分離分析新技術(shù)課件

分離分析新技術(shù)在天然藥物研究中的應(yīng)用

馬建蘋TelO)E-mail:majp326@

分離分析新技術(shù)在天然藥物研究中的應(yīng)用馬建蘋Tel:093超臨界流體萃取技術(shù)一.基本原理超臨界流體萃取技術(shù)一.基本原理1.超臨界流體的特性

相態(tài)性質(zhì)氣體超臨界流體液體密度(kg/m3)1.07.0102

1.0103黏度(Pa·s)10-6~10-510-510-4擴(kuò)散系數(shù)(m2/s)10-510-710-91.超臨界流體的特性(1)被提取物的性質(zhì)(2)壓力的影響(3)溫度的影響(4)夾帶劑的影響2.超臨界CO2流體的溶解性能(1)被提取物的性質(zhì)2.超臨界CO2流體的溶解性能3.超臨界CO2流體萃取的優(yōu)勢(shì)(1)防止熱敏性物質(zhì)可能產(chǎn)生的氧化和分解,保持各組分的原有特性。(2)無溶劑殘留問題。(3)實(shí)現(xiàn)選擇性提取。(4)提取較完全。(5)儀器聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)高效、快速、準(zhǔn)確分析。(6)CO2超臨界流體適合于工業(yè)化生產(chǎn)。3.超臨界CO2流體萃取的優(yōu)勢(shì)萃取釜減壓閥分離釜加壓泵4.超臨界CO2流體萃取設(shè)備簡(jiǎn)介萃取釜4.超臨界CO2流體萃取設(shè)備簡(jiǎn)介蜂膠的SFE純化流程蜂膠的SFE純化流程(1)萃取壓力(2)萃取溫度(3)CO2流量(4)萃取時(shí)間(5)粒度(6)夾帶劑二.超臨界CO2流體萃取工藝的影響因素(1)萃取壓力二.超臨界CO2流體萃取工藝的影響因素1.超臨界CO2流體萃取穿心蓮有效成分功效：清熱解毒、消腫止痛。有效成分：二萜內(nèi)酯類化合物(穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯)傳統(tǒng)方法：水提法：ChP1990淘汰醇提法：熱浸：得率較高、有效成分容易分解或聚合、雜質(zhì)較多冷浸：質(zhì)量較好、雜質(zhì)少、有效成分不分解、生產(chǎn)周期較長(zhǎng)超臨界CO2流體萃取法：所得有效成分含量較高、具有該藥的天然香味三.超臨界流體萃取在天然藥物提取中的應(yīng)用1.超臨界CO2流體萃取穿心蓮有效成分三.超臨界流體萃取在天穿心蓮不同提取方法所得浸膏的質(zhì)量比較質(zhì)量指標(biāo)超臨界CO2流體95%乙醇提取穿心蓮內(nèi)酯脫水穿心蓮內(nèi)酯總內(nèi)酯含量總內(nèi)酯提取率色澤氣味雜質(zhì)有效成分制藥干燥損失成藥中藥粉流動(dòng)性藥粉外觀藥粉氣味藥效19%12%42%98%墨綠色(原藥色)原藥香味少1/10好墨綠色、干爽、油脂多含原料藥香氣好、穩(wěn)定10%4%24%60%深棕色焦味多1/3差棕色、結(jié)塊、油脂少無差、不穩(wěn)定穿心蓮不同提取方法所得浸膏的質(zhì)量比較質(zhì)量指標(biāo)超臨界CO2流體2.揮發(fā)油的提取傳統(tǒng)提取方法的缺點(diǎn)：易造成揮發(fā)油的分解或氧化等；收率普遍較低實(shí)例：月見草油SFE提取,25MPa,50℃萃取率20%-亞麻酸10.6%

色澤與透明度

-亞麻酸杏仁油：SFE與石油醚提取工藝比較收油率是后者的2.5倍

薄荷揮發(fā)油：23MPa,55℃加7%乙醇夾帶劑薄荷醇收率0.16%

比水蒸汽蒸餾法高3倍比有機(jī)溶劑法高0.6倍

優(yōu)于溶劑法2.揮發(fā)油的提取優(yōu)于溶劑法四.超臨界流體萃取技術(shù)展望(1)成本上難以與傳統(tǒng)提取工藝競(jìng)爭(zhēng)(2)對(duì)許多強(qiáng)極性和分子量較大的成分很難進(jìn)行有效地提取(3)基礎(chǔ)研究比較薄弱(4)需要結(jié)合傳統(tǒng)中藥所要求的藥效來考察有效成分是否被萃取出及性能是否穩(wěn)定(5)考慮中藥成分的協(xié)同和互溶作用四.超臨界流體萃取技術(shù)展望(1)成本上難以與傳統(tǒng)提取工藝競(jìng)爭(zhēng)大孔樹脂吸附分離技術(shù)一.大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)、原理和特點(diǎn)1.大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)、原理及種類(1)結(jié)構(gòu)新型非離子型高分子聚合物吸附劑白色球形顆粒20-60目具多孔性聚合單體苯乙烯交聯(lián)劑二乙烯苯致孔劑甲苯、二甲苯(2)分離原理吸附性和篩選性相結(jié)合(3)大孔樹脂的種類按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為以下四類：非極性如苯乙烯、二乙烯苯聚合物中極性存在極性基團(tuán)－COOR,具有一定的極性極性含硫氧、酰胺、腈等基團(tuán)如丙烯酰胺極性大于酯基強(qiáng)極性如吡啶基、氨基等大孔樹脂吸附分離技術(shù)一.大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)、原理和特點(diǎn)1.

