鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)課件

鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)1鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)1鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測針對病原體本身的生長繁殖、生理生化特性的檢測：鼠疫菌的染色檢查；鼠疫菌的培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)；鼠疫菌的生化檢查、營養(yǎng)需求、毒素檢測、毒力測定等。針對病原體特異性抗原結(jié)構(gòu)的檢測：鼠疫F1抗原抗體檢測；鼠疫菌外膜蛋白的檢測。針對病原體遺傳基因的檢測：鼠疫菌的質(zhì)粒檢測；鼠疫菌特異性核酸片斷的檢測；鼠疫菌全基因組測定；插入序列的檢測。2鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測針對病原體本身的生長繁殖、生理生化特性的檢測：一、鼠疫菌菌體形態(tài)檢查典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長1~2μm，寬0.5~0.7μm,中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染的卵圓形小桿菌，有莢膜，無鞭毛，無芽胞。革蘭氏染色陰性。染疫動物或患者及其尸體的新鮮臟器制備的壓印片，可見到兩端鈍圓、兩極濃染的典型鼠疫菌。壓印標(biāo)本中可在吞噬細(xì)胞內(nèi)外見到鼠疫菌，對于鑒別雜菌污染材料極有價(jià)值。鼠疫菌染色方法有革蘭氏染色（菌體染成紅色）、美蘭染色（菌體染成蘭色，兩極濃染明顯）、姬姆薩染色（菌體染成色，莢膜染成色）3一、鼠疫菌菌體形態(tài)檢查典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長1~2μm鼠疫菌染色檢查(臟器壓印片)美蘭染色革蘭氏染色4鼠疫菌染色檢查(臟器壓印片)美蘭染色革蘭氏染色4鼠疫菌染色鼠疫菌涂片的革蘭氏染色5鼠疫菌染色鼠疫菌涂片的革蘭氏染色5鼠疫菌染色檢查Waysonstain(魏申氏染色)呈現(xiàn)的兩極濃染特征莢膜染色—墨汁負(fù)染色6鼠疫菌染色檢查Waysonstain(魏申氏染色)呈現(xiàn)的兩二、鼠疫菌的培養(yǎng)特性鼠疫菌是典型的異養(yǎng)菌。鼠疫菌為需氧菌，亦為兼性厭氧菌。鼠疫菌在普通培基上生長良好，培養(yǎng)的最適溫度為28℃，最適pH為6.9-7.1，發(fā)育初期的最適氧化還原電位（Eh）約為100~150mV，接種后至少20h以上才能形成肉眼可見的菌落，一般24~48h形成肉眼可見的小菌落。強(qiáng)毒鼠疫菌對鈣離子有半依賴性，缺乏時生長不良。37℃缺鈣條件下強(qiáng)毒鼠疫菌生長受限并釋放大量Yops,表現(xiàn)很強(qiáng)的表達(dá)和分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此現(xiàn)象稱為低鈣反應(yīng)，受70kb(45MD)質(zhì)粒上的遺傳基因控制。典型鼠疫菌培養(yǎng)18-20h光鏡下呈透明的碎玻璃片狀。培養(yǎng)24h以上菌落在透過光線下呈灰白色略帶淡青色，反射光線下菌落圓形隆起呈淡灰白色，鏡下見菌落中心發(fā)暗，有黃褐色粗糙顆粒，周邊圍繞一圈寬窄不等，邊緣不整呈鋸齒狀、薄而透明的花邊。7二、鼠疫菌的培養(yǎng)特性鼠疫菌是典型的異養(yǎng)菌。7鼠疫噬菌體試驗(yàn)在培基上密集平行劃線培養(yǎng)鼠疫菌，鼠疫噬菌體滴于上端劃線中部，直立平板，使噬菌體液垂直劃線自然流下，置20℃培養(yǎng)24h,有明顯的噬菌帶。在18~22℃鼠疫噬菌體只能裂解鼠疫菌而不裂解假結(jié)核菌，具有較強(qiáng)的專一性(噬菌作用具有種的特異性)，是鼠疫細(xì)菌學(xué)診斷中特異的鑒定方法之一。鼠疫噬菌體試驗(yàn)可快速診斷鼠疫菌。對被檢材料作細(xì)菌分離培養(yǎng)的同時作噬菌體裂解試驗(yàn)，20h左右即可獲得結(jié)果。分離到鼠疫噬菌體，可以間接判定檢材中存在鼠疫菌。8鼠疫噬菌體試驗(yàn)在培基上密集平行劃線培養(yǎng)鼠疫菌，鼠疫噬菌體滴于鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)典型鼠疫菌菌落形態(tài)噬菌帶9鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)典型鼠疫菌菌落形態(tài)噬菌帶9鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)鼠疫菌培養(yǎng)特征鼠疫噬菌體試驗(yàn)10鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)鼠疫菌培養(yǎng)特征鼠疫噬菌體試驗(yàn)10三、鼠疫F1抗原、抗體檢測鼠疫F1抗原檢測1.