基因治療課件

基因治療（GeneTherapy）1編輯版ppt基因治療1編輯版ppt

根據(jù)臨床統(tǒng)計，25%的生理缺陷、30%的兒童死亡都是由遺傳疾病引起的。隨著分子生物學和分子遺傳學等學科的飛速發(fā)展，人們對于遺傳疾病的分子機理有了深入的了解，已經(jīng)知道人體基因的缺失、重復或突變，基因的異常表達等都會造成遺傳疾病。2編輯版ppt根據(jù)臨床統(tǒng)計，25%的生理缺陷、30%的兒童白化病3編輯版ppt白化病3編輯版ppt白化病4編輯版ppt白化病4編輯版ppt豁唇5編輯版ppt豁唇5編輯版ppt并指癥6編輯版ppt并指癥6編輯版ppt基因突變

鐮刀型貧血癥是一種異常血紅蛋白病。一旦缺氧，患者紅細胞變成長鐮刀型，血液的粘性增加，引起紅細胞的堆積，導致各器官血流的阻塞。而出現(xiàn)脾臟腫大，四肢的骨骼、關節(jié)疼痛，血尿和腎功能衰竭等癥狀，病重時，紅細胞受機械損傷而破裂產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，引起溶血性貧血甚至造成死亡。7編輯版ppt基因突變鐮刀型貧血癥是一種異常血紅蛋白病。一旦缺血紅蛋白四聚體8編輯版ppt血紅蛋白四聚體8編輯版ppt

由于每一個基因?qū)θ说恼９δ艿挠绊懚际菑碗s的，所以一種基因的變化可能會引起多種癥狀。例如，如果突變造成了某種酶活性的改變，既可能引起某種有毒底物的堆積，也可能造成某種正常細胞生活所必需的產(chǎn)物的缺乏。9編輯版ppt由于每一個基因?qū)θ说恼９δ艿挠绊懚际菑碗s的

多基因病

多基因病也與外界環(huán)境和心理因素有關，遺傳因素所占的程度稱之為遺傳度。如：哮喘病遺傳度為80％、精神分裂癥為80％、高血壓遺傳度為62％、冠心病遺傳度為65％、糖尿病遺傳度（幼年型）為75％、（老年型）為35％、唇裂＋腭裂遺傳度為76％10編輯版ppt

多基因病多基因病也與外界環(huán)境和心理因素第一節(jié)基因診斷11編輯版ppt第一節(jié)基因診斷11編輯版ppt

基因診斷

一、概念和特點概念：利用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學的技術方法，直接探測基因結構及其表達水平，從而對疾病作出診斷的方法。分為DNA診斷和RNA診斷兩類。

12編輯版ppt12編輯

分子診斷遺傳性疾病的診斷羊水和胎盤絨毛膜檢測13編輯版ppt分子診斷遺傳性疾病的診斷羊水和胎盤絨毛膜檢測13編輯版pp探針雜交分析法用途：用于診斷已知基因突變的疾病。探針：人工合成兩種寡核苷酸片段，長約 16－19個單核苷酸；其中一種是正常 的，另一種含有一個突變的單核苷酸。探針可用同位素、生物素、地高辛等標 記。樣本：血液或羊水細胞。14編輯版ppt探針雜交分析法用途：用于診斷已知基因突變的疾病。14編輯版p待測樣品（血細胞或羊水細胞）提取分離DNA限制性內(nèi)切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)膜，與探針雜交放射自顯影或顯色15編輯版ppt待測樣品（血細胞或羊水細胞）提取分離DNA限制性內(nèi)切酶酶切瓊特定載體上密集的大量探針與熒光標記的樣品雜交。根據(jù)雜交信號強弱判斷基因表達強度。16編輯版ppt特定載體上密集的大量探針與熒光標記16編輯版pptPCR為基礎的診斷技術PCR－單鏈構象多態(tài)性（PCR－SSCP）如果DNA分子中發(fā)生了突變，他的單鏈構象就會發(fā)生改變，與正常的DNA單鏈相比，電泳的遷移率不同，即使只有一個核苷酸的差異，也能在電泳中區(qū)分開來。17編輯版pptPCR為基礎的診斷技術PCR－單鏈構象多態(tài)性（PCR－SSCPCR-SSCP的應用檢測由于基因突變所引起的疾病如遺傳 病、腫瘤。18編輯版pptPCR-SSCP的應用18編輯版pptPCR－變性梯度凝膠電泳(Denaturinggradientgel

electrophoresis,DGGE)

雙鏈DNA相差一個堿基，可引起解鏈溫度的細微變化，在梯度變性的SDS中，遷移率不同，籍此檢測是否發(fā)生點突變。19編輯版pptPCR－變性梯度凝膠電泳19編輯版ppt×MstⅡ酶切位點（CCTGAGGAG）5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析20編輯版ppt×MstⅡ酶切位點（CCTGAGGAG）5′3′正?；?﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析21編輯版ppt+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮第二節(jié)基因治療的歷史與現(xiàn)狀1．基因治療概念隨著對遺傳疾病致病機理研究的深入，人們自然就想到如果能夠使變異基因和異常表達的基因變成正?；蚝驼１磉_基因，那么就可從根本上治愈遺傳疾病，這就是基因治療的基本思路。22編輯版ppt第二節(jié)基因治療的歷史與現(xiàn)狀22編輯版ppt基因治療的概念：向靶細胞或組織中引入外源DNA片段，以糾正或補償基因的缺陷，關閉或抑制異常表達的基因，從而達到治療的目的。23編輯版ppt基因治療的概念：向靶細胞或組織中引入外源DNA片段，以糾正或2．基因治療的歷史