牌號(hào)生產(chǎn)廠結(jié)構(gòu)比表面積孔徑（nm）非極性AmberliteXAD-2羅姆－哈斯（美）PS3304.0AmberliteXAD-3羅姆－哈斯（美）PS5264.4AmberliteXAD-4羅姆－哈斯（美）PS7505.0ADS-5南開大學(xué)PS55020-25ADS-3南開大學(xué)PS10005-6AmberliteXAD-6羅姆－哈斯（美）-COOR4986.3AmberliteXAD-7羅姆－哈斯（美）-COOR4508.0ADS-8南開大學(xué)-COOR14025.0AmberliteXAD-9羅姆－哈斯（美）

AmberliteXAD-10羅姆－哈斯（美）2508.0ADS-16南開大學(xué)酰胺6935.2AmberliteXAD-11羅姆－哈斯（美）氧化氮類170AmberliteXAD-12羅姆－哈斯（美）氧化氮類2521.0ADS-7南開大學(xué)-NR200130一些代表性的大孔吸附樹脂牌號(hào)2.大孔吸附樹脂的特點(diǎn)(1)分離性能優(yōu)良選擇性良好分離效能高脫色能力強(qiáng)(2)理化性質(zhì)穩(wěn)定穩(wěn)定性高機(jī)械強(qiáng)度好經(jīng)久耐用避免環(huán)境污染和對(duì)設(shè)備的腐蝕(3)應(yīng)用范圍廣與離子交換樹脂相比

pH不變發(fā)酵液分離抗生素(4)使用方便流體阻力小(5)溶劑用量少避免乳化現(xiàn)象提高提取效率(6)可重復(fù)使用再生容易(7)其他方面價(jià)格較貴吸附效率易受流速和溶質(zhì)濃度的影響品種有限操作較復(fù)雜對(duì)樹脂的技術(shù)要求較高2.大孔吸附樹脂的特點(diǎn)二.大孔吸附樹脂吸附分離技術(shù)要求大致操作步驟：樹脂預(yù)處理－樹脂上柱－藥液上柱－樹脂的解吸－樹脂的清洗、再生樹脂預(yù)處理：加甲醇或丙酮浸泡24小時(shí)，加熱回流洗脫裝柱：蒸餾水濕法裝柱，乙醇流動(dòng)清洗，大量蒸餾水清洗二.大孔吸附樹脂吸附分離技術(shù)要求大致操作步驟：藥液的上柱吸附：（1）泄漏曲線與吸附容量的考察（2）藥液上柱前的預(yù)處理（3）上柱工藝條件的選擇樹脂自身特性、樣品濃度、pH值、吸附柱徑高比、上樣流速（4）樹脂的解吸樹脂的清洗、再生：無水乙醇或95％乙醇洗至無色，大量水洗去醇藥液的上柱吸附：三.大孔吸附樹脂技術(shù)在天然藥物提取純化中的應(yīng)用在天然藥物有效成分的提取、純化領(lǐng)域大有用途：1.許多提取成功的單味中草藥，奠定良好的基礎(chǔ)2.不斷有新型的吸附樹脂問世到目前為止,已成功用于黃酮類、皂苷類、生物堿類、酯類、萜類等成分的分離三.大孔吸附樹脂技術(shù)在天然藥物有效成分的提取、純化領(lǐng)域大有用1.黃酮類藥物的提取實(shí)例：銀杏葉提取物（GBE）

主要有效成分黃酮苷

萜內(nèi)酯

溶劑萃取法>24％>6％樹脂吸附法AmberliteXAD-7>30％未達(dá)標(biāo)

Duolite-761達(dá)標(biāo)達(dá)標(biāo)

ADS-F860~65％25~30％

其他中草藥：毛冬青根、山楂、葛根、黃芩根、苦蕎麥、沙棘等1.黃酮類藥物的提取實(shí)例：銀杏葉提取物（GBE）2.皂苷類藥物的提取實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷

研制出強(qiáng)極性吸附樹脂ADS-7、S-038S-038，吸附量達(dá)65.5mg/ml，70％乙醇洗脫

人參皂苷吸附和脫色雙重作用

ADS-7，70％乙醇洗脫，粗品（棕色）白色或微黃色2.皂苷類藥物的提取實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷

絞股藍(lán)：葫蘆科植物絞股藍(lán)的根狀莖或全草，多年生草質(zhì)藤本植物功效：鎮(zhèn)咳、清熱解毒有效成分：皂苷、黃酮類、多糖類“綠色的金子”“第二人參”“人參寶草”提取工藝：絞股藍(lán)干莖葉熱水浸提浸提除雜樹脂吸附乙醇解吸脫色濃縮干燥粉碎絞股藍(lán)皂苷粉末7-8倍熱水浸提三次調(diào)節(jié)酸堿性靜置除雜DA大孔樹脂水洗除雜50%乙醇70%乙醇DB樹脂真空干燥80-100目實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷7-8倍熱水調(diào)節(jié)酸堿性DA大孔樹脂50%乙3.生物堿的提取實(shí)例：喜樹堿

弱堿AB-8pH8，鹽濃度(1-2.5)mol/L,吸附量達(dá)160mg/g

小檗堿

堿性大水溶性大

10%H2SO4,10%NaOH,非極性吸附樹脂小檗堿含量為原生藥含量的97%3.生物堿的提取實(shí)例：喜樹堿小檗堿4.影響大孔樹脂分離純化天然藥物效果的因素(1)樹脂性質(zhì)吸附容量大吸附速度快機(jī)械強(qiáng)度好(2)藥液pH

酸性物質(zhì)易在酸性溶液中被吸附

堿性物質(zhì)在堿性溶液中被吸附(3)藥液濃度

符合Frendich和Augmur經(jīng)典吸附式

(4)上柱液溫度室溫(5)鹽濃度無機(jī)鹽的加入降低了吸附質(zhì)在介質(zhì)內(nèi)的溶解度(6)樹脂柱徑高比合適的徑高比為分離提供較高的柱效(7)樹脂柱的清洗