反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)4.免疫熒光技術(shù)(IFT)鼠疫F1抗體檢測1.間接血球凝集試驗(yàn)(IHA)2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)11三、鼠疫F1抗原、抗體檢測鼠疫F1抗原檢測鼠疫F1抗體檢測1間接紅血球凝集試驗(yàn)(IHA)鼠疫菌特異性F1抗原致敏經(jīng)單寧酸鞣化處理的醛化綿羊紅血球，制備成F1抗原致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗體。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定均為常規(guī)操作。IHA微量法結(jié)果：12間接紅血球凝集試驗(yàn)(IHA)鼠疫菌特異性F1抗原致敏經(jīng)單寧酸反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)用F1抗體致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗原。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定與IHA相同。RIHA微量法結(jié)果：13反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)用F1抗體致敏血球，檢查鼠疫特異酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測抗體.雙抗原夾心法：F1抗原包被反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本28℃反應(yīng)1.5h洗板，加入HRP-F1抗原28℃反應(yīng)1h洗板，加入底物OPD蔽光反應(yīng)30min后加終止液(2mol/L硫酸)。間接法：已知F1抗原包被反應(yīng)板，加標(biāo)本37℃反應(yīng)1h洗板，加入酶標(biāo)二抗37℃反應(yīng)1h洗板，加入底物(如OPD或TMB)蔽光反應(yīng)30min顯色后加終止液。用肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度值(A)測抗原雙單抗夾心法：F1-McAb包被反應(yīng)板，加入標(biāo)本28℃反應(yīng)1.5h洗板，加入HRP-F1McAb28℃反應(yīng)1h洗板，加入底物OPD蔽光反應(yīng)30min后加終止液。雙抗體夾心法(改良法-美國CDC鼠疫診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室操作手冊)：鼠疫免疫血清特異性抗體(F1Ab)包被反應(yīng)板，加標(biāo)本37℃反應(yīng)1h洗板，加小鼠F1McAb液37℃靜置1h洗板，加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG37℃反應(yīng)1h洗板,加底物OPD蔽光反應(yīng)30min顯色，加終止液。肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度值(A)14酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測抗體.測抗原14膠體金免疫層析法(GICA)檢測鼠疫菌特異性抗原、抗體的金標(biāo)技術(shù)以GICA廣泛用于實(shí)踐?；驹砭鶠閵A心法。雙抗體夾心法測抗原：固定于NC膜上的單抗(F1McAb)+標(biāo)本中待測抗原(F1Ag)+金標(biāo)記的另一株單抗(金標(biāo)-F1McAb)顯色。雙抗原夾心法測抗體：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(F1Ag)+標(biāo)本中待測抗體(F1Ab)+金標(biāo)記的F1抗原(金標(biāo)-F1Ag)顯色。夾心法測抗體：固定于膜上的鼠疫F1抗原＋標(biāo)本中的相應(yīng)抗體＋金標(biāo)記的SPA顯色。