20世紀80年代初期，美國的安德森博士首先闡明了基因治療的前景及其發(fā)展方向。

1984年，美國研究者Kohn等將載有腺苷脫氨酶（ADA）基因的病毒感染非靈長類動物，實驗表明，該基因在動物體內(nèi)的表達持續(xù)了數(shù)月。24編輯版ppt2．基因治療的歷史24編輯版ppt基因治療方式

基因補償：以正常基因校正或者替代缺陷和異常的基因RNA技術：封閉有害基因的表達自殺信號途徑：引發(fā)細胞調(diào)亡，治療癌癥共刺激途徑：刺激免疫系統(tǒng)25編輯版ppt基因治療方式

基因補償：以正常基因校正或者替代缺陷和異常的基1990年，美國批準了第一例臨床基因治療申請?；颊邽樗臍q女孩，由于缺失腺苷脫氨酶（ADA)基因而患有嚴重綜合性免疫缺陷癥，研究者（WilliamFrenchAnderson)將ada基因?qū)牖颊叩牧馨图毎?，然后將?jīng)過改造的淋巴細胞回輸?shù)交颊叩捏w內(nèi)，治療取得了成功。26編輯版ppt1990年，美國批準了第一例臨床基因治療申請。27編輯版ppt27編輯版ppt治療基本步驟:ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入患者淋巴細胞體外擴增回輸病人體內(nèi)淋巴細胞ADA酶恢復至正常水平的5%-10%

維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀28編輯版ppt治療基本步驟:ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體28編輯版ppt腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的

嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴細胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆積破壞免疫功能患兒很少活到成年第一個基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH)治療策略：淋巴細胞ADA酶恢復至正常水平的

5%-10%

維持免疫系統(tǒng)功能改善病人癥狀29編輯版ppt腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的

嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)病因AshantideSilva,Now13,wasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapy.重癥聯(lián)合免疫缺陷的基因治療腺苷脫氨酶基因治療(1990)30編輯版pptAshantideSilva,Now13,was31編輯版ppt31編輯版ppt32編輯版ppt32編輯版ppt

1991年美國科學家對50位黑色素瘤患者進行了基因治療，把外源的腫瘤壞死因子（TNF）基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而達到殺死腫瘤細胞的功能，研究也取得了成功。33編輯版ppt1991年美國科學家對50位黑色素瘤患者進行了

三、基因治療實例

經(jīng)過11年的不懈研究，密歇根大學醫(yī)學院的研究人員成功培育出了新的聽覺毛細胞，并且恢復了聾成年天竺鼠的聽力。這項研究是尋找治療人類耳聾新方法的一個重要步驟。34編輯版ppt三、基因治療實例經(jīng)過11年的不懈研究，密

研究人員將一種叫做Atoh1的基因插入到非感覺的上皮細胞中，這種細胞在成年的耳聾天竺鼠的內(nèi)耳中仍然存在。已經(jīng)知道Atoh1基因是聽覺毛細胞發(fā)育的一種關鍵調(diào)節(jié)因子。8周后，研究人員發(fā)現(xiàn)用Atoh1處理過的動物內(nèi)耳中形成了新的聽覺毛細胞。聽力測試表明受試動物開始恢復聽覺。35編輯版ppt研究人員將一種叫做Atoh1的基因插入到非感覺的Atoh1DirectstheFormationofSensoryMosaicsandInducesCellProliferationinthePostnatalMammalianCochleaInVivoMichaelC.Kelly,QingChang,AlexPan,XiLin1,,andPingChen36編輯版pptAtoh1DirectstheFormationof這項研究揭示了基因治療方法的潛力，但是同時也表現(xiàn)出了基因治療的有限性，產(chǎn)生的毛細胞可以像正常細胞那樣產(chǎn)生電信號，并且與神經(jīng)元聯(lián)系；然而當幼年小鼠使用基因治療后兩周，Atoh1基因的效應就會減弱。相關研究成果刊登在了5月9日的國際雜志JournalofNeuroscience上。37編輯版ppt這項研究揭示了基因治療方法的潛力，但是同時也表四川大學華西醫(yī)學中心研究人員采用反義核酸阻斷生物鐘基因表達的方法，對小鼠進行戒毒實驗，發(fā)現(xiàn)可以阻斷生物鐘基因參與調(diào)控的藥物成癮途徑，使藥物的心理成癮被克服。38編輯版ppt四川大學華西醫(yī)學中心研究人員采用反義核酸阻斷生物鐘基因第三節(jié)基因治療常用基因轉(zhuǎn)移的方法一.物理方法電穿透法：借助電流使DNA直接穿過細胞膜 轉(zhuǎn) 入細胞中。顯微注射法：直接將外源基因注射入細胞 中，這種方法的操作難度大，失敗率較高?；驑尫ǎ何⒓毜慕鸹蜴u等顆粒，表面吸附 DNA，在高壓作用下，進入細胞。39編輯版ppt第三節(jié)基因治療常用基因轉(zhuǎn)移的方法39編輯版ppt二.化學方法：用一定的方法將外源DNA分子包裹成大的沉淀物，然后與靶細胞混合；靶細胞通過內(nèi)吞作用攝入沉淀物，外源基因就被結合進核內(nèi)，與染色體整合，外源基因在靶細胞中得以表達。40編輯版ppt二.化學方法：40編輯版ppt三.生物學方法