非吸附性成分水吸附性雜質(zhì)一定濃度的酸或堿液(0.1-1.0MNaOH或HCl)(8)洗脫液的選擇及解吸4.影響大孔樹脂分離純化天然藥物效果的因素(1)樹脂性質(zhì)制備色譜技術(shù)色譜技術(shù)：有效成分的定性與定量工作開發(fā)出療效好、質(zhì)量指標(biāo)明確的中藥新藥制備色譜技術(shù)色譜技術(shù)：一.色譜技術(shù)的基本原理按照分離過程的原理不同分為：吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜親和色譜一.色譜技術(shù)的基本原理按照分離過程的原理不同分為：二.制備色譜工藝流程單色譜柱：最簡(jiǎn)單、最為常用，能分離復(fù)雜組分的混合物溶劑消耗量大，回收溶劑的能耗高模擬移動(dòng)床色譜：分離效率高、溶劑消耗低、便于連續(xù)操作設(shè)備復(fù)雜、工藝要求高柱切換、移動(dòng)進(jìn)料和移動(dòng)接口色譜等：實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組分分離、大大提高吸附劑生產(chǎn)率、減少溶劑消耗、減少設(shè)備投資和操作費(fèi)用二.制備色譜工藝流程三.常用的制備色譜工藝1.薄層色譜

操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、應(yīng)用廣泛新型薄層色譜法離心制備薄層色譜（PCLC）旋轉(zhuǎn)離心、連續(xù)洗脫的圓形色譜技術(shù)，分離效果優(yōu)于常規(guī)的制備薄層色譜和柱色譜獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：對(duì)固定相不會(huì)造成損壞裝填容量、分離速度和分離效能得到極大提高實(shí)例：龍膽屬植物Sstrictiffora

甲醇提取物

bellidifolin和desmethylbellidifolin

離心薄層色譜法聚酰胺開口柱色譜

30min.12hr.三.常用的制備色譜工藝1.薄層色譜實(shí)例：龍膽屬植物Sstr2.柱色譜特殊的柱色譜：（1）干柱色譜干法裝填－上樣－洗脫－推出、切割－譜帶溶劑萃取特點(diǎn)：溶劑消耗很少，操作迅速（15～30min）（2）真空液相色譜(VLC)抽真空裝柱－低極性溶劑沖柱－上樣－洗脫－收集餾分、抽干特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、處理量大（一次可達(dá)30g）2.柱色譜3.壓力液相色譜(PLC)閃蒸色譜(約0.2MPa)

價(jià)格低廉、操作方便低壓液相色譜(<0.5MPa)

負(fù)荷量克級(jí)、分辨率有時(shí)與HPLC接近中壓液相色譜(0.5～2.0MPa)負(fù)荷量1～100g、分離時(shí)間短、適宜工業(yè)化高壓液相色譜(>2.0MPa)

分離效率高、應(yīng)用范圍廣實(shí)例：銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、白果內(nèi)酯的分離純化硅膠H柱(10-40m)流動(dòng)相：乙酸乙酯－石油醚（8：2）(5)超臨界流體色譜介于液相色譜和氣相色譜之間的色譜方法特點(diǎn)：分離速度快、產(chǎn)品易回收、應(yīng)用范圍廣、有可能替代正相HPLC3.壓力液相色譜(PLC)4.離子交換色譜固定相：離子交換樹脂可再生性和重復(fù)使用性交換功能基團(tuán)：陽(yáng)離子和陰離子形態(tài)：凝膠型（水溶脹）和大孔型（永久性微孔）特點(diǎn)：使用方便、成本低廉、重復(fù)使用性好、分離速度快應(yīng)用范圍：生物堿、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)以及核酸實(shí)例：總生物堿制備生藥粗粉－0.1%HCl滲漉－強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂－蒸餾水洗樹脂倒出晾干－10%NaOH堿化樹脂－氯仿回流－干燥－重結(jié)晶

4.離子交換色譜5.逆流色譜

(CCC)以液相物質(zhì)為固定相的液－液色譜離心逆流色譜(CCCC)：（1）分離物質(zhì)的極性范圍很寬（2）沒有拖尾現(xiàn)象（3）樣品定量回收實(shí)例：銀杏葉中的黃酮糖苷

固定相：水，流動(dòng)相：乙酸乙酯－乙酸乙酯（異丁醇）－乙酸乙酯/異丁醇(6:4)高速逆流色譜(HSCCC)5.逆流色譜(CCC)6.其他形式色譜體積排阻色譜分子篩機(jī)理凝膠過濾色譜凝膠滲透色譜優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、快捷、流動(dòng)相選擇寬泛(2)親和色譜大多被利用來分離純化生物大分子載體：瓊脂糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠(3)疏水作用色譜主要分離對(duì)象為蛋白質(zhì)特點(diǎn)：分離條件溫和，易于保持生物蛋白質(zhì)的活性6.其他形式色譜7.多種色譜方法的聯(lián)用最初分離步驟：如閃蒸色譜、逆流色譜或凝膠過濾色譜等最后的純化過程：如HPLC實(shí)例：生物堿

