶的復制酶合成正鏈RNA，再翻譯產生病毒蛋白質，并復制病毒RNA（3）雙鏈RNA病毒

以雙鏈RNA的負鏈為模板合成正鏈RNA，用以指導蛋白質的合成

例如：呼腸孤病毒（4）逆轉錄病毒

以RNA為模板合成cDNA,再由cDNA為模板合成雙鏈DNA，轉錄mRNA后指導蛋白質的合成

例如：白血病病毒和肉瘤病毒等（1）正鏈RNA病毒單鏈正股RNA病毒（－）ssRNA親代病毒（＋）ssRNA早期蛋白（＋）ssRNAdsRNA復制中間型（－）ssRNA（＋）ssRNA大量子代（＋）ssRNA晚期蛋白裝配子代病毒單鏈正股RNA病毒（－）ssRNA親代病毒（＋）ssRNA早單股負股RNA病毒病毒自身攜帶依賴RNA的RNA多聚酶親代（－ssRNA）（＋）mRNA蛋白質（＋）ssRNA子代（－）sRNA子代病毒多聚酶單股負股RNA病毒病毒自身攜帶依賴RNA的RNA多聚酶親代（逆轉錄病毒病毒RNA逆轉錄酶雙股DNA整合至宿主細胞（前病毒）mRNA病毒RNA結構蛋白裝配子代病毒RNA:DNA轉錄酶聚合酶逆轉錄病毒病毒RNA逆轉錄酶雙股DNA整合至宿主細胞（前病毒逆轉錄病毒致癌機理（＋）RNA腫瘤病毒（＋）RNA（－）DNA（±）DNA

整合到宿主基因組宿主癌基因活化宿主癌變逆轉錄病毒致癌機理（＋）RNA腫瘤病毒（＋）RNA（－細菌基因組的特點

（1）細菌染色體基因組：通常僅一條環(huán)狀雙鏈DNA分子組成（2）編碼蛋白質的基因都是單拷貝的（3）基因組中有多種調控區(qū)，和少量重復序列（4）基因組中存在可移動的DNA序列（轉座子）質粒：某些細菌中獨立于染色體外的能自主復制的共價環(huán)狀雙鏈DNA。可作為基因工程的載體細菌基因組的特點3.5.3真核生物基因組的特點真核基因組結構龐大哺乳類動物基因組DNA約3×109堿基對。人編碼基因約4萬個，編碼序列僅占總長的1%。不存在操縱子結構一個編碼基因轉錄生成一個mRNA分子，經翻譯生成一條多肽鏈。多種調控因子構成復雜的調控系統(tǒng)。3.5.3真核生物基因組的特點真核基因組結構龐大真核基因組含有大量的重復序列高度重復序列：重復率達106

次，亦稱為稱為衛(wèi)星DNA

中度重復序列：重復率約103~104次，平均350次，大多數中度重復序列與其他序列間隔排列，稱作散布重復序列散布重復序列主要包括短散布元件、長散布元件和轉座子少數中度重復序列成串排列在一個區(qū)域，稱作串聯重復序列串聯重復序列主要包括小衛(wèi)星DNA、微衛(wèi)星DNA和rDNA（絲粒序列和端粒序列）

低度重復序列：編碼細胞骨架蛋白等蛋白質的基因只有數個

單一序列：絕大多數編碼蛋白質的基因只有一個或幾個存在非編碼序列和間隔區(qū)（斷裂基因）真核結構基因兩側存在有不被轉錄的非編碼序列，往往是基因表達的調控區(qū)。在編碼基因內部尚有內含子（intron）、外顯子（exon）之分，因此真核基因是不連續(xù)的。真核基因組含有大量的重復序列3.6RNA的結構和功能RNA與蛋白質共同負責基因的表達和表達過程的調控。RNA通常以單鏈的形式存在，但有復雜的局部二級結構或三級結構。RNA比DNA小的多。RNA的種類、大小和結構遠比DNA表現出多樣性。3.6RNA的結構和功能RNA與蛋白質共同負責基因的表達和細胞核和胞液線粒體功能核蛋白體RNArRNAmtrRNA核蛋白體組分信使RNAmRNAmtmRNA蛋白質合成模板轉運RNAtRNAmttRNA轉運氨基酸核內不均一RNAHnRNA成熟mRNA的前體核內小RNASnRNA參與hnRNA的剪接、轉運核仁小RNASnoRNArRNA的加工、修飾胞漿小RNAscRNA/7SL-RNA蛋白質內質網定位合成的信號識別體的組分RNA的種類、分布、功能細胞核和胞液線粒體功能核蛋白體RNArRNAmtrRNA核RNA的結構特征大多數天然RNA分子是核糖核苷酸通過磷酸二酯鍵相連形成的一條單鏈，其許多區(qū)域自身發(fā)生回折，使可以配對的一些堿基相遇，而由A與U、G與C之間的氫鍵連接起來，形成局部雙螺旋（二級結構）；不能形成配對的堿基則形成環(huán)狀突起。進而折疊形成三級結構。RNA的結構特征3.6.1tRNA（轉運RNA）在蛋白質合成過程中作為各種氨基酸的載體，將氨基酸轉呈給mRNA。細胞內一般有50種以上不同的tRNA，有些真核生物細胞甚至可多達100多種。由74～95核苷酸組成，占細胞總RNA的15%稀有堿基多，分子量小，具有很好的穩(wěn)定性3.6.1tRNA（轉運RNA）在蛋白質合成過程中作為各種二級結構模型：