常用的病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)

DNA病毒41編輯版ppt三.生物學方法41編輯版ppt病毒介導基因轉(zhuǎn)移（Viralmediatedtransfer）是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術與病毒重組，然后去感染受體細胞感染細胞重組病毒42編輯版ppt病毒介導基因轉(zhuǎn)移（Viralmediatedtrans1．逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）載體能穩(wěn)定地將DNA插到宿主基因組的隨機位點上。能高效地感染宿主細胞，感染率可達100%。逆轉(zhuǎn)錄病毒可以侵染不同的細胞類型。整合的病毒在宿主基因組中比較穩(wěn)定。逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的外源DNA序列可以達到10kb。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因治療載體的缺點是：整合在宿主的染色體上，有潛在的致癌性。43編輯版ppt43編輯版ppt2．腺病毒載體腺病毒是線狀雙鏈DNA病毒。是目前最常用的基因治療載體之一。它的優(yōu)點在于：腺病毒比較安全，無致病、致癌、致畸作用。腺病毒的宿主范圍較廣，能感染多種細胞，因此可用于多種細胞的基因治療。腺病毒可以在呼吸道和腸道中繁殖，因而不僅44編輯版ppt2．腺病毒載體44編輯版ppt可以通過靜脈注射的方式進行基因治療，還可以通過口服、噴霧、氣管內(nèi)滴注等簡單易行的方法進行基因治療。腺病毒可插入的外源基因可達7.5kb。人們對腺病毒的基因組構造非常了解，以它作為基因治療的載體比較容易控制。45編輯版ppt可以通過靜脈注射的方式進行基因治療，還可以通過口服、噴霧、氣腺病毒作為基因載體也存在某些缺點：

①重組的病毒DNA是以游離的形式存在于細胞中，因而基因表達的時間較短，不能滿足基因長期表達的需要；如需進行長期表達，必須反復注射，這無疑會加重患者的痛苦和經(jīng)濟負擔。

②重組腺病毒載體的反復使用，有可能會誘發(fā)機體的免疫反應，從而影響外源基因的表達，并進而影響治療效果。46編輯版ppt腺病毒作為基因載體也存在某些缺點：46編輯版ppt3．單純皰疹病毒（HSV）載體單純皰疹病毒（HSV）屬于雙鏈DNA病毒。作為基因治療的載體有以下特點：單純皰疹病毒可容納高達50kb的外源基因。單純皰疹病毒的宿主范圍廣泛，可以侵染脊椎 動物的各種細胞。47編輯版ppt3．單純皰疹病毒（HSV）載體47編輯版ppt單純皰疹病毒具有嗜神經(jīng)性，可以用于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療，如帕金森氏綜合癥、老年癡呆癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療。單純皰疹病毒載體是目前唯一可以將外源基因?qū)肷窠?jīng)系統(tǒng)的載體。缺點：單純皰疹病毒的某些蛋白對宿主細胞有毒害作用。48編輯版ppt單純皰疹病毒具有嗜神經(jīng)性，可以用于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療4.腺相關病毒載體是單鏈線狀DNA載體。目前認為是不會引起人類疾病的病毒。宿主范圍廣，可感染分裂或非分裂細胞。可整合到宿主細胞的染色體上，且位置相對 固定，減少插入突變的可能性。缺點：容量小，不能超過5Kb。 包裝效率低。49編輯版ppt4.腺相關病毒載體49編輯版ppt5.嵌合病毒載體用基因重組技術把兩種或兩種以上的病毒載體序列組合，取長補短50編輯版ppt5.嵌合病毒載體50編輯版ppt5、反義核酸基因治療反義技術：是指利用人工合成的反義RNA或DNA導入靶細胞，阻斷Gene的轉(zhuǎn)錄或復制，控制細胞的中間階段使編碼蛋白的Gene不能轉(zhuǎn)錄為mRNA或阻斷翻譯相應蛋白.51編輯版ppt5、反義核酸基因治療51編輯版ppt反義基因治療DNADNA

RNARNA

反義RNA

阻斷表達

52編輯版ppt反義基因治療DNA

有研究表明,一項試驗性治療黃斑病變的方法(即運用小RNA干擾技術來延緩中心區(qū)黃斑病變程度)可能引發(fā)一些病人失明,這種退行性病變主要發(fā)生于50歲以上的人群.某公司的臨床研究曾經(jīng)掩蓋了人們對小RNA治療弊大于利的擔憂.加利福尼亞大學的研究人員指出:“會不會治療一種病變的同時,誘發(fā)另一種病變.”53編輯版ppt有研究表明,一項試驗性治療黃斑病變的方法

體內(nèi)本身的小RNA可以通過關閉或沉默某些基因的表達來調(diào)節(jié)細胞功能。來自邁阿密的OPKOHealth和加州歐文的Allergan兩家公司的研發(fā)人員檢測了小RNA的確可以減輕黃斑病變區(qū)的炎癥;他們通過將小RNA注入病變區(qū)來抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達,進而抑制炎癥加重.54編輯版ppt體內(nèi)本身的小RNA可以通過關閉或沉默某些