液相色譜法－排阻色譜法7.多種色譜方法的聯(lián)用實(shí)例：水飛薊黃酮的提取

水飛薊：也叫乳薊，菊科植物，一年或兩年生草本功效：抗肝臟中毒和保護(hù)肝細(xì)胞有效成分：水飛薊素提取工藝：水飛薊種子去油種子餅去油種子渣過濾提取液濃縮總黃酮油液總黃酮溶解上柱洗脫濃縮干燥水飛薊素機(jī)械榨油粉碎提取4次每次4h分離植物油丙酮硅膠柱實(shí)例：水飛薊黃酮的提取機(jī)械榨油粉碎提取4次分離植物油丙酮硅四.制備色譜技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵：色譜過程放大和操作最優(yōu)化柱色譜：分辯率高、結(jié)合容量大、成本低、放大快速簡(jiǎn)便現(xiàn)有色譜分離工藝70％連續(xù)性色譜技術(shù)：移動(dòng)床色譜、環(huán)形色譜、錯(cuò)流梯度色譜模擬流動(dòng)床SMB：特點(diǎn)：設(shè)備結(jié)構(gòu)小、放大快速簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高和生產(chǎn)能力大四.制備色譜技術(shù)的發(fā)展指紋圖譜技術(shù)一.概述1.中藥指紋圖譜：

運(yùn)用光譜、色譜、X-射線衍射或各種技術(shù)的聯(lián)用等現(xiàn)代分析技術(shù)，對(duì)中藥化學(xué)信息通過色譜圖（液相色譜圖、氣相色譜圖或薄層色譜圖等）方式進(jìn)行表征，并通過計(jì)算、分析、比較、評(píng)價(jià)等過程，以技術(shù)參數(shù)、指紋特征等加以說明。制備－分析－比較－評(píng)價(jià)－校驗(yàn)指紋圖譜技術(shù)一.概述分析圖譜：準(zhǔn)確的辨認(rèn)√精密的測(cè)量×比較圖譜：相似√相同×評(píng)價(jià)結(jié)果：模糊屬性√求索細(xì)枝末節(jié)×

分析比較的結(jié)果：對(duì)差異性或一致性作出評(píng)價(jià)分析圖譜：準(zhǔn)確的辨認(rèn)√精密的測(cè)量×2.中藥指紋圖譜的分類：狹義：中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜廣義：

中藥材（原料藥材）指紋圖譜應(yīng)用對(duì)象中藥原料藥（包括飲片、配伍顆粒）指紋圖譜中藥制劑指紋圖譜中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜最主要、常用中藥HPLC指紋測(cè)定手段中藥生物指紋圖譜2.中藥指紋圖譜的分類：3.中藥指紋圖譜研究的目的及意義：目的：（1）對(duì)中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充和提高（2）控制中間體、成品的一致性，減少批間差異意義：中藥現(xiàn)代化表征中藥有效物質(zhì)的整體性和復(fù)雜性推動(dòng)中藥新藥研究開發(fā)和傳統(tǒng)產(chǎn)品的二次開發(fā)3.中藥指紋圖譜研究的目的及意義：4.中藥指紋圖譜建立的原則：系統(tǒng)化學(xué)成分研究和相同的藥理學(xué)研究為依托系統(tǒng)性：應(yīng)包括中藥有效部位所含大部分成分的種類，或指標(biāo)成分的全部

如：中藥人參皂苷類成分銀杏葉黃酮類和銀杏內(nèi)酯類特征性：化學(xué)成分信息具有高度選擇性，區(qū)分中藥的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，成為“化學(xué)條碼”

如：五味子已知木脂素未知木脂素成分之間的順序、比值重現(xiàn)性：在規(guī)定的方法和條件下，不同操作者和不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能做出指紋圖譜4.中藥指紋圖譜建立的原則：二.中藥指紋圖譜的建立1.指紋圖譜測(cè)定方法的選定色譜法：TLC、HPLC、GC、CE光譜法：UV、IR、NIR其他方法：X射線衍射法、NMR及聯(lián)用技術(shù)等HPLC法最常用，具有如下特點(diǎn)：

分離效能高選擇性高檢測(cè)靈敏度高分析速度快應(yīng)用范圍廣二.中藥指紋圖譜的建立1.指紋圖譜測(cè)定方法的選定HPLC指紋圖譜測(cè)定方法的選定研究對(duì)象的確定及預(yù)處理

文獻(xiàn)調(diào)研，確定分析檢測(cè)目標(biāo)例如：黃芪含黃酮、皂苷及多糖三類有效成分

黃芪多糖注射液多糖

原藥材黃酮、皂苷及多糖復(fù)方：君臣佐使供試品的制備例如：黃芪黃酮堿水萃取皂苷大孔樹脂吸附除雜，避免干擾或?qū)ιV柱的損耗色譜條件選擇最重要、關(guān)鍵性流動(dòng)相：對(duì)樣品有一定溶解度、適用于使用的監(jiān)測(cè)器、化學(xué)惰性好、低黏度、低沸點(diǎn)純度高、安全、毒性低、環(huán)境友好改性劑、助溶劑（異丙醇、四氫呋喃、氯仿）、梯度洗脫檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、色譜柱、進(jìn)樣量、檢測(cè)器黃酮類、酚酸類乙腈－水－酸系統(tǒng)皂苷類乙腈－水系統(tǒng)生物堿類乙腈－三乙胺系統(tǒng)HPLC指紋圖譜測(cè)定方法的選定研究對(duì)象的確定及預(yù)處理黃酮類、2.色譜條件的優(yōu)化及規(guī)范化

(1)

樣品中所有組分能被檢出或檢出組分?jǐn)?shù)目盡可能多

(2)各組分達(dá)到滿意的分離度

(3)分析時(shí)間短優(yōu)化：流動(dòng)相組成、濃度、值、添加劑規(guī)范化：色譜柱、試劑、儀器操作參數(shù)固定，可重現(xiàn)3.指紋圖譜的信息化和知識(shí)化指紋圖譜信息化指紋圖譜知識(shí)化4.指紋圖譜的建立與辨認(rèn)2.色譜條件的優(yōu)化及規(guī)范化三.中藥指紋圖譜的應(yīng)用1.丹參藥材指紋圖譜研究