三葉草型組成：四環(huán)一臂氨基酸臂DHU環(huán)反密碼環(huán)TC環(huán)額外環(huán)tRNA具有局部的莖環(huán)（stemloop）結構或發(fā)卡（hairpin）結構

某些位置上的核苷酸在不同的tRNA分子中很少變化，稱不變核苷酸二級結構模型：tRNA具有局部的莖環(huán)（steml“三葉草”結構特征:1）四環(huán)四臂（四環(huán)一臂）2）氨基酸臂互補堿基7對，5′末端為－PG，3′末端為CCA－OH3）二氫尿嘧啶環(huán)

8-12單核苷酸，2個二氫尿嘧啶（D）4）反密碼環(huán)

7個單核苷酸組成，反密碼子中常含有次黃嘌啉（I）5）額外環(huán)含3-18核苷酸6）TΨC環(huán)含7個單核苷酸，包括一個假尿嘧啶（Ψ）和T

7）修飾堿基

含有多少不等數量種類的修飾堿基，“三葉草”結構特征:稀有堿基二氫尿嘧啶次黃嘌啉假尿嘧啶m7-甲基鳥嘌呤稀有堿基二氫尿嘧啶次黃嘌啉假尿嘧啶m7-甲基鳥嘌呤氨基酸臂功能：結合氨基酸反密碼子環(huán)功能：識別mRNA的密碼子DHU環(huán)功能：與核糖體rRNA結合TΨC環(huán)額外環(huán)（可變環(huán)）tRNA的功能：

結合活化氨基酸（3′－CCA－OH），搬運氨基酸到核糖體；識別mRNA密碼子。參與蛋白質的翻譯。氨基酸臂反密碼子環(huán)DHU環(huán)TΨC環(huán)額外環(huán)tRNA的功能：tRNA的三級結構：倒L形tRNA三維結構與其功能密切相關位點tRNA的倒L結構與核糖體上的空穴相符，TψC環(huán)中GTψC與核糖體中5srRNA相應區(qū)段有堿基互補關系L型分子表面化學基團的排列，與一些酶（氨基酰-tRNA合成酶）和蛋白質與tRNA分子的相互識別有關。tRNA的三級結構：tRNA三維結構與其功能密切相關位點3.6.2rRNA（核蛋白體RNA）核蛋白體RNA（ribosomalRNA，rRNA）是細胞內含量最多的RNA（>80％）。rRNA與核蛋白體蛋白結合組成核蛋白體（ribosome），為蛋白質的合成提供場所S:沉降系數以每單位重力的沉降時間表示，并且通常為1～200×10-13秒范圍，10-13這個因子叫做沉降單位S，即1S=10-13秒，如血紅蛋白的沉降系數約為4×10-13秒或4S。