15膠體金免疫層析法(GICA)檢測鼠疫菌特異性抗原、抗體的金標(biāo)GICA雙抗體夾心法—測抗原G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(鼠型F1McAb)C區(qū)：羊抗小鼠IgT區(qū)：特異性單克隆抗體(F1McAb)吸水紙標(biāo)本16GICA雙抗體夾心法—測抗原G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(鼠型F1M免疫熒光技術(shù)(IFT)標(biāo)記物-熒光素(如異硫氰熒光素FITC)熒光素標(biāo)記抗體檢測相應(yīng)抗原-直接法：如FITC-FIMcAb為異硫氰酸熒光黃標(biāo)記鼠疫F1單克隆抗體。方法：固定好的玻片標(biāo)本用1%牛血清PBS浸洗5分鐘，流水沖洗。用FITC-FIMcAb適量（0.2ml）熒光染色，室溫作用30分鐘，流水沖洗。干燥，熒光顯微鏡油鏡觀察，鼠疫菌染上翠綠色熒光Yersiniapestis免疫熒光染色Fluorescenceantibodypositivityisseenasbright,intensegreenstainingaroundthebacterialcell17免疫熒光技術(shù)(IFT)標(biāo)記物-熒光素(如異硫氰熒光素FITC鼠疫菌特異性基因片斷檢測—PCR目標(biāo)基因：鼠疫菌的fra和pla特異性基因片段引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的長度目標(biāo)基因引物序列產(chǎn)物長度

fra1F5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’249bp1R5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’

pla2F5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’456bp2R5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’內(nèi)部對照：以鼠疫菌EV株DNA為模板，采用上述f1引物擴(kuò)增出fra基因249bp片段，再以16SrRNA基因引物：

F5’-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3’R5’-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3’擴(kuò)增出16SrRNA基因396bp片段加載體重組而成，產(chǎn)物長度645bp，使用了內(nèi)部對照，可有效的防止假陰性結(jié)果。應(yīng)用多重PCR方法來檢測鼠疫菌，所選取的擴(kuò)增區(qū)域都為鼠疫菌的特異區(qū)域，可有效地將鼠疫菌與其它細(xì)菌相鑒別，具有較高特異性。18鼠疫菌特異性基因片斷檢測—PCR目標(biāo)基因：鼠疫菌的fra和p鼠疫PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系(總量25μl)采用其它總量時，下列配方按比例改變。無菌去離子水13.5μl10×反應(yīng)緩沖液2.5μl4×dNTP混合物（每種2.5mM）2μl引物（1F、1R、2F、2R）各1μl內(nèi)部對照模板(IC)1μl待測標(biāo)本1μlTaqDNA聚合酶1μl19鼠疫PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系(總量25μl)采用其它總量鼠疫PCR反應(yīng)條件(擴(kuò)增)：預(yù)變性95℃5min，1個循環(huán)；然后95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；最后72℃5min。共1小時40分。電泳：反應(yīng)管中加溴酚藍(lán)指示劑5μl，混均短暫離心。膠體的每一孔中加入上述處理的反應(yīng)產(chǎn)物8μl，在80--100V(不超過5V/cm)電壓下TBE緩沖液中電泳約1小時。凝膠成像儀讀取結(jié)果并照相。20鼠疫PCR反應(yīng)條件(擴(kuò)增)：預(yù)變性95℃5min，1個循多重PCR擴(kuò)增結(jié)果鼠疫PCR

內(nèi)部對照質(zhì)粒與不同濃度EV菌PCR擴(kuò)增結(jié)果

鼠疫多重PCR