有效成分：

水溶性

丹參素、原兒茶醛、原兒茶酸、丹參素丙、丹參酸乙、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參酸A、3,4-二羥基桂皮酸、-谷甾醇-葡萄糖苷、異阿魏酸、原紫草素、紫草酸

脂溶性成分丹參酮類（丹參酮ⅡA）(1)供試品的制備水提?。峄宜嵋阴ポ腿。瓩z測(cè)方法簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好(2)參照物的制備主成分：原兒茶醛作參照物檢測(cè)方法

流動(dòng)相的選擇甲醇-0.1%冰乙酸（5:95）檢測(cè)波長(zhǎng)254nm

穩(wěn)定性及精密度試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.0%

重現(xiàn)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.0%三.中藥指紋圖譜的應(yīng)用1.丹參藥材指紋圖譜研究

(4)丹參原藥材HPLC指紋圖譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：填充劑ODS

流動(dòng)相甲醇-0.1%(5:95)

檢測(cè)波長(zhǎng)254nm

柱溫室溫流速1.0mL/min

參照物溶液的制備精密稱取對(duì)照品2.0mg，5mL定容供試品溶液的制備藥材粉碎過篩－加熱回流－濾液酸化－乙酸乙酯萃?。瓪?jiān)状既芙鉁y(cè)定法進(jìn)樣量10L記錄1h(4)丹參原藥材HPLC指紋圖譜檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)danshensuprotocatechuicacidprotocatechuicaldehydratecaffeicacidrosmarinicacidlithospermicacidsalvianolicacidBsalvianolicacidAsalvianolicacidC.danshensu相對(duì)保留時(shí)間/min0.150.3680.4370.4950.5911.000(S)特征指紋峰積分相對(duì)比值0.15230%0.720.19130%0.29725%0.0461.000(S)相對(duì)保留時(shí)間/min1.1431.3931.6272.5852.9113.968特征指紋峰積分相對(duì)比值0.0590.0380.1390.35425%0.41125%0.054丹參原藥材HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)相對(duì)保留時(shí)間/min0.150.3680.4370.4950三.中藥指紋圖譜的應(yīng)用2.冬蟲夏草原藥材指紋圖譜研究有效成分：核苷類、甾醇類及多糖三.中藥指紋圖譜的應(yīng)用2.冬蟲夏草原藥材指紋圖譜研究分離分析新技術(shù)課件分離分析新技術(shù)在天然藥物研究中的應(yīng)用

馬建蘋TelO)E-mail:majp326@

分離分析新技術(shù)在天然藥物研究中的應(yīng)用馬建蘋Tel:093超臨界流體萃取技術(shù)一.基本原理超臨界流體萃取技術(shù)一.基本原理1.超臨界流體的特性

相態(tài)性質(zhì)氣體超臨界流體液體密度(kg/m3)1.07.0102

1.0103黏度(Pa·s)10-6~10-510-510-4擴(kuò)散系數(shù)(m2/s)10-510-710-91.超臨界流體的特性(1)被提取物的性質(zhì)(2)壓力的影響(3)溫度的影響(4)夾帶劑的影響2.超臨界CO2流體的溶解性能(1)被提取物的性質(zhì)2.超臨界CO2流體的溶解性能3.超臨界CO2流體萃取的優(yōu)勢(shì)(1)防止熱敏性物質(zhì)可能產(chǎn)生的氧化和分解,保持各組分的原有特性。(2)無溶劑殘留問題。(3)實(shí)現(xiàn)選擇性提取。(4)提取較完全。(5)儀器聯(lián)用,實(shí)現(xiàn)高效、快速、準(zhǔn)確分析。(6)CO2超臨界流體適合于工業(yè)化生產(chǎn)。3.超臨界CO2流體萃取的優(yōu)勢(shì)萃取釜減壓閥分離釜加壓泵4.超臨界CO2流體萃取設(shè)備簡(jiǎn)介萃取釜4.超臨界CO2流體萃取設(shè)備簡(jiǎn)介蜂膠的SFE純化流程蜂膠的SFE純化流程(1)萃取壓力(2)萃取溫度(3)CO2流量(4)萃取時(shí)間(5)粒度(6)夾帶劑二.超臨界CO2流體萃取工藝的影響因素(1)萃取壓力二.超臨界CO2流體萃取工藝的影響因素1.超臨界CO2流體萃取穿心蓮有效成分功效：清熱解毒、消腫止痛。有效成分：二萜內(nèi)酯類化合物(穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯、去氧穿心蓮內(nèi)酯)傳統(tǒng)方法：水提法：ChP1990淘汰醇提法：熱浸：得率較高、有效成分容易分解或聚合、雜質(zhì)較多冷浸：質(zhì)量較好、雜質(zhì)少、有效成分不分解、生產(chǎn)周期較長(zhǎng)超臨界CO2流體萃取法：所得有效成分含量較高、具有該藥的天然香味三.超臨界流體萃取在天然藥物提取中的應(yīng)用1.超臨界CO2流體萃取穿心蓮有效成分三.超臨界流體萃取在天穿心蓮不同提取方法所得浸膏的質(zhì)量比較質(zhì)量指標(biāo)超臨界CO2流體95%乙醇提取穿心蓮內(nèi)酯脫水穿心蓮內(nèi)酯總內(nèi)酯含量總內(nèi)酯提取率色澤氣味雜質(zhì)有效成分制藥干燥損失成藥中藥粉流動(dòng)性藥粉外觀藥粉氣味藥效19%12%42%98%墨綠色(原藥色)原藥香味少1/10好墨綠色、干爽、油脂多含原料藥香氣好、穩(wěn)定10%4%24%60%深棕色焦味多1/3差棕色、結(jié)塊、油脂少無差、不穩(wěn)定穿心蓮不同提取方法所得浸膏的質(zhì)量比較質(zhì)量指標(biāo)超臨界CO2流體2.揮發(fā)油的提取傳統(tǒng)提取方法的缺點(diǎn)：易造成揮發(fā)油的分解或氧化等；收率普遍較低實(shí)例：月見草油SFE提取,25MPa,50℃萃取率20%-亞麻酸10.6%