張康的研究小組比較了600例視網(wǎng)膜萎縮和非萎縮病人之間TLR3的差異.發(fā)現(xiàn)TLR3某些突變可以保護病人免受進一步的炎癥性萎縮。攜帶保護型突變TLR3的病人比正常基因型的病人罹患視網(wǎng)膜萎縮的危險低得多,程度取決于攜帶突變的比例.而相比之下,攜帶非保護型突變的病人則更容易被小RNA誘發(fā)出萎縮。55編輯版ppt張康的研究小組比較了600例視網(wǎng)膜萎縮

這些實驗結果進一步提升了對實例研究的關注.科學家擔心,“這種小RNA注射可能直接激活TLR3,尤其對于非突變型病例負效應會更明顯,也就是說我們非但不能治療病變,反而引發(fā)了另外一些形式的異?！?56編輯版ppt這些實驗結果進一步提升了對實例研究的關第四節(jié)基因治療的靶細胞基因治療的靶細胞可分為兩大類：體細胞和生殖細胞。將遺傳物質(zhì)引入人的體細胞進行基因治療的方法為體細胞基因療法（somaticcellgenetherapy）；以生殖細胞為對象的基因治療稱為生殖細胞基因療法（germcellgenetherapy）。57編輯版ppt第四節(jié)基因治療的靶細胞57編輯版ppt

進行生殖細胞基因治療能使生殖細胞中的缺陷基因得到校正，使遺傳疾病不但能在當代得到治療，而且還能將校正的基因傳給下一代，最終根治遺傳疾病。58編輯版ppt進行生殖細胞基因治療能使生殖細胞中的缺陷基因得常用的靶細胞造血干細胞成纖維細胞肝細胞肌細胞淋巴細胞59編輯版ppt常用的靶細胞造血干細胞59編輯版ppt1.造血干細胞優(yōu)點①對骨髓造血干細胞的了解、應用較多②骨髓造血干細胞具有分裂、分化成各種 血細胞的潛能③基因產(chǎn)物在骨髓細胞成熟后，可以通過 血液循環(huán)遍布全身缺點骨髓造血干細胞數(shù)量少，僅占0.1％。60編輯版ppt1.造血干細胞60編輯版ppt應用舉例

1.人β－珠蛋白基因轉(zhuǎn)入小鼠骨髓干細胞，再輸入小鼠體內(nèi)，可在骨髓、脾臟和血液檢測到人β－珠蛋白。2.將腺苷脫氨酶（ADA)基因?qū)胄∈笤煅杉毎谛∈篌w內(nèi)長時間表達。61編輯版ppt應用舉例61編輯版ppt2.成纖維細胞

優(yōu)點：①取材容易；培養(yǎng)技術成熟；

②外源基因易進入，穩(wěn)定表達；外 源蛋白可隨血液供各種細胞使用。例：將細胞因子基因（白細胞介素－12、 或白細胞介素－2）重組成逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體轉(zhuǎn)入成纖維細胞，用于治療腫瘤 患者。62編輯版ppt2.成纖維細胞62編輯版ppt第五節(jié)基因治療的應用一.遺傳病的基因治療目前限于某些單基因遺傳病。將外源的野生型基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，表達出相應的產(chǎn)物，達到治療的目的。如：嚴重聯(lián)合免疫缺陷腺苷脫氨酶 鐮狀細胞貧血 β－珠蛋白 血友病A和B 因子Ⅷ和Ⅸ63編輯版ppt第五節(jié)基因治療的應用63編輯版ppt二惡性腫瘤的基因治療細胞因子導入療法自殺基因療法腫瘤抑制基因療法64編輯版ppt二惡性腫瘤的基因治療64編輯版ppt基因治療領域目前存在的問題

1.目前已知的有治療價值的基因太少?；蛑委熓菍胪庠椿蛞赃_到治療目的的新方法。比如針對惡性腫瘤的基因治療，能抑制腫瘤生長的基因所知不多；遺傳病中多基因疾病的基因尚不清楚，因此難以達到治療目的。65編輯版ppt基因治療領域目前存在的問題65編輯版ppt2.設計定向整合的載體：目前導入基因的方法不理想?；蛑委煹幕?qū)敕椒ㄒ笫歉咝?，而且能定向地導入體內(nèi)某種細胞?，F(xiàn)有方法效率較低，定向性差。因此，即使導入的基因有治療效果，但由于導入數(shù)量有限，效果也有限。66編輯版ppt2.設計定向整合的載體：66編輯版ppt3.如何高效持續(xù)表達外源基因外源基因現(xiàn)有的表達量還太低，如血友病B的基因治療，凝血因子9的表達量只有正常人的5％，若能達到10％，則治療效果會大大提高。67編輯版ppt3.如何高效持續(xù)表達外源基因67編輯版ppt4.導入的基因缺乏可控性如要導入一個胰島素基因并在體內(nèi)分泌胰島素依目前的技術是可以做到的，但是若導入的胰島素基因表達分泌胰島素而不受機體內(nèi)血糖濃度的調(diào)控，將會造成嚴重后果。因此，需解決如何對導入基因的表達實現(xiàn)可控調(diào)節(jié)。68編輯版ppt4.導入的基因缺乏可控性68編輯版ppt基因治療的風險