多重PCR擴(kuò)增結(jié)果21多重PCR擴(kuò)增結(jié)果鼠疫PCR鼠疫多重PCR21鼠疫菌質(zhì)粒檢測鼠疫菌的三個尋常質(zhì)粒：pPCP1—6Mda(9.5kb)編碼鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞漿素原活化因子；pCD1—45Mda(70kb)編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)的質(zhì)粒，即主要編碼低鈣反應(yīng)并表達(dá)LrcV及一系列耶爾森菌特有的Yops；pMT1—65Mda(100kb)編碼F1抗原和鼠毒素。91001全基因組測序新發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒：pCRY—長度21742bp，具有獨(dú)立復(fù)制能力，有一群編碼Ⅳ型分泌系統(tǒng)的基因。質(zhì)粒DNA提取---堿裂解法和熱裂解法質(zhì)粒電泳分析22鼠疫菌質(zhì)粒檢測鼠疫菌的三個尋常質(zhì)粒：pPCP1—6Mda鼠疫菌研究進(jìn)展傳統(tǒng)的病原體分類(classification)和鑒定(identification)方法:病原體的形態(tài)特征生長特征(培養(yǎng)特性)血清學(xué)反應(yīng)生化特征基因分類(Genotyping)和鑒定方法:多是基于PCR和核酸凝膠電泳技術(shù)，通過電泳條帶模式比較分析，揭示基因組成間差異。AFLP－擴(kuò)增片段長度多態(tài)性RFLP－限制性片段長度多態(tài)性PFGE－脈沖電場凝膠電脈RAPD－隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNARepPCR－基因組重復(fù)序列PCR技術(shù)SouthernBlotting－核酸探針雜交技術(shù)(核酸印跡試驗(yàn))ARDRA－擴(kuò)增的rDNA限制酶切分析技術(shù)DNA序列分析和全細(xì)菌可溶性蛋白質(zhì)電泳技術(shù)等；生物芯片技術(shù)。鼠疫菌全基因組學(xué)與鼠疫菌微進(jìn)化23鼠疫菌研究進(jìn)展傳統(tǒng)的病原體分類(classification謝謝！24謝謝！242525鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)26鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)1鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測針對病原體本身的生長繁殖、生理生化特性的檢測：鼠疫菌的染色檢查；鼠疫菌的培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)；鼠疫菌的生化檢查、營養(yǎng)需求、毒素檢測、毒力測定等。針對病原體特異性抗原結(jié)構(gòu)的檢測：鼠疫F1抗原抗體檢測；鼠疫菌外膜蛋白的檢測。針對病原體遺傳基因的檢測：鼠疫菌的質(zhì)粒檢測；鼠疫菌特異性核酸片斷的檢測；鼠疫菌全基因組測定；插入序列的檢測。27鼠疫實(shí)驗(yàn)室檢測針對病原體本身的生長繁殖、生理生化特性的檢測：一、鼠疫菌菌體形態(tài)檢查典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長1~2μm，寬0.5~0.7μm,中段膨大，兩端鈍圓，且兩極濃染的卵圓形小桿菌，有莢膜，無鞭毛，無芽胞。革蘭氏染色陰性。染疫動物或患者及其尸體的新鮮臟器制備的壓印片，可見到兩端鈍圓、兩極濃染的典型鼠疫菌。壓印標(biāo)本中可在吞噬細(xì)胞內(nèi)外見到鼠疫菌，對于鑒別雜菌污染材料極有價(jià)值。鼠疫菌染色方法有革蘭氏染色（菌體染成紅色）、美蘭染色（菌體染成蘭色，兩極濃染明顯）、姬姆薩染色（菌體染成色，莢膜染成色）28一、鼠疫菌菌體形態(tài)檢查典型的鼠疫菌呈短而粗，菌體長1~2μm鼠疫菌染色檢查(臟器壓印片)美蘭染色革蘭氏染色29鼠疫菌染色檢查(臟器壓印片)美蘭染色革蘭氏染色4鼠疫菌染色鼠疫菌涂片的革蘭氏染色30鼠疫菌染色鼠疫菌涂片的革蘭氏染色5鼠疫菌染色檢查Waysonstain(魏申氏染色)呈現(xiàn)的兩極濃染特征莢膜染色—墨汁負(fù)染色31鼠疫菌染色檢查Waysonstain(魏申氏染色)呈現(xiàn)的兩二、鼠疫菌的培養(yǎng)特性鼠疫菌是典型的異養(yǎng)菌。鼠疫菌為需氧菌，亦為兼性厭氧菌。鼠疫菌在普通培基上生長良好，培養(yǎng)的最適溫度為28℃，最適pH為6.9-7.1，發(fā)育初期的最適氧化還原電位（Eh）約為100~150mV，接種后至少20h以上才能形成肉眼可見的菌落，一般24~48h形成肉眼可見的小菌落。強(qiáng)毒鼠疫菌對鈣離子有半依賴性，缺乏時生長不良。