色澤與透明度

-亞麻酸杏仁油：SFE與石油醚提取工藝比較收油率是后者的2.5倍

薄荷揮發(fā)油：23MPa,55℃加7%乙醇夾帶劑薄荷醇收率0.16%

比水蒸汽蒸餾法高3倍比有機(jī)溶劑法高0.6倍

優(yōu)于溶劑法2.揮發(fā)油的提取優(yōu)于溶劑法四.超臨界流體萃取技術(shù)展望(1)成本上難以與傳統(tǒng)提取工藝競(jìng)爭(zhēng)(2)對(duì)許多強(qiáng)極性和分子量較大的成分很難進(jìn)行有效地提取(3)基礎(chǔ)研究比較薄弱(4)需要結(jié)合傳統(tǒng)中藥所要求的藥效來考察有效成分是否被萃取出及性能是否穩(wěn)定(5)考慮中藥成分的協(xié)同和互溶作用四.超臨界流體萃取技術(shù)展望(1)成本上難以與傳統(tǒng)提取工藝競(jìng)爭(zhēng)大孔樹脂吸附分離技術(shù)一.大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)、原理和特點(diǎn)1.大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)、原理及種類(1)結(jié)構(gòu)新型非離子型高分子聚合物吸附劑白色球形顆粒20-60目具多孔性聚合單體苯乙烯交聯(lián)劑二乙烯苯致孔劑甲苯、二甲苯(2)分離原理吸附性和篩選性相結(jié)合(3)大孔樹脂的種類按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為以下四類：非極性如苯乙烯、二乙烯苯聚合物中極性存在極性基團(tuán)－COOR,具有一定的極性極性含硫氧、酰胺、腈等基團(tuán)如丙烯酰胺極性大于酯基強(qiáng)極性如吡啶基、氨基等大孔樹脂吸附分離技術(shù)一.大孔吸附樹脂的結(jié)構(gòu)、原理和特點(diǎn)1.

牌號(hào)生產(chǎn)廠結(jié)構(gòu)比表面積孔徑（nm）非極性AmberliteXAD-2羅姆－哈斯（美）PS3304.0AmberliteXAD-3羅姆－哈斯（美）PS5264.4AmberliteXAD-4羅姆－哈斯（美）PS7505.0ADS-5南開大學(xué)PS55020-25ADS-3南開大學(xué)PS10005-6AmberliteXAD-6羅姆－哈斯（美）-COOR4986.3AmberliteXAD-7羅姆－哈斯（美）-COOR4508.0ADS-8南開大學(xué)-COOR14025.0AmberliteXAD-9羅姆－哈斯（美）

AmberliteXAD-10羅姆－哈斯（美）2508.0ADS-16南開大學(xué)酰胺6935.2AmberliteXAD-11羅姆－哈斯（美）氧化氮類170AmberliteXAD-12羅姆－哈斯（美）氧化氮類2521.0ADS-7南開大學(xué)-NR200130一些代表性的大孔吸附樹脂牌號(hào)2.大孔吸附樹脂的特點(diǎn)(1)分離性能優(yōu)良選擇性良好分離效能高脫色能力強(qiáng)(2)理化性質(zhì)穩(wěn)定穩(wěn)定性高機(jī)械強(qiáng)度好經(jīng)久耐用避免環(huán)境污染和對(duì)設(shè)備的腐蝕(3)應(yīng)用范圍廣與離子交換樹脂相比

pH不變發(fā)酵液分離抗生素(4)使用方便流體阻力小(5)溶劑用量少避免乳化現(xiàn)象提高提取效率(6)可重復(fù)使用再生容易(7)其他方面價(jià)格較貴吸附效率易受流速和溶質(zhì)濃度的影響品種有限操作較復(fù)雜對(duì)樹脂的技術(shù)要求較高2.大孔吸附樹脂的特點(diǎn)二.大孔吸附樹脂吸附分離技術(shù)要求大致操作步驟：樹脂預(yù)處理－樹脂上柱－藥液上柱－樹脂的解吸－樹脂的清洗、再生樹脂預(yù)處理：加甲醇或丙酮浸泡24小時(shí)，加熱回流洗脫裝柱：蒸餾水濕法裝柱，乙醇流動(dòng)清洗，大量蒸餾水清洗二.大孔吸附樹脂吸附分離技術(shù)要求大致操作步驟：藥液的上柱吸附：（1）泄漏曲線與吸附容量的考察（2）藥液上柱前的預(yù)處理（3）上柱工藝條件的選擇樹脂自身特性、樣品濃度、pH值、吸附柱徑高比、上樣流速（4）樹脂的解吸樹脂的清洗、再生：無水乙醇或95％乙醇洗至無色，大量水洗去醇藥液的上柱吸附：三.大孔吸附樹脂技術(shù)在天然藥物提取純化中的應(yīng)用在天然藥物有效成分的提取、純化領(lǐng)域大有用途：1.許多提取成功的單味中草藥，奠定良好的基礎(chǔ)2.不斷有新型的吸附樹脂問世到目前為止,已成功用于黃酮類、皂苷類、生物堿類、酯類、萜類等成分的分離三.大孔吸附樹脂技術(shù)在天然藥物有效成分的提取、純化領(lǐng)域大有用1.黃酮類藥物的提取實(shí)例：銀杏葉提取物（GBE）

