蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)

2.6.2肽鏈?zhǔn)怯蟹较蛐缘?directional)肽鏈的一端有游離氨基，稱氨基末端（或N末端

N-terminal），另一端有游離羧基，稱羧基末端（或C末端C-terminal)；肽鏈寫法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“—”表示肽鍵。如：H2N－絲氨酰－亮氨酰－苯丙氨酸-COOH寫為：Ser-Leu-Phe（或S-L-F）前述五肽：絲氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸寫為：Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu（或S-G-Y-A-L）H2N--COOH第一頁，共五十一頁。肽鍵縮合第二頁，共五十一頁。2.6.3所有肽鏈的共價主鏈結(jié)構(gòu)都是相同的肽鏈中的骨架結(jié)構(gòu)是由單位重復(fù)連接而成，稱共價主鏈（mainchainorbackbone)；HH―N―C―C―OR不同肽鏈的區(qū)別在于側(cè)鏈R基的排列順序不同；相同的氨基酸組成可形成多種不同的多肽鏈第三頁，共五十一頁。問題1：每種肽鏈都有相同的分子骨架，試分析多肽分子骨架有哪些結(jié)構(gòu)特征？第四頁，共五十一頁。問題2：寫出這一肽鏈的結(jié)構(gòu)和名稱,這四種氨基酸還可以組成幾種寡肽？第五頁，共五十一頁。2.6.4肽鏈末端羧基、末端氨基及側(cè)鏈基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離，表現(xiàn)出重要的理化性質(zhì)在pH1～14范圍內(nèi)，主鏈上肽鍵氨基不發(fā)生解離，游離末端的-COOH和-NH2以及側(cè)鏈R上的基團(tuán)可發(fā)生不同程度的解離；各基團(tuán)解離程度及肽所帶的總電荷取決于所處溶液的pH值；對于指定的基團(tuán)，其pH＜pKa時，不發(fā)生酸式解離，pH＞pKa時，發(fā)生酸式解離，pH=pKa時，解離與不解離各占一半，由此可確定肽鏈所帶凈電荷.第六頁，共五十一頁。問題3：肽鏈中可解離基團(tuán)的（α-COOH，α-NH2及側(cè)鏈可解離基團(tuán)）pKa與游離氨基酸中對應(yīng)基團(tuán)的pKa值有何不同？為什么？問題4：叢肽鏈的組成與結(jié)構(gòu)分析多肽有哪些主要性質(zhì)？第七頁，共五十一頁。肽具有等電點，調(diào)節(jié)溶液pH值可改變肽的帶電狀況，使肽不帶電荷而處于等電狀態(tài)時的pH值為肽的等電點肽等電點的差別可不同程度反映其氨基酸組成上的差異；反之亦然。等電狀態(tài)時，肽在電場中不向任何一方移動不同大小的肽片斷可用雙向凝膠電泳進(jìn)行分離肽鏈中的解離基團(tuán)可被滴定，但肽的滴定曲線復(fù)雜短肽以離子晶體存在，具有較高的熔點肽鍵上的基團(tuán)具有相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)活性。第八頁，共五十一頁。2.6.5許多短肽具有重要的生物活性