37℃缺鈣條件下強(qiáng)毒鼠疫菌生長受限并釋放大量Yops,表現(xiàn)很強(qiáng)的表達(dá)和分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此現(xiàn)象稱為低鈣反應(yīng)，受70kb(45MD)質(zhì)粒上的遺傳基因控制。典型鼠疫菌培養(yǎng)18-20h光鏡下呈透明的碎玻璃片狀。培養(yǎng)24h以上菌落在透過光線下呈灰白色略帶淡青色，反射光線下菌落圓形隆起呈淡灰白色，鏡下見菌落中心發(fā)暗，有黃褐色粗糙顆粒，周邊圍繞一圈寬窄不等，邊緣不整呈鋸齒狀、薄而透明的花邊。32二、鼠疫菌的培養(yǎng)特性鼠疫菌是典型的異養(yǎng)菌。7鼠疫噬菌體試驗(yàn)在培基上密集平行劃線培養(yǎng)鼠疫菌，鼠疫噬菌體滴于上端劃線中部，直立平板，使噬菌體液垂直劃線自然流下，置20℃培養(yǎng)24h,有明顯的噬菌帶。在18~22℃鼠疫噬菌體只能裂解鼠疫菌而不裂解假結(jié)核菌，具有較強(qiáng)的專一性(噬菌作用具有種的特異性)，是鼠疫細(xì)菌學(xué)診斷中特異的鑒定方法之一。鼠疫噬菌體試驗(yàn)可快速診斷鼠疫菌。對被檢材料作細(xì)菌分離培養(yǎng)的同時作噬菌體裂解試驗(yàn)，20h左右即可獲得結(jié)果。分離到鼠疫噬菌體，可以間接判定檢材中存在鼠疫菌。33鼠疫噬菌體試驗(yàn)在培基上密集平行劃線培養(yǎng)鼠疫菌，鼠疫噬菌體滴于鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)典型鼠疫菌菌落形態(tài)噬菌帶34鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)典型鼠疫菌菌落形態(tài)噬菌帶9鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)鼠疫菌培養(yǎng)特征鼠疫噬菌體試驗(yàn)35鼠疫菌培養(yǎng)及鼠疫噬菌體試驗(yàn)鼠疫菌培養(yǎng)特征鼠疫噬菌體試驗(yàn)10三、鼠疫F1抗原、抗體檢測鼠疫F1抗原檢測1.反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)4.免疫熒光技術(shù)(IFT)鼠疫F1抗體檢測1.間接血球凝集試驗(yàn)(IHA)2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)3.膠體金免疫層析法(GICA)36三、鼠疫F1抗原、抗體檢測鼠疫F1抗原檢測鼠疫F1抗體檢測1間接紅血球凝集試驗(yàn)(IHA)鼠疫菌特異性F1抗原致敏經(jīng)單寧酸鞣化處理的醛化綿羊紅血球，制備成F1抗原致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗體。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定均為常規(guī)操作。IHA微量法結(jié)果：37間接紅血球凝集試驗(yàn)(IHA)鼠疫菌特異性F1抗原致敏經(jīng)單寧酸反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)用F1抗體致敏血球，檢查鼠疫特異性F1抗原。試驗(yàn)方法和結(jié)果判定與IHA相同。RIHA微量法結(jié)果：38反向血球凝集試驗(yàn)(RIHA)用F1抗體致敏血球，檢查鼠疫特異酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測抗體.雙抗原夾心法：F1抗原包被反應(yīng)板，加入待測標(biāo)本28℃反應(yīng)1.5h洗板，加入HRP-F1抗原28℃反應(yīng)1h洗板，加入底物OPD蔽光反應(yīng)30min后加終止液(2mol/L硫酸)。間接法：已知F1抗原包被反應(yīng)板，加標(biāo)本37℃反應(yīng)1h洗板，加入酶標(biāo)二抗37℃反應(yīng)1h洗板，加入底物(如OPD或TMB)蔽光反應(yīng)30min顯色后加終止液。用肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度值(A)測抗原雙單抗夾心法：F1-McAb包被反應(yīng)板，加入標(biāo)本28℃反應(yīng)1.5h洗板，加入HRP-F1McAb28℃反應(yīng)1h洗板，加入底物OPD蔽光反應(yīng)30min后加終止液。雙抗體夾心法(改良法-美國CDC鼠疫診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室操作手冊)：鼠疫免疫血清特異性抗體(F1Ab)包被反應(yīng)板，加標(biāo)本37℃反應(yīng)1h洗板，加小鼠F1McAb液37℃靜置1h洗板，加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG37℃反應(yīng)1h洗板,加底物OPD蔽光反應(yīng)30min顯色，加終止液。