36歲的喬妮·莫爾患有風濕性關節(jié)炎，2007年2月26日第一次接受基因治療，7月2日，接受了第二次基因治療，第二天喬妮感覺周身不適，體溫上升到38.50Ｃ，后上升到400Ｃ，出現(xiàn)嚴重感染癥狀，雖經(jīng)全力搶救，但最終未能挽回喬妮的生命，7月24日，喬妮因全身廣泛性出血和肝衰竭而死亡。69編輯版ppt基因治療的風險36歲的喬妮·莫爾患有風濕性關節(jié)炎，2070編輯版ppt70編輯版ppt71編輯版ppt71編輯版ppt進行基因治療使用的是西雅圖的目標遺傳公司（TargetedGeneticsCorp)研發(fā)的一種制劑，稱為tgAAC94,載體為腺相關病毒，攜帶一種編碼TNF抑制蛋白的基因。迄今尚未確定導致死亡的原因。72編輯版ppt進行基因治療使用的是西雅圖的目標遺傳公司（Target喬妮不是第一位死于基因療法的病人。1999年9月，美國亞利桑那州高中學生蓋辛格因患鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(OTC)部分缺陷癥到賓夕法尼亞大學接受基因治療而死亡。FDA的調(diào)查稱，患者因免疫系統(tǒng)對介導外源性基因的病毒載體起嚴重反應而死亡。也許蓋辛格之死與喬妮之死有很大的相似性。73編輯版ppt喬妮不是第一位死于基因療法的病人。1999年9月，美國喬妮之死涉及基因療法的基本倫理——最后安全原則。基因療法現(xiàn)在還不成熟，因此不是無法治療的疾病，如癌癥、艾滋病等，是不宜用基因療法來試驗的。但是，對風濕性關節(jié)炎的基因療法試驗卻違背了這個原則。也許，研究人員的步子邁得大了些，心情急迫了些。這是第一次在并非威脅生命的疾病中出現(xiàn)病人死亡。74編輯版ppt喬妮之死涉及基因療法的基本倫理——最后安全原則?；虔煼ǖ牵瑔棠莸乃劳霰澈筮€有不可低估的商業(yè)因素。風濕性關節(jié)炎是一種慢性病，也是常見病，有著廣泛的市場。僅在美國每年就有30億美元用于該病的治療，于是TGC瞄準這個市場開發(fā)出tgAAC94，并希望及早推向市場。75編輯版ppt但是，喬妮的死亡背后還有不可低估的商業(yè)因素。風濕性關節(jié)另一方面，盡管有大量研究證明，用腺相關病毒作基因療法的載體是安全的，但早在2000年，NIH前主任瓦姆斯(Vamus)就透露，在美國共發(fā)生691例利用腺相關病毒進行基因治療試驗的嚴重事件，但向NIH報告的只有39例。76編輯版ppt另一方面，盡管有大量研究證明，用腺相關病毒作基因療法的基因治療（GeneTherapy）77編輯版ppt基因治療1編輯版ppt

根據(jù)臨床統(tǒng)計，25%的生理缺陷、30%的兒童死亡都是由遺傳疾病引起的。隨著分子生物學和分子遺傳學等學科的飛速發(fā)展，人們對于遺傳疾病的分子機理有了深入的了解，已經(jīng)知道人體基因的缺失、重復或突變，基因的異常表達等都會造成遺傳疾病。78編輯版ppt根據(jù)臨床統(tǒng)計，25%的生理缺陷、30%的兒童白化病79編輯版ppt白化病3編輯版ppt白化病80編輯版ppt白化病4編輯版ppt豁唇81編輯版ppt豁唇5編輯版ppt并指癥82編輯版ppt并指癥6編輯版ppt基因突變

鐮刀型貧血癥是一種異常血紅蛋白病。一旦缺氧，患者紅細胞變成長鐮刀型，血液的粘性增加，引起紅細胞的堆積，導致各器官血流的阻塞。而出現(xiàn)脾臟腫大，四肢的骨骼、關節(jié)疼痛，血尿和腎功能衰竭等癥狀，病重時，紅細胞受機械損傷而破裂產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，引起溶血性貧血甚至造成死亡。83編輯版ppt基因突變鐮刀型貧血癥是一種異常血紅蛋白病。一旦缺血紅蛋白四聚體84編輯版ppt血紅蛋白四聚體8編輯版ppt

由于每一個基因?qū)θ说恼９δ艿挠绊懚际菑碗s的，所以一種基因的變化可能會引起多種癥狀。例如，如果突變造成了某種酶活性的改變，既可能引起某種有毒底物的堆積，也可能造成某種正常細胞生活所必需的產(chǎn)物的缺乏。85編輯版ppt由于每一個基因?qū)θ说恼９δ艿挠绊懚际菑碗s的

多基因病

多基因病也與外界環(huán)境和心理因素有關，遺傳因素所占的程度稱之為遺傳度。如：哮喘病遺傳度為80％、精神分裂癥為80％、高血壓遺傳度為62％、冠心病遺傳度為65％、糖尿病遺傳度（幼年型）為75％、（老年型）為35％、唇裂＋腭裂遺傳度為76％86編輯版ppt

多基因病多基因病也與外界環(huán)境和心理因素第一節(jié)基因診斷87編輯版ppt第一節(jié)基因診斷11編輯版ppt

基因診斷

一、概念和特點概念：利用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學的技術方法，直接探測基因結構及其表達水平，從而對疾病作出診斷的方法。分為DNA診斷和RNA診斷兩類。

