大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件

實驗九,十大腸杄菌感受態(tài)細胞的制備和轉化實驗九,十1實驗原理1.概念感受態(tài)細胞在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內(nèi),但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個細胞到另個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌,需將對數(shù)生長期的細菌(受體細胞)經(jīng)理化方法處理后細胞膜的通透性發(fā)生暫時性改變,成為能允許外源DNA分子進入的細胞,稱感受態(tài)細胞。實驗原理2轉化轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。轉化3轉化過程轉化轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體,它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如物理制備法化學制備法等)的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenentcells)進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現(xiàn)遺傳信息的轉移,使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀將經(jīng)過轉化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細胞)轉化過程4常用的感受態(tài)細胞制備方法Kc法,caCl2法,電擊感受態(tài)制備等Rbc(Kc)法制備的感受態(tài)細胞轉化效率較高,但制備較復雜,不適合實驗室用電擊感受態(tài)細胞轉化效率高,操作簡便,但需電擊儀cac2法簡便易行,且其轉化效率完全可以滿足般實驗的要求,制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時,可加入占總體積15%的無菌甘油于-70℃以下保存半年,因此cac2法使用更為廣泛常用的感受態(tài)細胞制備方法5cac|2法制備感受態(tài)細胞原理cacl2法是以Mendel和Higa(1970)的發(fā)現(xiàn),其基本原理是:細胞處于0~4℃,caCl2低滲溶液中,大腸桿菌細胞膨脹成球狀。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面,經(jīng)42℃90秒熱激處理,促進細胞吸收DNA混合物。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫段時間,促使在轉化過程中獲得的新的表型,如卡那霉素耐藥基因得到表達,然后將此細菌培養(yǎng)物涂在含卡那霉素的選擇性培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)過即可獲得細菌菌落。cac|2法制備感受態(tài)細胞原理6提高轉化效率的幾個因素細胞生長狀態(tài)和密度質粒的質量和濃度試劑的質量>防止雜菌和雜DNA的污染提高轉化效率的幾個因素7提高轉化效率的幾個因素>細胞生長狀態(tài)和密度不要用經(jīng)過多次轉接或儲于4℃的培養(yǎng)菌,最好從70℃或20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好,可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600控制。DH5a菌株的ODo為0.5時,細胞密度在5×107個/m1左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。提高轉化效率的幾個因素8提高轉化效率的幾個因素質粒的質量和濃度:用于轉化的質粒DNA主要是超螺旋態(tài)DNA(CCCDNA)轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時轉化效率就會降低。1ng的CCCDNA即可使50μ的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%提高轉化效率的幾個因素9提高轉化效率的幾個因素試劑的質量所用的試劑如cacl2等均需是最高純度的,并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處防止雜菌和雜DNA的污染:整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入,為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。提高轉化效率的幾個因素10大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件11大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件12大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件13大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件14大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件15大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件16大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件17大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件18大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件19大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件20實驗九,十大腸杄菌感受態(tài)細胞的制備和轉化實驗九,十21實驗原理1.概念感受態(tài)細胞在自然條件下,很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內(nèi),但在人工構建的質粒載體中,一般缺乏此種轉移所必需的mob基因,因此不能自行完成從一個細胞到另個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌,需將對數(shù)生長期的細菌(受體細胞)經(jīng)理化方法處理后細胞膜的通透性發(fā)生暫時性改變,成為能允許外源DNA分子進入的細胞,稱感受態(tài)細胞。實驗原理22轉化轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。轉化23轉化過程轉化轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株,即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體,它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細胞經(jīng)過一些特殊方法(如物理制備法化學制備法等)的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞(Compenentcells)進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現(xiàn)遺傳信息的轉移,使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀將經(jīng)過轉化后的細胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng),即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細胞)轉化過程24常用的感受態(tài)細胞制備方法Kc法,caCl2法,電擊感受態(tài)制備等Rbc(Kc)法制備的感受態(tài)細胞轉化效率較高,但制備較復雜,不適合實驗室用電擊感受態(tài)細胞轉化效率高,操作簡便,但需電擊儀cac2法簡便易行,且其轉化效率完全可以滿足般實驗的要求,制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時,可加入占總體積15%的無菌甘油于-70℃以下保存半年,因此cac2法使用更為廣泛常用的感受態(tài)細胞制備方法25cac|2法制備感受態(tài)細胞原理cacl2法是以Mendel和Higa(1970)的發(fā)現(xiàn),其基本原理是:細胞處于0~4℃,caCl2低滲溶液中,大腸桿菌細胞膨脹成球狀。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面,經(jīng)42℃90秒熱激處理,促進細胞吸收DNA混合物。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫段時間,促使在轉化過程中獲得的新的表型,如卡那霉素耐藥基因得到表達,然后將此細菌培養(yǎng)物涂在含卡那霉素的選擇性培養(yǎng)基上,倒置培養(yǎng)過即可獲得細菌菌落。cac|2法制備感受態(tài)細胞原理26提高轉化效率的幾個因素細胞生長狀態(tài)和密度質粒的質量和濃度試劑的質量>防止雜菌和雜DNA的污染提高轉化效率的幾個因素27提高轉化效率的幾個因素>細胞生長狀態(tài)和密度不要用經(jīng)過多次轉接或儲于4℃的培養(yǎng)菌,最好從70℃或20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好,可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600控制。DH5a菌株的ODo為0.5時,細胞密度在5×107個/m1左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。提高轉化效率的幾個因素28提高轉化效率的幾個因素質粒的質量和濃度:用于轉化的質粒DNA主要是超螺旋態(tài)DNA(CCCDNA)轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時轉化效率就會降低。1ng的CCCDNA即可使50μ的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%提高轉化效率的幾個因素29提高轉化效率的幾個因素試劑的質量所用的試劑如cacl2等均需是最高純度的,并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處防止雜菌和雜DNA的污染:整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入,為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。提高轉化效率的幾個因素30大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉化報告課件31大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備