肉眼觀察結(jié)果并用酶標(biāo)儀檢測每孔的吸光度值(A)39酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測抗體.測抗原14膠體金免疫層析法(GICA)檢測鼠疫菌特異性抗原、抗體的金標(biāo)技術(shù)以GICA廣泛用于實(shí)踐。基本原理均為夾心法。雙抗體夾心法測抗原：固定于NC膜上的單抗(F1McAb)+標(biāo)本中待測抗原(F1Ag)+金標(biāo)記的另一株單抗(金標(biāo)-F1McAb)顯色。雙抗原夾心法測抗體：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(F1Ag)+標(biāo)本中待測抗體(F1Ab)+金標(biāo)記的F1抗原(金標(biāo)-F1Ag)顯色。夾心法測抗體：固定于膜上的鼠疫F1抗原＋標(biāo)本中的相應(yīng)抗體＋金標(biāo)記的SPA顯色。40膠體金免疫層析法(GICA)檢測鼠疫菌特異性抗原、抗體的金標(biāo)GICA雙抗體夾心法—測抗原G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(鼠型F1McAb)C區(qū)：羊抗小鼠IgT區(qū)：特異性單克隆抗體(F1McAb)吸水紙標(biāo)本41GICA雙抗體夾心法—測抗原G區(qū)：金標(biāo)特異性抗體(鼠型F1M免疫熒光技術(shù)(IFT)標(biāo)記物-熒光素(如異硫氰熒光素FITC)熒光素標(biāo)記抗體檢測相應(yīng)抗原-直接法：如FITC-FIMcAb為異硫氰酸熒光黃標(biāo)記鼠疫F1單克隆抗體。方法：固定好的玻片標(biāo)本用1%牛血清PBS浸洗5分鐘，流水沖洗。用FITC-FIMcAb適量（0.2ml）熒光染色，室溫作用30分鐘，流水沖洗。干燥，熒光顯微鏡油鏡觀察，鼠疫菌染上翠綠色熒光Yersiniapestis免疫熒光染色Fluorescenceantibodypositivityisseenasbright,intensegreenstainingaroundthebacterialcell42免疫熒光技術(shù)(IFT)標(biāo)記物-熒光素(如異硫氰熒光素FITC鼠疫菌特異性基因片斷檢測—PCR目標(biāo)基因：鼠疫菌的fra和pla特異性基因片段引物序列和擴(kuò)增產(chǎn)物的長度目標(biāo)基因引物序列產(chǎn)物長度

fra1F5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’249bp1R5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’

pla2F5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’456bp2R5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’內(nèi)部對照：以鼠疫菌EV株DNA為模板，采用上述f1引物擴(kuò)增出fra基因249bp片段，再以16SrRNA基因引物：

F5’-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3’R5’-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3’擴(kuò)增出16SrRNA基因396bp片段加載體重組而成，產(chǎn)物長度645bp，使用了內(nèi)部對照，可有效的防止假陰性結(jié)果。應(yīng)用多重PCR方法來檢測鼠疫菌，所選取的擴(kuò)增區(qū)域都為鼠疫菌的特異區(qū)域，可有效地將鼠疫菌與其它細(xì)菌相鑒別，具有較高特異性。43鼠疫菌特異性基因片斷檢測—PCR目標(biāo)基因：鼠疫菌的fra和p鼠疫PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系(總量25μl)采用其它總量時，下列配方按比例改變。無菌去離子水13.5μl10×反應(yīng)緩沖液2.5μl4×dNTP混合物（每種2.5mM）2μl引物（1F、1R、2F、2R）各1μl內(nèi)部對照模板(IC)1μl待測標(biāo)本1μlTaqDNA聚合酶1μl44鼠疫PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系(總量25μl)采用其它總量鼠疫PCR