大多數蛋白質和核酸的沉降系數在4S和40S之間，核糖體及其亞基在30S和80S之間，多核糖體在100S以上3.6.2rRNA（核蛋白體RNA）核蛋白體RNA（rib原核生物（70S）真核生物（80S）小亞基30S40SrRNA16S1542個核苷酸18S1874個核苷酸蛋白質21種占總重量的40%33種占總重量的50%大亞基50S60SrRNA23S5S2940個核苷酸120個核苷酸28S5.85S5S4718個核苷酸160個核苷酸120個核苷酸蛋白質31種占總重量的30%49種占總重量的35%核蛋白體的組成原核生物（70S）真核生物（80S）小亞基30S40SrRN大腸桿菌的核蛋白體大腸桿菌的核蛋白體真核生物核蛋白體rRNA的功能：作為核糖體的骨架催化肽鍵的形成真核生物核蛋白體rRNA的功能：生物化學第三章核酸的結構與功能課件3.6.3mRNA和hnRNA信使RNA（messengerRNA,mRNA）是合成蛋白質的模板。不均一核RNA（hnRNA）含有內含子（intron）和外顯子（exon）。外顯子是氨基酸的編碼序列，而內含子是非編碼序列。hnRNA經過剪切后成為成熟的mRNA。3.6.3mRNA和hnRNA信使RNA（messengemRNA成熟過程hnRNA

內含子（intron）mRNA外顯子（exon）內含子（intron）：基因中不編碼的居間序列外顯子（exon）：編碼的片段mRNA成熟過程hnRNA內含子mRNA外顯子（mRNA的結構特點

mRNA可形成局部雙螺旋結構的二級結構。

mRNA在真核生物中的初級產物稱為HnRNA5′端的7－甲基鳥苷三磷酸（m7GTP）帽子

3′端的多聚腺苷酸（polyA）尾

mRNA分子中帶有遺傳密碼mRNA的結構特點帽子結構：m7GpppNmmRNA的帽結構可以與帽結合蛋白（capbindingprotein，CBP）結合。帽子結構：m7GpppNmmRNA的帽結構可以與帽結合蛋白（真核生物的mRNA的3-末端轉錄后加上一段長短不一的聚腺苷酸。功能：mRNA核內向胞質的轉位mRNA的穩(wěn)定性維系翻譯起始的調控帽子結構和多聚A尾的功能真核生物的mRNA的3-末端轉錄后加上一段長短不mRNA的功能：把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質的氨基酸排列順序。DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞細胞質細胞核DNA內含子外顯子轉錄轉錄后剪接轉運mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細胞mRNA的功能：DNAmRNA蛋白轉錄翻譯原核細胞3.6.4snRNA和snoRNAsnRNAs細胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，統(tǒng)稱為非mRNA小RNA。與蛋白質連在一起以核糖核蛋白形式存在主要作用是HnRNA的加工修飾。snoRNA

存在在核仁區(qū)，與rRNA前體的加工修飾有關3.6.4snRNA和snoRNAsnRNAs3.6.5asRNA和RNAiasRNA（又稱反義RNA）可以通過特定的互補序列與特定的mRNA結合，抑制mRNA的翻譯，隨后在真核細胞中，亦發(fā)現了asRNA，并發(fā)現asRNA除主要在翻譯水平抑制基因表達外，還可以抑制DNA的復制與轉錄。asRNA已用于抑制導致水果腐爛的酶，延長水果保存期等，并可能為某些疾病的治療提供新途徑。RNAi（小片段干擾RNA）是生物宿主對外源侵入的基因表達的雙鏈RNA進行切割所產生的特定長度和特定核酸序列的小片段RNA。可以與外源基因表達的mRNA相結合，并誘發(fā)這些mRNA的降解3.6.5asRNA和RNAiasRNA（又稱反義RNA）3.6.6非編碼RNA的多樣性高等真核生物的轉錄產物超過97%是不編碼蛋白質不編碼蛋白質，以RNA形式發(fā)揮作用的RNA稱非編碼RNA（non-codingRNA，ncRNA）ncRNA種類繁多

（1）根據ncRNA的功能分類

（2）根據ncRNA在細胞內的分布分類

（3）根據ncRNA的大小分類3.6.6非編碼RNA的多樣性高等真核生物的轉錄產物超過9（1）根據ncRNA的功能分類

①催化RNA（cataliticRNA，cRNA）亦稱核酶，是有催化功能的RNA分子?，F在發(fā)現的核酶大部分參加RNA的加工和成熟，但已發(fā)現可催化肽鍵合成的RNA，23SrRNA具肽酰轉移酶活性，說明RNA的催化功能是一個很值得研究的領域。②類似mRNA的RNA即3′端有PolyA，無典型ORF，不編碼蛋白質的RNA分子。是一類與細胞的生長和分化、胚胎的發(fā)育、腫瘤的形成和抑制密切相關的調節(jié)因子。③指導RNA（guideRNA，gRNA）是指導mRNA編輯的小RNA分子，多用來指導在mRNA轉錄產物中加入U的過程。④tmRNAtmRNA溉有tRNA的功能，又有mRNA的功能，翻譯時既可以轉運氨基酸，又可作合成肽鏈的模板。⑤端粒酶RNA（telomeraseRNA）端粒酶由RNA和蛋白質構成，其中的RNA是真核染色體端粒復制的模板。⑥信號識別顆粒（signalrecognitionparticle，SRP）RNA是SRP的組成部分，與細胞內蛋白質的轉運有關。⑦微小RNA（microRNA，miRNA）由基因組DNA非編碼區(qū)轉錄，長度約22nt，在基因表達、細胞周期及個體發(fā)育的調控中發(fā)揮重要作用。