主要有效成分黃酮苷

萜內(nèi)酯

溶劑萃取法>24％>6％樹脂吸附法AmberliteXAD-7>30％未達(dá)標(biāo)

Duolite-761達(dá)標(biāo)達(dá)標(biāo)

ADS-F860~65％25~30％

其他中草藥：毛冬青根、山楂、葛根、黃芩根、苦蕎麥、沙棘等1.黃酮類藥物的提取實(shí)例：銀杏葉提取物（GBE）2.皂苷類藥物的提取實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷

研制出強(qiáng)極性吸附樹脂ADS-7、S-038S-038，吸附量達(dá)65.5mg/ml，70％乙醇洗脫

人參皂苷吸附和脫色雙重作用

ADS-7，70％乙醇洗脫，粗品（棕色）白色或微黃色2.皂苷類藥物的提取實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷

絞股藍(lán)：葫蘆科植物絞股藍(lán)的根狀莖或全草，多年生草質(zhì)藤本植物功效：鎮(zhèn)咳、清熱解毒有效成分：皂苷、黃酮類、多糖類“綠色的金子”“第二人參”“人參寶草”提取工藝：絞股藍(lán)干莖葉熱水浸提浸提除雜樹脂吸附乙醇解吸脫色濃縮干燥粉碎絞股藍(lán)皂苷粉末7-8倍熱水浸提三次調(diào)節(jié)酸堿性靜置除雜DA大孔樹脂水洗除雜50%乙醇70%乙醇DB樹脂真空干燥80-100目實(shí)例：絞股藍(lán)皂苷7-8倍熱水調(diào)節(jié)酸堿性DA大孔樹脂50%乙3.生物堿的提取實(shí)例：喜樹堿

弱堿AB-8pH8，鹽濃度(1-2.5)mol/L,吸附量達(dá)160mg/g

小檗堿

堿性大水溶性大

10%H2SO4,10%NaOH,非極性吸附樹脂小檗堿含量為原生藥含量的97%3.生物堿的提取實(shí)例：喜樹堿小檗堿4.影響大孔樹脂分離純化天然藥物效果的因素(1)樹脂性質(zhì)吸附容量大吸附速度快機(jī)械強(qiáng)度好(2)藥液pH

酸性物質(zhì)易在酸性溶液中被吸附

堿性物質(zhì)在堿性溶液中被吸附(3)藥液濃度

符合Frendich和Augmur經(jīng)典吸附式

(4)上柱液溫度室溫(5)鹽濃度無機(jī)鹽的加入降低了吸附質(zhì)在介質(zhì)內(nèi)的溶解度(6)樹脂柱徑高比合適的徑高比為分離提供較高的柱效(7)樹脂柱的清洗

非吸附性成分水吸附性雜質(zhì)一定濃度的酸或堿液(0.1-1.0MNaOH或HCl)(8)洗脫液的選擇及解吸4.影響大孔樹脂分離純化天然藥物效果的因素(1)樹脂性質(zhì)制備色譜技術(shù)色譜技術(shù)：有效成分的定性與定量工作開發(fā)出療效好、質(zhì)量指標(biāo)明確的中藥新藥制備色譜技術(shù)色譜技術(shù)：一.色譜技術(shù)的基本原理按照分離過程的原理不同分為：吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜親和色譜一.色譜技術(shù)的基本原理按照分離過程的原理不同分為：二.制備色譜工藝流程單色譜柱：最簡(jiǎn)單、最為常用，能分離復(fù)雜組分的混合物溶劑消耗量大，回收溶劑的能耗高模擬移動(dòng)床色譜：分離效率高、溶劑消耗低、便于連續(xù)操作設(shè)備復(fù)雜、工藝要求高柱切換、移動(dòng)進(jìn)料和移動(dòng)接口色譜等：實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組分分離、大大提高吸附劑生產(chǎn)率、減少溶劑消耗、減少設(shè)備投資和操作費(fèi)用二.制備色譜工藝流程三.常用的制備色譜工藝1.薄層色譜

操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低廉、應(yīng)用廣泛新型薄層色譜法離心制備薄層色譜（PCLC）旋轉(zhuǎn)離心、連續(xù)洗脫的圓形色譜技術(shù)，分離效果優(yōu)于常規(guī)的制備薄層色譜和柱色譜獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：對(duì)固定相不會(huì)造成損壞裝填容量、分離速度和分離效能得到極大提高實(shí)例：龍膽屬植物Sstrictiffora

甲醇提取物

bellidifolin和desmethylbellidifolin

離心薄層色譜法聚酰胺開口柱色譜

30min.12hr.三.常用的制備色譜工藝1.薄層色譜實(shí)例：龍膽屬植物Sstr2.柱色譜特殊的柱色譜：（1）干柱色譜干法裝填－上樣－洗脫－推出、切割－譜帶溶劑萃取特點(diǎn)：溶劑消耗很少，操作迅速（15～30min）（2）真空液相色譜(VLC)抽真空裝柱－低極性溶劑沖柱－上樣－洗脫－收集餾分、抽干特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、處理量大（一次可達(dá)30g）2.柱色譜3.壓力液相色譜(PLC)閃蒸色譜(約0.2MPa)

價(jià)格低廉、操作方便低壓液相色譜(<0.5MPa)

負(fù)荷量克級(jí)、分辨率有時(shí)與HPLC接近中壓液相色譜(0.5～2.0MPa)負(fù)荷量1～100g、分離時(shí)間短、適宜工業(yè)化高壓液相色譜(>2.0MPa)