88編輯版ppt12編輯

分子診斷遺傳性疾病的診斷羊水和胎盤絨毛膜檢測89編輯版ppt分子診斷遺傳性疾病的診斷羊水和胎盤絨毛膜檢測13編輯版pp探針雜交分析法用途：用于診斷已知基因突變的疾病。探針：人工合成兩種寡核苷酸片段，長約 16－19個單核苷酸；其中一種是正常 的，另一種含有一個突變的單核苷酸。探針可用同位素、生物素、地高辛等標 記。樣本：血液或羊水細胞。90編輯版ppt探針雜交分析法用途：用于診斷已知基因突變的疾病。14編輯版p待測樣品（血細胞或羊水細胞）提取分離DNA限制性內(nèi)切酶酶切瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)膜，與探針雜交放射自顯影或顯色91編輯版ppt待測樣品（血細胞或羊水細胞）提取分離DNA限制性內(nèi)切酶酶切瓊特定載體上密集的大量探針與熒光標記的樣品雜交。根據(jù)雜交信號強弱判斷基因表達強度。92編輯版ppt特定載體上密集的大量探針與熒光標記16編輯版pptPCR為基礎的診斷技術PCR－單鏈構象多態(tài)性（PCR－SSCP）如果DNA分子中發(fā)生了突變，他的單鏈構象就會發(fā)生改變，與正常的DNA單鏈相比，電泳的遷移率不同，即使只有一個核苷酸的差異，也能在電泳中區(qū)分開來。93編輯版pptPCR為基礎的診斷技術PCR－單鏈構象多態(tài)性（PCR－SSCPCR-SSCP的應用檢測由于基因突變所引起的疾病如遺傳 病、腫瘤。94編輯版pptPCR-SSCP的應用18編輯版pptPCR－變性梯度凝膠電泳(Denaturinggradientgel

electrophoresis,DGGE)

雙鏈DNA相差一個堿基，可引起解鏈溫度的細微變化，在梯度變性的SDS中，遷移率不同，籍此檢測是否發(fā)生點突變。95編輯版pptPCR－變性梯度凝膠電泳19編輯版ppt×MstⅡ酶切位點（CCTGAGGAG）5′3′正常基因5′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析96編輯版ppt×MstⅡ酶切位點（CCTGAGGAG）5′3′正?；?﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析97編輯版ppt+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮第二節(jié)基因治療的歷史與現(xiàn)狀1．基因治療概念隨著對遺傳疾病致病機理研究的深入，人們自然就想到如果能夠使變異基因和異常表達的基因變成正?；蚝驼１磉_基因，那么就可從根本上治愈遺傳疾病，這就是基因治療的基本思路。98編輯版ppt第二節(jié)基因治療的歷史與現(xiàn)狀22編輯版ppt基因治療的概念：向靶細胞或組織中引入外源DNA片段，以糾正或補償基因的缺陷，關閉或抑制異常表達的基因，從而達到治療的目的。99編輯版ppt基因治療的概念：向靶細胞或組織中引入外源DNA片段，以糾正或2．基因治療的歷史

20世紀80年代初期，美國的安德森博士首先闡明了基因治療的前景及其發(fā)展方向。

1984年，美國研究者Kohn等將載有腺苷脫氨酶（ADA）基因的病毒感染非靈長類動物，實驗表明，該基因在動物體內(nèi)的表達持續(xù)了數(shù)月。100編輯版ppt2．基因治療的歷史24編輯版ppt基因治療方式

基因補償：以正?；蛐Ｕ蛘咛娲毕莺彤惓５幕騌NA技術：封閉有害基因的表達自殺信號途徑：引發(fā)細胞調(diào)亡，治療癌癥共刺激途徑：刺激免疫系統(tǒng)101編輯版ppt基因治療方式

基因補償：以正常基因校正或者替代缺陷和異常的基1990年，美國批準了第一例臨床基因治療申請。患者為四歲女孩，由于缺失腺苷脫氨酶（ADA)基因而患有嚴重綜合性免疫缺陷癥，研究者（WilliamFrenchAnderson)將ada基因?qū)牖颊叩牧馨图毎缓髮⒔?jīng)過改造的淋巴細胞回輸?shù)交颊叩捏w內(nèi)，治療取得了成功。102編輯版ppt1990年，美國批準了第一例臨床基因治療申請。103編輯版ppt27編輯版ppt治療基本步驟:ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導入患者淋巴細胞體外擴增回輸病人體內(nèi)淋巴細胞ADA酶恢復至正常水平的5%-10%

維持免疫系統(tǒng)功能,改善病人癥狀104編輯版ppt治療基本步驟:ADA基因+逆轉(zhuǎn)錄病毒載體28編輯版ppt腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的

嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴細胞缺乏ADA酶腺苷、dATP堆積破壞免疫功能患兒很少活到成年第一個基因臨床治療的方案(1990.9.14,NIH)治療策略：淋巴細胞ADA酶恢復至正常水平的

5%-10%

維持免疫系統(tǒng)功能改善病人癥狀105編輯版ppt腺苷脫氨酶(ADA)缺乏的

嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)病因AshantideSilva,Now13,wasthefirstpatienttobetreatedwithgenetherapy.重癥聯(lián)合免疫缺陷的基因治療腺苷脫氨酶基因治療(1990)106編輯版pptAshantideSilva,Now13,was107編輯版ppt31編輯版ppt108編輯版ppt32編輯版ppt

1991年美國科學家對50位黑色素瘤患者進行了基因治療，把外源的腫瘤壞死因子（TNF）基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，從而達到殺死腫瘤細胞的功能，研究也取得了成功。109編輯版ppt1991年美國科學家對50位黑色素瘤患者進行了