⑧小干擾RNA（smallinterferinRNA，siRNA）

一種與microRNA大小相似的外源雙鏈RNA分子，在RNA干擾（RNAi）途徑中介導靶mRNA的降解。（1）根據ncRNA的功能分類（2）根據ncRNA在細胞內的分布分類①核小RNA（snRNA）包括剪接體snRNA（Ul，U2，U4，U5，U6）和U7snRNA，前者是mRNA前體剪接體的重要組分，后者負責組蛋白前體mRNA3'-末端的形成。②核仁小RNA（snoRNA）是最豐富的一類ncRNA，主要參與rRNA及其他RNA的修飾、加工、成熟等過程。③胞質小RNA（smallcytoplasmicRNA，scRNA）

分布在細胞質，主要在蛋白質合成過程中起作用。

④新近發(fā)現的Cajal小體（Cajalbodies，CBs）小RNA是CRs特異性小RNA，能與U族snRNA喊基配對，可能參與Ul、U2、U4、U5位點特異性的2′-O-核糖甲基化和假尿嘧啶形成。（3）根據ncRNA的大小分類①21～25nt的ncRNA包括microRNA（miRNA）家族和小干擾RNA（siRNA）家族兩種類型，是真核細胞基因表達的重要調控因子，是曰前備受關注、研究最多和進展最快的一類ncRNA。②100～200nt的smallRNA是細菌細胞的翻譯調節(jié)因子。

③大于10000nt的ncRNA參與高級真核生物的基因沉默。（2）根據ncRNA在細胞內的分布分類DNARNA組成ACGT脫氧核糖ACGU核糖一級結構堿基序列堿基序列空間結構雙螺旋、超螺旋、蛋白質－核酸的非共價結合等局部雙螺旋mRNA：5′-帽子，3′-polyA，rRNA：大、小亞基組成核糖體tRNA：三葉草、倒L型結構功能遺傳信息的儲存遺傳信息的表達DNARNA組成ACGTACGU一級結構堿基序列堿基序列空間3.7核酸的性質核酸的化學結構和作為高聚物大分子決定著其物理化學性質核酸的糖苷鍵和磷酸二酯鍵可被酸、堿或各自相應的核酸酶水解成為各種成分，其水解程度因水解條件而異核酸和核苷酸既有磷酸基團，又有堿性基團，都是兩性電解質——酸堿性質DNA和RNA都微溶于水，不溶于有機溶劑，提取分離核酸時，可用乙醇將核酸從溶液中常沉淀出來核酸的紫外吸收特性因其所含堿基而引起核酸的變性與復性與其雙螺旋結構有關。3.7核酸的性質核酸的化學結構和作為高聚物大分子決定著其物3.7.1一般理化性質核酸的酸堿及溶解度性質

核酸為多元酸，具有較強的酸性DNA由于不存在2′－OH，不能被堿水解核酸的高分子性質

粘度：DNA>RNAdsDNA>ssDNA

沉降行為：不同構象的核酸分子的沉降的速率有很大差異，這是超速離心法提取和純化核酸的理論基礎3.7.1一般理化性質核酸的酸堿及溶解度性質核酸的水解（1）酸水解糖苷鍵比磷酸二酯鍵更易被酸水解嘌呤堿基的糖苷鍵比嘧啶堿基的糖苷鍵對酸更不穩(wěn)定（2）堿水解相對而言DNA一般對堿穩(wěn)定RNA的磷酸酯鍵易被堿水解，產生核苷酸。是由于RNA的核糖上有2′-OH基，在堿作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯極不穩(wěn)定，隨即水解產生，產生2′,3′-環(huán)磷酸酯，再水解成2′-核苷酸，3′-核苷酸KOH較好。水解后用HClO4中和，由于KClO4溶解度較小，溶液中大部分K＋即被除去。酯鍵糖苷鍵核酸的水解酯鍵糖苷鍵（3）酶水解