分離效率高、應(yīng)用范圍廣實(shí)例：銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、白果內(nèi)酯的分離純化硅膠H柱(10-40m)流動(dòng)相：乙酸乙酯－石油醚（8：2）(5)超臨界流體色譜介于液相色譜和氣相色譜之間的色譜方法特點(diǎn)：分離速度快、產(chǎn)品易回收、應(yīng)用范圍廣、有可能替代正相HPLC3.壓力液相色譜(PLC)4.離子交換色譜固定相：離子交換樹脂可再生性和重復(fù)使用性交換功能基團(tuán)：陽(yáng)離子和陰離子形態(tài)：凝膠型（水溶脹）和大孔型（永久性微孔）特點(diǎn)：使用方便、成本低廉、重復(fù)使用性好、分離速度快應(yīng)用范圍：生物堿、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)以及核酸實(shí)例：總生物堿制備生藥粗粉－0.1%HCl滲漉－強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂－蒸餾水洗樹脂倒出晾干－10%NaOH堿化樹脂－氯仿回流－干燥－重結(jié)晶

4.離子交換色譜5.逆流色譜

(CCC)以液相物質(zhì)為固定相的液－液色譜離心逆流色譜(CCCC)：（1）分離物質(zhì)的極性范圍很寬（2）沒有拖尾現(xiàn)象（3）樣品定量回收實(shí)例：銀杏葉中的黃酮糖苷

固定相：水，流動(dòng)相：乙酸乙酯－乙酸乙酯（異丁醇）－乙酸乙酯/異丁醇(6:4)高速逆流色譜(HSCCC)5.逆流色譜(CCC)6.其他形式色譜體積排阻色譜分子篩機(jī)理凝膠過濾色譜凝膠滲透色譜優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、快捷、流動(dòng)相選擇寬泛(2)親和色譜大多被利用來分離純化生物大分子載體：瓊脂糖凝膠、交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠(3)疏水作用色譜主要分離對(duì)象為蛋白質(zhì)特點(diǎn)：分離條件溫和，易于保持生物蛋白質(zhì)的活性6.其他形式色譜7.多種色譜方法的聯(lián)用最初分離步驟：如閃蒸色譜、逆流色譜或凝膠過濾色譜等最后的純化過程：如HPLC實(shí)例：生物堿

液相色譜法－排阻色譜法7.多種色譜方法的聯(lián)用實(shí)例：水飛薊黃酮的提取

水飛薊：也叫乳薊，菊科植物，一年或兩年生草本功效：抗肝臟中毒和保護(hù)肝細(xì)胞有效成分：水飛薊素提取工藝：水飛薊種子去油種子餅去油種子渣過濾提取液濃縮總黃酮油液總黃酮溶解上柱洗脫濃縮干燥水飛薊素機(jī)械榨油粉碎提取4次每次4h分離植物油丙酮硅膠柱實(shí)例：水飛薊黃酮的提取機(jī)械榨油粉碎提取4次分離植物油丙酮硅四.制備色譜技術(shù)的發(fā)展關(guān)鍵：色譜過程放大和操作最優(yōu)化柱色譜：分辯率高、結(jié)合容量大、成本低、放大快速簡(jiǎn)便現(xiàn)有色譜分離工藝70％連續(xù)性色譜技術(shù)：移動(dòng)床色譜、環(huán)形色譜、錯(cuò)流梯度色譜模擬流動(dòng)床SMB：特點(diǎn)：設(shè)備結(jié)構(gòu)小、放大快速簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高和生產(chǎn)能力大四.制備色譜技術(shù)的發(fā)展指紋圖譜技術(shù)一.概述1.中藥指紋圖譜：

運(yùn)用光譜、色譜、X-射線衍射或各種技術(shù)的聯(lián)用等現(xiàn)代分析技術(shù)，對(duì)中藥化學(xué)信息通過色譜圖（液相色譜圖、氣相色譜圖或薄層色譜圖等）方式進(jìn)行表征，并通過計(jì)算、分析、比較、評(píng)價(jià)等過程，以技術(shù)參數(shù)、指紋特征等加以說明。制備－分析－比較－評(píng)價(jià)－校驗(yàn)指紋圖譜技術(shù)一.概述分析圖譜：準(zhǔn)確的辨認(rèn)√精密的測(cè)量×比較圖譜：相似√相同×評(píng)價(jià)結(jié)果：模糊屬性√求索細(xì)枝末節(jié)×

分析比較的結(jié)果：對(duì)差異性或一致性作出評(píng)價(jià)分析圖譜：準(zhǔn)確的辨認(rèn)√精密的測(cè)量×2.中藥指紋圖譜的分類：狹義：中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜廣義：

中藥材（原料藥材）指紋圖譜應(yīng)用對(duì)象中藥原料藥（包括飲片、配伍顆粒）指紋圖譜中藥制劑指紋圖譜中藥化學(xué)（成分）指紋圖譜最主要、常用中藥HPLC指紋測(cè)定手段中藥生物指紋圖譜2.中藥指紋圖譜的分類：3.中藥指紋圖譜研究的目的及意義：目的：（1）對(duì)中藥質(zhì)量控制的補(bǔ)充和提高（2）控制中間體、成品的一致性，減少批間差異意義：中藥現(xiàn)代化表征中藥有效物質(zhì)的整體性和復(fù)雜性推動(dòng)中藥新藥研究開發(fā)和傳統(tǒng)產(chǎn)品的二次開發(fā)3.中藥指紋圖譜研究的目的及意義：4.中藥指紋圖譜建立的原則：系統(tǒng)化學(xué)成分研究和相同的藥理學(xué)研究為依托系統(tǒng)性：應(yīng)包括中藥有效部位所含大部分成分的種類，或指標(biāo)成分的全部

如：中藥人參皂苷類成分