——天然存在的活性肽作為神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)激素或神經(jīng)調(diào)節(jié)物；如LHRH-類10肽(蛙的一種神經(jīng)遞質(zhì))，促甲狀腺素釋放因子，腦啡肽，內(nèi)啡肽，強(qiáng)啡肽等作為抗體：短桿菌肽A，短桿菌肽S等；作為激素：胰島素、胰高血糖素、促腎上腺皮質(zhì)激素等；作為防御性毒物：劇毒的鵝膏蕈堿、蛇毒、蛛毒等第九頁，共五十一頁。體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽促甲狀腺素釋放激素TRF焦谷氨酸組氨酸脯氨酰胺第十頁，共五十一頁。谷胱甘肽（glutathione，GSH）谷氨酸半胱氨酸甘氨酸SHCOO-CH2CH2CCNH3HHOOCNHCHCH2CONHCH2OGSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+第十一頁，共五十一頁。L-天冬氨酰-L-苯丙氨酰甲酯，稱作：aspartame第十二頁，共五十一頁。2.7.1多肽與蛋白質(zhì)的概念不完全相同Thetermproteinbroadlydefinesmoleculescomposedofoneormorepolypeptidechains;Thetermpolypeptideisusedtodefinethechainexceedsseveraldozenaminoacidsinlength(lessthan50aminoacidresidues);Thetermspolypeptideandproteinareusedinterchangeablyindiscussingsinglepolypeptidechain.問題5：試簡述蛋白質(zhì)的重要生物學(xué)功能？2.7蛋白質(zhì)是由一條或幾條多肽鏈組成的具有特定空間結(jié)構(gòu)和功能的生物大分子第十三頁，共五十一頁。2.7.2根據(jù)蛋白質(zhì)的組成、或含多肽鏈數(shù)目或形狀可對蛋白質(zhì)進(jìn)行不同的分類單純蛋白質(zhì)(simpleprotein)結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)+非蛋白質(zhì)(輔基)(prostheticgroup)(conjugatedprotein)輔基種類很廣，常見的有色素化合物、寡糖、脂類、磷酸、金屬離子甚至核酸根據(jù)組成不同蛋白質(zhì)可分為第十四頁，共五十一頁。根據(jù)蛋白質(zhì)形狀可分為球狀蛋白與纖維狀蛋白：纖維狀蛋白質(zhì)(fibrousprotein)球狀蛋白質(zhì)(globularprotein)肌動蛋白毛發(fā)中的角蛋白蠶絲絲心蛋白第十五頁，共五十一頁。根據(jù)含多肽鏈數(shù)目可分為單體蛋白和多體蛋白寡聚蛋白(oligomericprotein)

或多體蛋白(multimericprotein)單體蛋白(monomericprotein)異型多體蛋白(heteromultimericprotein)同型多體蛋白(homomultimericprotein)寡聚蛋白中的每一個具三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈稱亞基(subunit)第十六頁，共五十一頁。應(yīng)用：由于膠體溶液中的蛋白質(zhì)不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去;2.8.1多數(shù)球狀蛋白質(zhì)溶于水形成膠體溶液蛋白質(zhì)溶膠性質(zhì)：a.質(zhì)點大小在膠體范圍：1～100nm

b.丁達(dá)爾效應(yīng)c.布朗運動d.不能透過半透膜2.8根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)特點可對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定第十七頁，共五十一頁。蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關(guān)。破壞蛋白質(zhì)膠體的穩(wěn)定因素，將促使蛋白質(zhì)沉淀析出第十八頁，共五十一頁。蛋白質(zhì)處于PI時，凈電荷為零。溶解度最低不同蛋白質(zhì)

↓等電點不同↓調(diào)節(jié)pH值將蛋白質(zhì)彼此分開等電點沉淀和pH控制:第十九頁，共五十一頁。隨著鹽濃度的升高，如飽和或半飽和時，蛋白質(zhì)溶解度逐漸降低，相互聚集而從水溶液中沉淀析出，這種現(xiàn)象叫鹽析。解釋：大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來的溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水。降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。常用的中性鹽：（NH4)2SO4特點：保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象——蛋白質(zhì)分離、提純常用方法。2.8.3加入大量中性鹽可使蛋白質(zhì)沉淀析出低濃度時，中性鹽可增加蛋白質(zhì)的溶解度，即鹽溶原因：蛋白質(zhì)分子吸附鹽類離子后，帶電層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，且與水分子相互作用加強(qiáng)；第二十頁，共五十一頁。2.8.4有機(jī)溶劑分級分離法：作用原理：

①有機(jī)溶劑的加入改變了介質(zhì)的介電常數(shù)，增加了兩個相反電荷之間的吸引力，蛋白質(zhì)的表面可離解基團(tuán)的離子化程度減弱，水化程度降低，蛋白質(zhì)分子聚集沉淀。②有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，致使蛋白質(zhì)聚集體形成并沉淀。第二十一頁，共五十一頁。2.8.5離子交換層析原理：樣品中各蛋白質(zhì)組分的凈電荷、分子大小不同，與固定相間的作用力不同而被分離洗脫方法：改變洗脫劑的鹽濃度、PH值依次洗脫結(jié)合力小的蛋白質(zhì)先由層析柱中洗脫出來分離效果與溶液中的離子強(qiáng)度、pH有關(guān)常用固定相：離子化纖維素――羧甲基纖維素（CM），二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素