非特異性（既能水解DNA又能水解RNA）——磷酸二酯酶牛脾磷酸二酯酶（5′端外切5得3）蛇毒磷酸二酯酶（3′端外切3得5）

專一性水解磷酸二酯鍵——核酸酶核酸酶的分類①按作用底物分：RNase（牛胰核糖核酸酶、核糖核酸酶T1、核糖核酸酶T2）

DNase（牛胰脫氧核糖核酸酶Ⅰ、牛脾脫氧核糖核酸酶）②按作用方式分：核酸內切酶核酸外切酶（5′→3′外切酶、3′→5′外切酶）③斷裂磷酸二酯鍵的方式④其他：雙鏈酶、單鏈酶（3）酶水解3.7.2紫外吸收性質堿基含有共軛雙鍵兩類核酸的紫外吸收譜均為260~290nm其最高吸收峰接近260nm常用作核酸的定性和定量分析3.7.2紫外吸收性質堿基含有共軛雙鍵生物化學第三章核酸的結構與功能課件（1）對待測樣品是否純的判斷可用紫外分光光度計讀出260nm和280nm的A值，計算A260/A280，從此值大小判斷樣品的純度，純的DNA的A260/A280應為1.8；純的RNA應為2.0。（2）對純核酸樣品的定量測定只要測出260nm的A值，即可計算含量。通常以1個A單位相當于50ug/ml雙螺旋DNA；或40ug/ml的單鏈DNA（或RNA）；或20ug/ml的寡核苷酸（或單核苷酸）（3）判斷DNA是否變性產生增色效應核酸水解為核苷酸，紫外吸收值通常增加30%～40%，這種現象被稱作增色效應小量DNA或RNA的紫外吸收法定量測定（1）對待測樣品是否純的判斷小量DNA或RNA的紫外吸收法3.7.3核酸結構的穩(wěn)定性堿基對間的氫鍵氫鍵的集合能量很大，如果不能同時打開許多氫鍵，局部打開的氫鍵有恢復原有狀態(tài)的趨勢，保持分子構象不變。維持著核酸橫向結構。堿基堆積力嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)之間存在較強的范德華作用力；雙螺旋內部的堿基對高度疏水，使環(huán)境中的水在螺旋外圍形成水殼，有助于螺旋的穩(wěn)定。堿基平面間的范德華作用力和疏水作用力的統(tǒng)稱，維持核酸縱向結構。環(huán)境中的正離子正離子可與磷酸基團結合，消除靜電斥力3.7.3核酸結構的穩(wěn)定性堿基對間的氫鍵3.7.4核酸的變性在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成兩條單鏈的過程。DNA變性的本質是雙鏈間氫鍵的斷裂。破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級結構改變、理化性質及生物活性發(fā)生改變，不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結構不變。變性后，260nm的紫外吸收值明顯增加，即產生增色效應3.7.4核酸的變性在某些理化因素作用下，DNA雙鏈解開成DNA的變性核苷酸骨架上3′，5′-磷酸二酯鍵的斷裂稱為降解DNA的變性核苷酸骨架上3′，5′-磷酸二酯鍵的斷裂稱為降解生物化學第三章核酸的結構與功能課件DNA解鏈時的紫外吸收變化完全變性后核酸紫外吸收值增加：

天然DNA↑25~40%、RNA↑約1.1%實質：堿基暴露RNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質變化沒有DNA那樣明顯DNA解鏈時的紫外吸收變化完全變性后核酸紫外吸收值增加：熱變性變性過程是“躍變式”的，而非漸變如果在連續(xù)加熱DNA的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。變性是在一個相當窄的溫度范圍內完成，在這一范圍內，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱融解溫度（meltingtemperature,Tm）。熱變性變性過程是“躍變式”的，而非漸變如果在連續(xù)加熱Tm的影響因素