三、基因治療實例

經(jīng)過11年的不懈研究，密歇根大學醫(yī)學院的研究人員成功培育出了新的聽覺毛細胞，并且恢復了聾成年天竺鼠的聽力。這項研究是尋找治療人類耳聾新方法的一個重要步驟。110編輯版ppt三、基因治療實例經(jīng)過11年的不懈研究，密

研究人員將一種叫做Atoh1的基因插入到非感覺的上皮細胞中，這種細胞在成年的耳聾天竺鼠的內(nèi)耳中仍然存在。已經(jīng)知道Atoh1基因是聽覺毛細胞發(fā)育的一種關鍵調(diào)節(jié)因子。8周后，研究人員發(fā)現(xiàn)用Atoh1處理過的動物內(nèi)耳中形成了新的聽覺毛細胞。聽力測試表明受試動物開始恢復聽覺。111編輯版ppt研究人員將一種叫做Atoh1的基因插入到非感覺的Atoh1DirectstheFormationofSensoryMosaicsandInducesCellProliferationinthePostnatalMammalianCochleaInVivoMichaelC.Kelly,QingChang,AlexPan,XiLin1,,andPingChen112編輯版pptAtoh1DirectstheFormationof這項研究揭示了基因治療方法的潛力，但是同時也表現(xiàn)出了基因治療的有限性，產(chǎn)生的毛細胞可以像正常細胞那樣產(chǎn)生電信號，并且與神經(jīng)元聯(lián)系；然而當幼年小鼠使用基因治療后兩周，Atoh1基因的效應就會減弱。相關研究成果刊登在了5月9日的國際雜志JournalofNeuroscience上。113編輯版ppt這項研究揭示了基因治療方法的潛力，但是同時也表四川大學華西醫(yī)學中心研究人員采用反義核酸阻斷生物鐘基因表達的方法，對小鼠進行戒毒實驗，發(fā)現(xiàn)可以阻斷生物鐘基因參與調(diào)控的藥物成癮途徑，使藥物的心理成癮被克服。114編輯版ppt四川大學華西醫(yī)學中心研究人員采用反義核酸阻斷生物鐘基因第三節(jié)基因治療常用基因轉(zhuǎn)移的方法一.物理方法電穿透法：借助電流使DNA直接穿過細胞膜 轉(zhuǎn) 入細胞中。顯微注射法：直接將外源基因注射入細胞 中，這種方法的操作難度大，失敗率較高。基因槍法：微細的金或鎢等顆粒，表面吸附 DNA，在高壓作用下，進入細胞。115編輯版ppt第三節(jié)基因治療常用基因轉(zhuǎn)移的方法39編輯版ppt二.化學方法：用一定的方法將外源DNA分子包裹成大的沉淀物，然后與靶細胞混合；靶細胞通過內(nèi)吞作用攝入沉淀物，外源基因就被結合進核內(nèi)，與染色體整合，外源基因在靶細胞中得以表達。116編輯版ppt二.化學方法：40編輯版ppt三.生物學方法

常用的病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒(RNA)

DNA病毒117編輯版ppt三.生物學方法41編輯版ppt病毒介導基因轉(zhuǎn)移（Viralmediatedtransfer）是通過病毒為載體（vector），將外源基因通過重組技術與病毒重組，然后去感染受體細胞感染細胞重組病毒118編輯版ppt病毒介導基因轉(zhuǎn)移（Viralmediatedtrans1．逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）載體能穩(wěn)定地將DNA插到宿主基因組的隨機位點上。能高效地感染宿主細胞，感染率可達100%。逆轉(zhuǎn)錄病毒可以侵染不同的細胞類型。整合的病毒在宿主基因組中比較穩(wěn)定。逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝的外源DNA序列可以達到10kb。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因治療載體的缺點是：整合在宿主的染色體上，有潛在的致癌性。119編輯版ppt43編輯版ppt2．腺病毒載體腺病毒是線狀雙鏈DNA病毒。是目前最常用的基因治療載體之一。它的優(yōu)點在于：腺病毒比較安全，無致病、致癌、致畸作用。腺病毒的宿主范圍較廣，能感染多種細胞，因此可用于多種細胞的基因治療。腺病毒可以在呼吸道和腸道中繁殖，因而不僅120編輯版ppt2．腺病毒載體44編輯版ppt可以通過靜脈注射的方式進行基因治療，還可以通過口服、噴霧、氣管內(nèi)滴注等簡單易行的方法進行基因治療。腺病毒可插入的外源基因可達7.5kb。人們對腺病毒的基因組構造非常了解，以它作為基因治療的載體比較容易控制。121編輯版ppt可以通過靜脈注射的方式進行基因治療，還可以通過口服、噴霧、氣腺病毒作為基因載體也存在某些缺點：

①重組的病毒DNA是以游離的形式存在于細胞中，因而基因表達的時間較短，不能滿足基因長期表達的需要；如需進行長期表達，必須反復注射，這無疑會加重患者的痛苦和經(jīng)濟負擔。