優(yōu)點：具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，及較大的表面積，大分子可以自由通過

交換容量大,洗脫條件溫和,回收率高。離子化葡聚糖――交聯(lián)葡聚糖作基質(zhì)優(yōu)點：交換容量比離子交換纖維素大3－4倍。第二十二頁，共五十一頁。Cation-exchangecolumnpH=5.0時，基質(zhì)帶負(fù)電荷蛋白組分帶不同電荷逐漸提高洗脫液的pH值，各組分以此被洗脫下來問：洗脫順序？第二十三頁，共五十一頁。即分子排阻層析（也稱凝膠過濾層析，分子篩層析）2.8.6凝膠過濾：原理：凝膠顆粒內(nèi)部為多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)混合物流經(jīng)凝膠層析柱時，比凝膠網(wǎng)孔大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外。隨著溶劑在凝膠珠之間的孔隙向下移動并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠珠的內(nèi)外。不同分子大小路徑不同洗脫：大分子--先洗脫出來小分子--后洗脫出來第二十四頁，共五十一頁。第二十五頁，共五十一頁。2.8.7親和層析基礎(chǔ)：基于蛋白質(zhì)所具有的生物學(xué)特異性。（它與另一種稱配基的分子能特異而非共價的結(jié)合）蛋白質(zhì)樣品加入到連有配基的基質(zhì)中（固定相）↓目標(biāo)蛋白質(zhì)與配體結(jié)合，吸附在瓊質(zhì)糖顆粒上

↙↘

其它蛋白質(zhì)先被洗脫下來結(jié)合在基質(zhì)上的蛋白可用由配體溶液洗脫第二十六頁，共五十一頁。Affinitychromatography第二十七頁，共五十一頁。對某一種蛋白質(zhì)來說，在某一pH時，它所帶的正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即凈電荷為零，這一pH稱蛋白質(zhì)的等電點。pH＞pI時，蛋白質(zhì)帶凈負(fù)電荷，電場中移向正極pH＜pI時，蛋白質(zhì)帶凈正電荷，電場中移向負(fù)極pH=pI時，蛋白質(zhì)不帶靜電荷，電場中不移動。2.8.8利用蛋白質(zhì)的帶電性可對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)在(PAGE)介質(zhì)中電泳時，其遷移率第二十八頁，共五十一頁。聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入SDS和少量巰基乙醇SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：則電泳遷移率主要取決于其相對分子質(zhì)量(q/r），而與電荷和分子形狀無關(guān)。第二十九頁，共五十一頁。①SDS為陰離子，多肽鏈覆蓋上相同密度的負(fù)電荷超過蛋白質(zhì)原有的電荷量，因而掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別。因此，所有SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，電泳時均以同樣的電荷/分子質(zhì)量比向正極移動。②改變了蛋白質(zhì)單體分子的構(gòu)象。SDS-蛋白質(zhì)在水溶液中長橢圓棒，短軸直徑均為1.8nm,長軸長度則隨蛋白質(zhì)的分子量而成正比例地變化。③可用來測量蛋白質(zhì)的分子量第三十頁，共五十一頁。區(qū)帶電泳：外加電場時，蛋白質(zhì)混合物在具有pH梯度的介質(zhì)中移向并聚焦（停留）在等于其等電點的pH處，形成區(qū)帶。第三十一頁，共五十一頁。測定蛋白質(zhì)含量的常用方法：凱氏定氮法：紫外吸收法雙縮脲法：Folin-酚試劑法（Lowry法）：考馬斯亮藍(lán)法（現(xiàn)最常用的方法）：膠體金法：帶負(fù)電的疏水膠體，洋紅色，遇蛋白質(zhì)變藍(lán)色，靈敏度最高第三十二頁，共五十一頁。蛋白質(zhì)具有多個結(jié)構(gòu)層次：一級結(jié)構(gòu)——二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu)