①G-C對含量

G-C對含3個氫鍵，A-T對含2個氫鍵，故G-C對相對含量愈高，Tm亦愈高②溶液的離子強度

離子強度較低的介質中，Tm較低。在純水中，DNA在室溫下即可變性。需核酸變性時，常采用離子強度較低的緩沖溶液。③溶液的pH

高pH下，堿基廣泛去質子而喪失形成氫鍵的能力，pH大于11.3時，DNA完全變性。pH低于5.0時，DNA易脫嘌呤，對單鏈DNA進行電泳時，常在凝膠中加入NaOH以維持變性狀態(tài)。④變性劑甲酰胺、尿素、甲醛等可破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。對單鏈DNA進行電泳時，常使用上述變性劑。Tm的影響因素①G-C對含量G-C對含3個氫鍵，A3.7.5核酸的復性當變性條件緩慢地除去后，兩條解離的互補鏈可重新配對，恢復原來的雙螺旋結構，這一現象稱為DNA復性（renaturation）。熱變性的DNA經緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火（annealing）。減色效應：DNA復性時，其溶液A260降低。3.7.5核酸的復性當變性條件緩慢地除去后，兩條解離的互補生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件（1）Tm為25℃為較適合的復性溫度（1）單鏈片段濃度越高，隨機碰撞的頻率越高，復性速度越快。（2）較大的單鏈片段擴散困難，鏈間錯配頻率高，復性較慢。（3）片段內的重復序列多，則容易形成互補區(qū)，因而復性較快。真核DNA的重復序列就是通過復性動力學研究發(fā)現的。（4）維持溶液一定的離子強度，消除磷酸基負電荷造成的斥力，可加快復性速度。復性影響因素（1）Tm為25℃為較適合的復性溫度復性影響因素3.7.6核酸的分子雜交在DNA變性后的復性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關系，在適宜的條件（溫度及離子強度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈（heteroduplex）雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間形成，也可在RNA與DNA鏈之間形成雜交的本質：一定條件下使互補核酸鏈實現復性3.7.6核酸的分子雜交在DNA變性后的復性過程中，如果將生物化學第三章核酸的結構與功能課件利用探針（probe）與靶DNA雜交，可識別靶DNA中的特異核苷酸序列探針：探針是指帶有某些標記物（如放射性同位素32P，熒光物質異硫氰酸熒光素等）的特異性核酸序列片段利用探針（probe）與靶DNA雜交，可識別靶DNA雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間形成，也可在RNA與DNA鏈之間形成。雜交雙鏈可以在DNA與DNA鏈之間形成，也可在RNASouthern印跡（雜交）①DNA的電泳②電泳結果的凝膠上的DNA條帶轉移到硝酸纖維素早濾膜（醋酸纖維素濾膜）上③將濾膜上的DNA變性后固定④將變性的DNA濾膜在適當條件下與探針雜交⑤雜交結果的顯示Northern印跡（雜交）是將RNA分子從凝膠轉移到硝酸纖維素膜或其它化學修飾的活性濾紙上，從而進行核酸雜交的一種實驗方法。Western印跡法基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質在所的位置。雜交與PCR結合，能夠檢出含量極低的DNASouthern印跡（雜交）生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件在現代分子生物學實驗中，探針的制備和使用是分子雜交技術的基礎，核酸分子雜交作為一項基本技術，已應用于核酸結構與功能研究的各個方面醫(yī)學上，分子雜交技術主要用于：遺傳性疾病的基因診斷（genediagnosis）惡性腫瘤的基因分析傳染病病原體的檢測其他方面研究DNA分子中某一種基因的位置測定兩種核酸分子間的序列相似性檢測某些專一序列在待檢樣品中存在與否是基因芯片技術的基礎在現代分子生物學實驗中，探針的制備和使用是分子雜交技3.8核酸序列的測定目前應用的兩種快速序列測定技術是Sanger等（1977）提出的酶法（鏈終止法）及Maxam和Gilbert（1977）提出的化學降解法。1968年吳瑞設計出一種引物-延伸測序策略，并于1971年測定了λ噬菌體兩個粘性末端的完整序列1977年Sanger在引物-延伸策略基礎上，發(fā)明了快速測定DNA序列的末端終止法1983年Mullis完善了聚合酶鏈反應（PCR）擴增DNA的方法1988年M.Smith根據K.Mullis方法，發(fā)明堿基定點突變技術3.8核酸序列的測定目前應用的兩種快速序列測定技術是San3.8.1鏈終止法測序技術F.Sanger于1977年發(fā)明的一種簡單快速DNA序列測定新方法；策略是把確定逐個核苷酸的序列測定變?yōu)橐詼y定片段長度推測序列。酶法的技術基礎主要有

