激光共聚焦掃描顯微鏡LSCM課件

激光共聚焦掃描顯微鏡

Laserscanningconfocalmicroscope基本內(nèi)容1.典型產(chǎn)品2.基本組成3.優(yōu)點(diǎn)4.共聚焦的原理5.掃描模式6.整體結(jié)構(gòu)7.應(yīng)用1.典型產(chǎn)品Nikon的EclipseC1Plus2.基本組成一、基本組成（一）激光器:多線氬離子(458nm,488nm,514nm)、氦氖綠(543nm)、氦氖紅(633nm)（二）掃描器(內(nèi)裝有針孔光欄、分光鏡、發(fā)射熒光單色器及檢測(cè)器)（三）光學(xué)裝置：根據(jù)樣品中熒光信號(hào)的強(qiáng)弱、大小及分布，調(diào)節(jié)激光能量、檢測(cè)孔光欄、光電倍增管（PMT）的檢測(cè)范圍、物鏡和電子放大倍數(shù)（zoom），以利于采集各種熒光信號(hào)。（四）計(jì)算機(jī)圖像存儲(chǔ)與處理及控制系統(tǒng)：實(shí)現(xiàn)了圖像的優(yōu)化、三維重建，實(shí)現(xiàn)了全自動(dòng)程序化控制采集（檢測(cè)）樣品熒光圖像的時(shí)間和空間，并和同時(shí)采集樣品中多重?zé)晒庑盘?hào)的分解及合成圖像，對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定。3.優(yōu)點(diǎn)一.分辨率（0.18μm）二.可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)三.無(wú)損傷、連續(xù)光學(xué)切片四.光譜掃描（分辨由光源波長(zhǎng)，物鏡參數(shù)和針孔直徑等決定，如60X，NA1.4的物鏡水平分辨率約為0.2μm，垂直分辨率約為0.5μm。）（細(xì)菌細(xì)胞1-2

μm，原核生物細(xì)胞1-10μm）優(yōu)點(diǎn)4.共聚焦原理利用照明針孔和探測(cè)針孔實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和探測(cè)，并且被探測(cè)點(diǎn)位于焦平面。照明針孔與探測(cè)針孔對(duì)被照射點(diǎn)或被探測(cè)點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的，因此被探測(cè)點(diǎn)即共焦點(diǎn)。共聚焦原理1.點(diǎn)照明（為作圖方便已將光線發(fā)散角放大）共聚焦原理消除衍射影響消除背景雜光共聚焦原理焦平面上的像是最清晰的，從上面的圖可以看出，非焦平面點(diǎn)所成的像的光像被探測(cè)針孔擋住，不會(huì)進(jìn)入光探頭，所以焦平面點(diǎn)成像使像更清晰。共聚焦原理所以共聚焦成像方式可以很大的提高分辨率和成像質(zhì)量。5.掃描模式一.X—Y軸掃描二.Z軸掃描X—Y軸掃描（1）單光束掃描模式其中最常見(jiàn)的掃描安排結(jié)合了兩個(gè)獨(dú)立的掃描鏡，具有中繼光學(xué)系統(tǒng)。移動(dòng)的垂直軸的反射鏡即在試樣上產(chǎn)生X—Y平面的掃描。但中間需要增加高級(jí)別的像差校正光學(xué)系統(tǒng)，導(dǎo)致發(fā)光效率降低。X—Y軸掃描（1）單光束掃描模式X—Y軸掃描（2）多光束掃描X—Y軸掃描奧林巴斯FluoView300激光共聚焦掃描系統(tǒng)Z軸掃描通常的方法是通過(guò)計(jì)算機(jī)控制的馬達(dá)以預(yù)先設(shè)定的步距移動(dòng)顯微鏡的鏡臺(tái)然后采集圖像。（當(dāng)然也有通過(guò)改變焦平面位置的方法）光學(xué)切片

通過(guò)精細(xì)平面光切，形成生物樣品不同平面的精細(xì)圖象，將一個(gè)連續(xù)的光切圖象Z軸重疊就可形成一個(gè)完整的三維圖象6.整體結(jié)構(gòu)7.應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用范圍廣泛，主要在于生物領(lǐng)域，包括多種神經(jīng)解剖學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)的研究，廣泛的細(xì)胞和組織的形態(tài)學(xué)研究，共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)，干細(xì)胞研究，光漂白研究，熒光壽命成像，多光子顯微鏡，全內(nèi)反射，