②重組腺病毒載體的反復使用，有可能會誘發(fā)機體的免疫反應，從而影響外源基因的表達，并進而影響治療效果。122編輯版ppt腺病毒作為基因載體也存在某些缺點：46編輯版ppt3．單純皰疹病毒（HSV）載體單純皰疹病毒（HSV）屬于雙鏈DNA病毒。作為基因治療的載體有以下特點：單純皰疹病毒可容納高達50kb的外源基因。單純皰疹病毒的宿主范圍廣泛，可以侵染脊椎 動物的各種細胞。123編輯版ppt3．單純皰疹病毒（HSV）載體47編輯版ppt單純皰疹病毒具有嗜神經(jīng)性，可以用于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療，如帕金森氏綜合癥、老年癡呆癥等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療。單純皰疹病毒載體是目前唯一可以將外源基因?qū)肷窠?jīng)系統(tǒng)的載體。缺點：單純皰疹病毒的某些蛋白對宿主細胞有毒害作用。124編輯版ppt單純皰疹病毒具有嗜神經(jīng)性，可以用于一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的基因治療4.腺相關病毒載體是單鏈線狀DNA載體。目前認為是不會引起人類疾病的病毒。宿主范圍廣，可感染分裂或非分裂細胞?？烧系剿拗骷毎娜旧w上，且位置相對 固定，減少插入突變的可能性。缺點：容量小，不能超過5Kb。 包裝效率低。125編輯版ppt4.腺相關病毒載體49編輯版ppt5.嵌合病毒載體用基因重組技術把兩種或兩種以上的病毒載體序列組合，取長補短126編輯版ppt5.嵌合病毒載體50編輯版ppt5、反義核酸基因治療反義技術：是指利用人工合成的反義RNA或DNA導入靶細胞，阻斷Gene的轉(zhuǎn)錄或復制，控制細胞的中間階段使編碼蛋白的Gene不能轉(zhuǎn)錄為mRNA或阻斷翻譯相應蛋白.127編輯版ppt5、反義核酸基因治療51編輯版ppt反義基因治療DNADNA

RNARNA

反義RNA

阻斷表達

128編輯版ppt反義基因治療DNA

有研究表明,一項試驗性治療黃斑病變的方法(即運用小RNA干擾技術來延緩中心區(qū)黃斑病變程度)可能引發(fā)一些病人失明,這種退行性病變主要發(fā)生于50歲以上的人群.某公司的臨床研究曾經(jīng)掩蓋了人們對小RNA治療弊大于利的擔憂.加利福尼亞大學的研究人員指出:“會不會治療一種病變的同時,誘發(fā)另一種病變.”129編輯版ppt有研究表明,一項試驗性治療黃斑病變的方法

體內(nèi)本身的小RNA可以通過關閉或沉默某些基因的表達來調(diào)節(jié)細胞功能。來自邁阿密的OPKOHealth和加州歐文的Allergan兩家公司的研發(fā)人員檢測了小RNA的確可以減輕黃斑病變區(qū)的炎癥;他們通過將小RNA注入病變區(qū)來抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達,進而抑制炎癥加重.130編輯版ppt體內(nèi)本身的小RNA可以通過關閉或沉默某些

張康的研究小組比較了600例視網(wǎng)膜萎縮和非萎縮病人之間TLR3的差異.發(fā)現(xiàn)TLR3某些突變可以保護病人免受進一步的炎癥性萎縮。攜帶保護型突變TLR3的病人比正?；蛐偷牟∪祟净家暰W(wǎng)膜萎縮的危險低得多,程度取決于攜帶突變的比例.而相比之下,攜帶非保護型突變的病人則更容易被小RNA誘發(fā)出萎縮。131編輯版ppt張康的研究小組比較了600例視網(wǎng)膜萎縮

這些實驗結果進一步提升了對實例研究的關注.科學家擔心,“這種小RNA注射可能直接激活TLR3,尤其對于非突變型病例負效應會更明顯,也就是說我們非但不能治療病變,反而引發(fā)了另外一些形式的異常”.132編輯版ppt這些實驗結果進一步提升了對實例研究的關第四節(jié)基因治療的靶細胞基因治療的靶細胞可分為兩大類：體細胞和生殖細胞。將遺傳物質(zhì)引入人的體細胞進行基因治療的方法為體細胞基因療法（somaticcellgenetherapy）；以生殖細胞為對象的基因治療稱為生殖細胞基因療法（germcellgenetherapy）。133編輯版ppt第四節(jié)基因治療的靶細胞57編輯版ppt

進行生殖細胞基因治療能使生殖細胞中的缺陷基因得到校正，使遺傳疾病不但能在當代得到治療，而且還能將校正的基因傳給下一代，最終根治遺傳疾病。134編輯版ppt進行生殖細胞基因治療能使生殖細胞中的缺陷基因得常用的靶細胞造血干細胞成纖維細胞肝細胞肌細胞淋巴細胞135編輯版ppt常用的靶細胞造血干細胞59編輯版ppt1.造血干細胞優(yōu)點①對骨髓造血干細胞的了解、應用較多②骨髓造血干細胞具有分裂、分化成各種 血細胞的潛能③基因產(chǎn)物在骨髓細胞成熟后，可以通過 血液循環(huán)遍布全身缺點骨髓造血干細胞數(shù)量少，僅占0.1％。136編輯版ppt1.造血干細胞60編輯版ppt應用舉例

1.人β－珠蛋白基因轉(zhuǎn)入小鼠骨髓干細胞，再輸入小鼠體內(nèi)，可在骨髓、脾臟和血液檢測到人β－珠蛋白。2.將腺苷脫氨酶（ADA)基因?qū)胄∈笤煅杉毎?，在小鼠體內(nèi)長時間表達。137編輯版pp