（1）用凝膠電泳分離DNA單鏈片斷時，小片斷移動快，大片斷移動慢，用適當的方法可分離分子大小僅差一個核苷酸的DNA片斷。

（2）用合適的聚合酶可以在試管內合成單鏈DNA模板的互補鏈。反應體系中除單鏈模板外，還應包括合適的引物，4種脫氧核苷三磷酸和若干種適量的無機離子

3.8.1鏈終止法測序技術F.Sanger于1977年發(fā)明

SangerDNA序列測定方法的要點：①把待測DNA樣品分出四份，分別置于編號試管；②加入底物dNTP、聚合酶、5′被放射性標記的DNA引物；③給各試管分別加入一種ddNTP；④保溫反應后，從各管分別取樣，并在同一塊凝膠上進行PAGE分離、放射性自顯影；⑤根據顯帶拼讀堿基序列。通過F.Sanger法，有經驗的工作者可以測定含有200～300核苷酸的DNA順序。SangerDNA序列測定方法的要點：2′，3′-雙脫氧核糖核苷酸，ddNTP堿基有A、C、G、T對應四種堿基有四種雙脫氧核苷三磷酸ddATP、ddCTP等，由于ddNTP的3′位無-OH，不可能形成磷酸二酯鍵，故合成自然中斷。2′，3′-雙脫氧核糖核苷酸，ddNTP堿基有A、C、G、T雙脫氧法的特點

需要單鏈模板、寡核苷酸引物和高質量的DNA聚合酶優(yōu)點

簡單、快速。缺點①聚合反應會因為二級結構而提前終止，常常測不到準確的DNA序列；②由于需要經模板與引物結合后，才能反應并測序，因此對于寡聚核苷酸DNA序列，例如對引物DNA的序列不能測定；③該法直接分析的是合成的新鏈序列，而不是模板鏈，因此不能分析模板中甲基化部位；④需要適當的引物和能合成單鏈模板的載體。雙脫氧法的特點3.8.2焦磷酸測序技術1987年Nyren等發(fā)展起來一種新型的DNA測序技術基本原理

引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶（DNApolymerase）、ATP硫酸化酶（ATPsulfurylase）、熒光素酶（luciferase）和腺苷三磷酸雙磷酸酶（apyrase）4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光信號的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。3.8.2焦磷酸測序技術1987年Nyren等發(fā)展起來一種

反應體系由反應底物、待測單鏈、測序引物和4種酶構成。反應體系由反應底物、待測單鏈、測序引物和4種酶構成。3.8.3化學法測序由A.Maxam和W.Gilbert創(chuàng)立的DNA化學測序方法制備了4套脫氧寡核苷酸，把一種堿基特異性化學試劑加到純化的3’或5’末端標記脫氧寡核苷酸中，使DNA在一或二個特殊的核苷酸處隨機斷裂由于只有末端標記的片段在隨后的測序膠放射自顯影中被看到，所以DNA梯度被看到3.8.3化學法測序由A.Maxam和W.Gilbert創(chuàng)生物化學第三章核酸的結構與功能課件第三章核酸第三章核酸核酸（Nucleicacid）是以核苷酸為基本組成單位的生物大分子，攜帶和傳遞遺傳信息。DNA（Deoxyribonucleicacid）脫氧核糖核酸

存在于細胞核和線粒體，攜帶遺傳信息，并通過復制傳遞給下一代。RNA（Ribonucleicacid）核糖核酸分布于細胞核、細胞質、線粒體，是DNA轉錄的產物，參與遺傳信息的復制與表達。某些病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。核酸（Nucleicacid）是以核苷酸為基本組成單位的3.1核酸的組成成分元素組成主要元素組成：C、H、O、N、P（9~11%）蛋白質比較，核酸一般不含S，而P的含量較為穩(wěn)定，占9-11%?；緲嫵蓡挝唬汉塑账?nucleotide)