——生物功能蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序——也稱共價結(jié)構(gòu)。共價肽鍵是一級結(jié)構(gòu)的唯一連接方式多肽鏈一級結(jié)構(gòu)決定著蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)和功能2.9蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定——即蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸序列的測定高級結(jié)構(gòu)第三十三頁，共五十一頁。測定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目；拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈；測定多肽鏈的氨基酸組成；分析多肽鏈的N末端和C末端（方法很多）斷裂多肽鏈內(nèi)的二硫鍵；多肽鏈斷裂成肽段；測定各個多肽段的氨基酸順序；確定肽段在多肽鏈中的次序；確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定策略第三十四頁，共五十一頁。測得相對分子質(zhì)量Mr

很多方法可用于確定蛋白質(zhì)的相對分子量，如：滲透壓、擴(kuò)散系數(shù)、沉降系數(shù)凝膠過濾、凝膠電泳等，測定末端氨基酸數(shù)xX÷(m/Mr)=n(蛋白質(zhì)分子中肽鏈數(shù)目)（m為樣品質(zhì)量）變性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高濃度鹽溶液如有二硫鍵交聯(lián)：巰基乙醇，或過氧乙酸處理凝膠過濾或電泳分離不同肽鏈蛋白質(zhì)中多肽鏈的拆分蛋白質(zhì)中多肽鏈數(shù)目的確定第三十五頁，共五十一頁。多肽鏈的拆分第三十六頁，共五十一頁。氨基酸組成分析酸水解：堿水解：甲基磺酸水解：優(yōu)點：不破壞色氨酸，經(jīng)堿中和后可直接上機(jī)自動分析缺點：不能有碳水化合物存在中和點不易掌握計算出各種氨基酸分子比多肽鏈分子量確定氨基酸組成第三十七頁，共五十一頁。末端氨基酸分析N末端氨基酸分析丹黃酰氯法(DNS)：優(yōu)點：可直接層析或電泳分離，熒光檢測定性定量；靈敏度高(較二硝基氟苯法高100倍)

二硝基氟苯(DNFBorFDNB)法氨肽酶法第三十八頁，共五十一頁。多肽—OC—CH—NH2+R+HCI弱堿性+DNS-氨基酸酸水解游離氨基酸有機(jī)溶劑萃取溶于水定量+定性確定N末端氨基酸確定肽鏈數(shù)目多肽—OC—CH—NH—RDNS-氨基酸第三十九頁，共五十一頁。將肽鏈裂解成小片斷要求：斷裂點較少，專一性較強(qiáng)、產(chǎn)率高酶裂解法：常用的酶：胰蛋白酶：僅斷裂Lys、Arg羧基形成的肽鍵（但）糜蛋白酶：位點：Tyr、Phe、Trp羧基肽鍵胃蛋白酶：位點：兩種疏水性氨基酸形成的肽鍵嗜熱菌蛋白酶：專一性較差金黃色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：梭狀芽孢桿菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：化學(xué)裂解法：溴化氰法：專一性斷裂蛋氨酸羧基形成的肽鍵第四十頁，共五十一頁。可得到合適大小的肽片斷第四十一頁，共五十一頁。Cyanogenbromide(溴化氰法）第四十二頁，共五十一頁。肽段氨基酸序列的測定Edman降解法：一次可連續(xù)測定60~70個氨基酸；程序復(fù)雜，工作量大；酶降解法：質(zhì)譜法：第四十三頁，共五十一頁。Edman降解法測定N-末端氨基酸EdmanreagentPTC-多肽少一個N-末端氨基酸的肽鏈層析色譜鑒定重復(fù)①②③與DNS法聯(lián)合①②③第四十四頁，共五十一頁。肽片斷在多肽鏈中排列次序的確定(見p179)第四十五頁，共五十一頁。多肽鏈中二硫鍵位置的確定第四十六頁，共五十一頁。多肽鏈氨基酸系列的直接測定：