戊糖（ribose）：核糖，脫氧核糖

堿基（base）：嘌呤堿，嘧啶堿

磷酸（phosphate）3.1核酸的組成成分元素組成核酸（DNA和RNA）核苷酸核苷和脫氧核苷磷酸戊糖堿基嘌呤嘧啶核糖脫氧核糖核酸（DNA和RNA）核苷酸核苷和脫氧核苷磷酸戊糖堿基嘌呤嘧3.1.1戊糖（DNA含脫氧核糖；RNA含核糖）3.1.1戊糖（DNA含脫氧核糖；RNA含核糖）3.1.2含氮堿堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤鳥嘌呤尿嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶存在于DNA和RNA中僅存在于RNA中僅存在于DNA中3.1.2含氮堿堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤鳥嘌呤尿嘧啶胸腺嘧啶胞嘧兩類核酸中除了以上各四種堿基的核苷酸外，還有一些其他修飾堿基，通常含量很少，所以稱為稀有堿基。核酸中的稀有堿基是核酸生物合成后修飾產物。RNA中，特別是tRNA中含有較多的稀有堿基如二氫尿嘧啶（D）、1-甲基次黃嘌呤（m1I）、次黃嘌呤（I）、假尿嘧啶（ψ）等。兩類核酸中除了以上各四種堿基的核苷酸外，還有一些其他修飾堿基嘌呤（Pu）嘧啶（Py）嘌呤（Pu）嘧啶（Py）（1）嘌呤堿（1）嘌呤堿生物化學第三章核酸的結構與功能課件（2）嘧啶堿（2）嘧啶堿4-硫尿嘧啶二氫尿嘧啶（D）4-硫尿嘧啶二氫尿嘧啶（D）生物化學第三章核酸的結構與功能課件生物化學第三章核酸的結構與功能課件（3）堿基的互變異構體（3）堿基的互變異構體酮式烯醇式互變異構酮式烯醇式互變異構胺式亞胺式互變異構胺式亞胺式互變異構3.1.3核苷戊糖和含氮堿生成的糖苷DNA含β-D-2-脫氧核糖RNA含β-D-核糖糖與堿基之間的C-N鍵：C-N糖苷鍵，且都是β糖苷鍵C1－N1（嘧啶）C1－N9（嘌呤）堿基與糖環(huán)平面垂直3.1.3核苷戊糖和含氮堿生成的糖苷（1）核苷（ribonucleoside）

嘌呤N-9或嘧啶N-1與核糖C-1＇通過β-N-糖苷鍵相連形成核苷：AR，GR，UR，CR（1）核苷（ribonucleoside）嘌呤N-（2）脫氧核苷（deoxyribonucleoside）嘌呤N-9或嘧啶N-1與脫氧核糖C-1＇通過β-N-糖苷鍵相連形成脫氧核苷：dAR，dGR，dTR，dCR（2）脫氧核苷（deoxyribonucleoside）生物化學第三章核酸的結構與功能課件（3）稀有核苷假尿苷，pseudouridine，ψ（3）稀有核苷假尿苷，pseudouridine，ψ3.1.4核苷酸核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核苷酸（脫氧核苷酸）核苷的磷酸酯，磷酸位于C－5＇核苷酸的組成：含氮堿基、戊糖和磷酸。核苷酸的其他形式多磷酸核苷（NDP、NTP），環(huán)化核苷酸（cAMP、cGMP等）輔酶或輔基（NAD、NADP、FAD、CoA等，均含有AMP）活性代謝物（UDPG、CDP-膽堿等）

3.1.4核苷酸核苷（脫氧核苷）和磷酸以磷酸酯鍵連接形成核生物化學第三章核酸的結構與功能課件5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷生物化學第三章核酸的結構與功能課件pA，pT，pG，pC，pU分別表示相應的5′-核苷酸除了5′-核苷酸外，還有3′-核苷酸用Ap，Tp，Gp，Cp，Up表示生物體內游離的2′-核苷酸較少，用Gp2′表示相應的2′-核苷酸pA，pT，pG，pC，pU分別表示相應的5′-核苷八種核苷酸腺嘌呤A鳥嘌呤G胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TRNA

AMPGMPCMPUMP未發(fā)現DNAdAMPdGMPdCMP未發(fā)現dTMPM/單，D/二，T/三；P-磷酸RNA的名稱為單/二/三苷酸，DNA在單/二/三前加脫氧兩字。如：AMP稱腺苷一磷酸（或腺苷酸）dAMP稱為脫氧腺苷一磷酸（脫氧腺苷酸）稀有核苷酸與上類似八種核苷酸腺嘌呤A鳥嘌呤G胞嘧啶C尿嘧啶U胸腺嘧啶TRNA生物化學第三章核酸的結構與功能課件核苷酸的其他形式cAMP3′,5′-環(huán)腺苷細胞間信使

cAMP

3′,5′-環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸

cGMP

3′,5′-環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸

cAMP和cGMP的環(huán)狀磷酯鍵是一個高能鍵：pH7.4時水解能約為43.9kJ/mol，比ATP水解能高得多。核苷酸的其他形式cAMP細胞間信使輔酶ⅠNAD+輔酶ⅡNADP+輔酶Ⅰ輔酶ⅡAMPADPATPAMPADPATPATP是重要的能量轉換中間體AT